AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用

摘要

本发明提供一种AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为滤泡性T辅助细胞(Tfh)中的应用。直接将AIM2蛋白或AIM2过表达质粒转入CD4+T细胞，尤其是研究表达人AIM2基因序列的过表达质粒对Tfh细胞分化及功能的影响。将该质粒转染到人CD4+T细胞，并同时诱导分化成为Tfh细胞,通过与转染空质粒后的诱导分化形成的Tfh细胞比较，反映出其对Tfh诱导分化及功能的影响。为进一步研究AIM2及Tfh细胞生理功能及临床意义提供依据。

权利要求

1.AIM2蛋白在诱导分化CD4 + T细胞转化为Tfh细胞中的应用，具体是将表达AIM2的质粒转入CD4 + T细胞，用于研究AIM2蛋白在诱导分化T细胞转化为Tfh细胞过程中的作用机理，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括： STAT3、C-MAF、BCL-6，所述的应用为体外应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，AIM2蛋白和CD4 + T细胞均来源于人。

3. 表达AIM2的质粒在制备诱导分化CD4 + T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括： STAT3、C-MAF、BCL-

6。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，AIM2蛋白和CD4 + T细胞均来源于人。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的表达AIM2的质粒是将AIM2的mRNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模版扩增AIM2基因片段；基因片段插入到载体获得。

说明书

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AIM2在诱导分化CD4 T细胞转化为Tfh细胞中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用。

背景技术

[0002] Tfh细胞作为新近发现的CD4+T辅助细胞亚群，由于其对B细胞成熟和免疫球蛋白(Ig)的分泌有重要辅助作用以及其在SLE(系统性红斑狼疮)中的表达比例异常，让人们确信其在病理性自身抗体的分泌中具有重要意义。Tfh细胞通过促进生发中心(GC)的形成、抗体亲和力的成熟、以及记忆型B细胞和胞浆细胞的生成，来辅助B细胞。在人体研究中发现hi hi hiSLE病人外周血中循环 CXCR5 PD-1 ICOS T细胞(cTfh细胞)的比例升高，并且与疾病严重程度成正相关，而在经过类固醇治疗后Tfh细胞的比例下降。正常状态下，人体外周血及淋巴器官中的Tfh细胞比例较低，且分离困难，因此建立体外有效的Tfh细胞分化培养就显得尤为关键。

[0003] AIM2是炎症小体HIN200家族蛋白中的一员。在之前研究报道中，AIM2是一种炎症小体的组成部分，在免疫细胞中(例如巨噬细胞和树突状细胞)发现，AIM2 的C末端的A200是细胞内DNA感受器，感受细菌或病毒感染时释放到细胞胞浆中的dsDNA,而AIM2的N末端的PYD结构域与ASC结合形成AIM2-炎症小体。该炎症小体能参与caspase-1的活化过程，进而在免疫活动中促进细胞因子前体 pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，同时它还能参与caspase-1依赖的细胞程序式凋亡，因此认为AIM2有免疫感应和炎性体激活功能。研究发现AIM2在不同的细胞类型中其表达和功能不同。在肿瘤细胞中发现，AIM2的作用并不依赖于炎症小体，其行使类似于抑癌基因的作用。在肿瘤细胞中将其敲除，将促进肿瘤的发生发展。而在CD4+T细胞，特别是滤泡性辅助T细胞(Tfh细胞)中，我们首次发现其表达尤其明显。

发明内容

[0004] 本发明的首要目的是提供AIM2蛋白在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用。用于研究AIM2在诱导分化CD4+ T细胞转化为Tfh细胞过程中的作用机理。进而研究AIM2对Tfh细胞分化及功能的影响。

[0005] 本发明的研究对象AIM2蛋白和CD4+ T细胞均来源于人，但不仅限于人。

[0006] 上述应用可以直接将AIM2蛋白加入CD4+ T细胞用于将其转化为Tfh细胞，或者将表达AIM2的质粒转入CD4+ T细胞用于将其转化为Tfh细胞。

[0007] 本发明的第二个目的是提供AIM2蛋白在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh 细胞制剂中的应用。

[0008] 本发明的第三个目的是提供表达AIM2的质粒在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用。AIM2的DNA序列见序列表SEQ NO.1所示。

[0009] 本发明所述的表达AIM2的质粒是将AIM2的mRNA逆转录为cDNA，并以cDNA 为模版扩增AIM2基因片段；基因片段插入到载体获得。

[0010] 本发明以pcDNA3.1(+)(购于金斯瑞生物科技公司)为例，酶切位点为 NheI//HindIII，成功将制备的载体转入T细胞，将其应用于诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞。但本发明不限于使用载体pcDNA3.1(+)，还包括其他能够在CD4+T细胞中表达AIM2基因的载体。具体过程如下：

[0011] 取正常人外周血，密度梯度离心法无菌分离PBMC，采用Miltenyi公司的MACS CD4+ T kit进行磁珠分选，获得CD4+T细胞。

[0012] 提取总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人AIM2基因，分别在上游引入NheI内切酶位点，下游引入HindIII内切酶位点。对载体质粒pcDNA3.1(+)及目的片段同样用NheI//HindIII双酶切进行处理，经T4DNA 连接酶构建重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌，挑取单个克隆菌落，进行 PCR及双酶切验证。构建成功的重组表达载体pcDNA-AIM2经过电转转染进CD4+T 细胞，后进行Tfh细胞诱导分化，后通过流式、RT-PCR测定Tfh分化的差异。

[0013] 本发明过表达载体的转入，进一步明确AIM2在Tfh细胞诱导分化中的作用，为AIM2及Tfh细胞分化及功能研究提供新思路。

附图说明

[0014] 图1为流式细胞技术检测AIM2商品化蛋白刺激后，对Tfh分化比例的影响；

[0015] A：流式结果显示，AIM2(0.1ug/ml)能刺激Tfh细胞的诱导分化；

[0016] B：统计学分析结果显示，AIM2刺激能明显增加Tfh细胞分化比例(n＝4，以4个样本为检测对象，p<0.05)；

[0017] Ctrl为空白对照；

[0018] CD4、CXCR5、PD-1均为Tfh细胞的表面标记物；

[0019] CXCR5(gating on CD4)即在CD4+T细胞上看CXCR5的表达。

[0020] 图2为流式细胞技术检测AIM2质粒转染后对Tfh分化比例的影响；

[0021] 与空质粒(PCDNA)相比，AIM2质粒转染后能明显增加Tfh的比例(以3 个样本为检测对象)。

[0022] 图3为QPCR检测AIM2质粒转染后对Tfh分化相关转录因子的影响；

[0023] 相比较转染空质粒组(PCDNA)，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括：AIM2、STAT3、C-MAF、BCL-6。

具体实施方式

[0024] 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0025] 实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

[0026] 1载体pcDNA3.1(+)-AIM2的构建

[0027] 1.1总RNA提取

[0028] 收集CD4+T细胞离心后弃上清，用PBS将细胞洗涤两遍，每管细胞中加入 Trizol试剂1ml，充分吹打混匀，室温下静置5min，吹打，使细胞完全裂解，移至新的1.5ml EP管中；加入200μl4℃预冷的氯仿，剧烈震荡混匀；4℃， 12000rpm，离心15min；将上层水相移至另一新的1.5mL EP管内；加入等量的 4℃预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒混匀，-20℃放置3-4h；4℃，12000rpm，离心 30min；弃上清，加入4℃预冷的75％无酶乙醇1ml，轻柔上下颠倒洗涤RNA沉淀，4℃，7500rpm，离心5min，重复洗涤一次；弃上清，用移液枪将液体吸干，室温干燥RNA约5min，加入20μl无酶水，充分溶解RNA沉淀，测量浓度和OD 值，置于-80℃冰箱保存。

[0029] 1.2 cDNA的制备

[0030] 冰上溶解RNA样本。进行基因组DNA去除反应(Takara公司)，取无酶200 μl PCR反应管，置于冰上，按下表依次加入：

[0031]

[0032] 轻弹管壁充分混匀，简短离心，42℃孵育2min，4℃孵育5min。

[0033] 将反应管置于冰上，按照下表进行逆转录(Takara公司)反应液配置：

[0034]

[0035] 混匀，简短离心后放入PCR仪上；37℃孵育15min，85℃孵育5s，保持在4℃进行PCR的条件；收集cDNA保存于-20℃。

[0036] 1.3 PCR扩增目的基因

[0037] 扩增人AIM2基因的引物序列为(铂尚生物科技公司合成)：

[0038] 上游：ATGTGAAGCCGTCCAGA(见序列表SEQ NO.3)；下游：CATCATTTCTGATGGCTGCA (见序列表SEQ NO.4)。

[0039] 上游引入NheI内切酶位点，下游引入HindIII内切酶位点。以cDNA为模板，按照下表配置PCR反应体系：

[0040]

[0041] PCR反应条件为：

[0042]

[0043] 1.4对载体质粒pcDNA3.1(+)及扩增出来的目的片段同样用NheI//HindIII 双酶切进行处理，经T4DNA连接酶构建重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌，挑取单个克隆菌落，进行PCR及双酶切验证。本发明中重组表达载体的测序验证序列为Pyrin区域，见序列表SEQ NO.2所示，其可与ASC结合形成炎症小体。

[0044] 2密度梯度离心法获得PBMC

[0045] 获志愿者知情同意后，抽取正常人静脉血，约60ml，分装在3支50ml无菌离心管中，每管20ml，加入20U/ml肝素，颠倒混匀，每管血中加入15ml常温PBS，充分混匀；取50ml的无菌离心管，每管加入15ml无菌淋巴细胞分离液，用移液管沿管壁缓慢将外周血加于淋巴细胞分离液上；2000rpm(加速减速均为 0)，18℃，离心30min，吸取白色云雾层，置入另一离心管中；吸取30mlPBS至离心管中，充分混匀，4℃，2000rpm离心15min；同上用PBS洗细胞两次，得到PBMC(外周血单个核细胞)，进行细胞计数。

[0046] 3外周血CD4+T细胞的分离纯化

[0047] 使用Miltenyi公司的MACS CD4+T磁珠从PBMCs中分离CD4+T细胞，每107个细胞加入试剂如下：40μl预冷的buffer，重悬细胞；10μl CD4+T cell Biotin-Antibody Cocktail II，充分吹打混匀，避免产生气泡；放置4℃避光孵育15min；4℃2000rpm离心10分钟后用500ulbuffer重悬。将LS分离柱放置在分选器上，将3ml预冷的buffer加入LS分离柱中，使分离磁珠润湿，润柱液丢弃；用移液枪将重悬的细胞悬液加入分离柱；等分离柱中液体滴完后，再用预冷的3ml buffer洗涤装了细胞的离心管和分离柱，每次3ml共3次；收集流出的液体，1000rpm，4℃，离心10min，细胞计数。

[0048] 4转染AIM2过表达质粒：以转染空质粒pcDNA3.1(+)为对照，通过电转染，将AIM2过表达质粒转染入分离出的CD4+T细胞中，转染4-6小时后换液。

[0049] 5诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化

[0050] 取24孔培养板，提前加入0.5ml含10μg/ml Anti-CD3抗体的PBS溶液，将24孔板放入细胞培养箱37℃孵育4-6h；用含10％FBS和青链霉素双抗的 RPMI-1640细胞培养基，重悬CD4+T细胞；取出包被Anti-human-CD3抗体后的 24孔板，用移液器弃去孔板中的PBS；取5×105个/ml CD4+T细胞的培养液1ml 加入孔板的每个孔中；向24孔板中分别加入相应抗体和细胞因子，诱导CD4+T 细胞向Tfh细胞分化，通过与空质粒组进行比较，其余变量一律每组相同。各成分及终浓度为：

[0051]

[0052] 诱导分化5天后收集细胞进行后续实验。

[0053] 6流式细胞术进一步检测诱导分化后，Tfh细胞相关表面标记物的表达量，进一步判断Tfh细胞的表达情况。

[0054] 将诱导分化5天后的CD4+T细胞收集到流式管中，每1X106个细胞加入 1ulAPC-CD4，1ulAPC-cy7-CXCR5，1ulPE-PD-1抗体，4℃避光孵育30分钟。使用BDFOXP3破核膜液破核膜后，上CANONII流式机，结果见附图2。

[0055] 7 QPCR检测AIM2质粒转染后对Tfh分化相关转录因子的影响。

[0056] 相比较转染空质粒组(PCDNA)，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括：AIM2、STAT3、C-MAF、BCL-6。结果见附图3。