肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用。属于纳米材料领域。具体为一种靶向肿瘤部位的仿生纳米材料，通过在介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)表面包覆癌细胞膜，同时MSN负载葡萄糖氧化酶(GOx)来实现饥饿治疗。由于仿生材料表面功能化，CMSN‑GOx具有免疫逃逸和同源靶向能力，可以明显提高纳米颗粒在肿瘤部位的富集。制备CMSN‑GOx纳米颗粒可实现肿瘤的部分消融，同时肿瘤膜诱导产生一定抗肿瘤免疫反应。相比只注射PD‑1免疫抑制剂或CMSN‑GOx，由CMSN‑GOx的饥饿疗法联合PD‑1免疫疗法能更有效地消融肿瘤并诱导自适应性的免疫反应，具有良好的生物相容性，较大的临床应用潜质。

权利要求

1.一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料，其特征在于，由介孔纳米颗粒、肿瘤细胞膜，和葡萄糖氧化酶组成，其中介孔纳米颗粒负载葡萄糖氧化酶，肿瘤细胞膜包覆负载葡萄糖氧化酶的介孔纳米颗粒，所述介孔纳米颗粒为介孔二氧化硅，即MSN，其获得的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料为CMSN-Gox，所述CMSN-Gox由以下方法制备，具体包括以下步骤：

1）、负载葡萄糖氧化酶的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：在pH值为7.4的PBS缓冲液中介孔二氧化硅纳米颗粒与葡萄糖氧化酶混合，两者浓度均为0.05mg/ml，室温下通过磁力搅拌器搅拌过夜，使介孔二氧化硅纳米颗粒负载葡萄糖氧化酶；

2）、肿瘤细胞膜的制备：将B16-F10细胞在直径10厘米培养皿中孵化，细胞数量大约为1×108个，然后用细胞刮板分离，在700 g离心处理5分钟；收集到的细胞在预冻的pH 为7.4的PBS缓冲液重悬，在600 g 离心5分钟；获得的细胞颗粒悬浮在低渗的溶液中，该低渗溶液包含0.05μl/μl氟化膜蛋白提取试剂缓冲液和0.05μl/μl苯甲基磺酰氟, 根据说明书的指示，在冰浴中孵化10 - 15分钟，将溶液中的细胞反复冻融，在4℃，700 g离心10 min，上清液14000 g离心30 min，收集细胞膜碎片，利用Avanti挤出机，在400纳米的聚碳酸酯多孔膜上，对肿瘤细胞的细胞膜进行了11次挤压；

3）、CMSN-GOx的制备：在pH值为7.4的PBS缓冲液中介孔二氧化硅纳米颗粒与肿瘤细胞膜混合，两者浓度均为0.05mg/ml；采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行了11次挤压，然后用离心机去除多余的步骤2）制得的肿瘤细胞的细胞膜，新制备的CMSN-GOx在4℃ PBS中过夜。

2.权利要求1所述的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-GOx在制备治疗肿瘤药物的应用。

3.有效量的包含权利要求1所述的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-Gox联合有效量的PD-1单克隆抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PD-1单克隆抗体购买自ebioscience公司。

说明书

肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料(以下简称：CMSN-GOx)及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 近年来，肿瘤免疫学因其对肿瘤的免疫调节手段而引起了广泛的关注。此外，免疫检查点抑制剂-程序化细胞凋亡蛋白1(PD-1)是肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)的典型负调控因子。虽然PD-1免疫治疗具有良好的临床治疗效果，但脱靶效应依然很明显，还会带来一些不良反应。此外，这些药物更大的危害是可能导致自身免疫功能紊乱。因此，如何提高癌症治疗效果和减少脱靶作用是PD-1免疫治疗的关键因素。例如，检查点抑制与其他免疫调节相结合，增强了抗肿瘤治疗效果。此外，免疫疗法的无效也可能是由于缺乏协同刺激分子进入肿瘤微环境，使抗原呈递细胞(APC)暴露于癌细胞和T细胞。因此，需要进一步改善这些免疫检查点阻断疗法的临床表现，以消除其治疗的不利影响。最近，一些研究结果显示，在纳米颗粒的作用下，肿瘤微环境会暴露肿瘤相关抗原，会出现像疫苗一样的免疫反应，再与肿瘤免疫疗法结合，表现出极佳的抗肿瘤效果。

[0003] 葡萄糖是重要的供能物质，是肿瘤生长的营养物质。因此，利用葡萄糖氧化酶(GOx)催化肿瘤微环境中的葡萄糖转化为葡萄糖酸和有毒过氧化氢，这是一种新型的饥饿疗法治疗模式，具有明显的肿瘤消融效果，比传统的饥饿疗法更有效，同时抑制了能量供应。最近的报道，集中在饥饿疗法联合一些光学疗法上，以提高癌症治疗效果。

[0004] 介孔纳米颗粒分类：

[0005] 1.硅基介孔材料：孔径分布狭窄，孔道结构规则，并且技术成熟，研究颇多。硅系材料可用于催化，分离提纯，药物包埋缓释，气体传感等领域。硅基材料又可根据纯硅和掺杂其他元素而分为两类。进而可根据掺杂元素种类及不同的元素个数不同进行细化分类。杂原子的掺杂可以看作是杂原子取代了原来硅原子的位置，不同杂原子的引入会给材料带来很多新的性质，例如稳定性的变化、亲疏水性质的变化、以及催化活性的变化等等。常见的介孔硅材料如下：介孔二氧化硅，介孔二氧化钛，介孔MCM-48，介孔氮杂碳纳米颗粒，介孔碳，介孔氧化钨，介孔氧化铝，磁性介孔硅。

[0006] 2.非硅系介孔材料：主要包括过渡金属氧化物、磷酸盐和硫化物等。由于它们一般存在着可变价态，有可能为介孔材料开辟新的应用领域，展示硅基介孔材料所不能及的应用前景。例如：铝磷酸基分子筛材料中部分P被Si取代后形成的硅铝磷酸盐、架构中引入二价金属的铝磷酸盐(已广泛应用于吸附、催化剂负载、酸催化、氧化催化(如甲醇烯烃化、碳氢化合物氧化)等领域。内表面积大和孔容量高的活性炭，由于具有高的吸附量以及可从气液中吸附不同类型的化合物等特性已成为主要的工业吸附剂。此外介孔碳制得的双电层电容器材料的电荷储量高于金属氧化物粒子组装后的电容量，更是远高于市售的金属氧化物双电层电容器。二氧化钛基介孔材料具有光催化活性强、催化剂载容量高的特点，其结构性能和表征方面的研究颇多。

[0007] 介孔纳米粒子具有革新肿瘤治疗的潜力，但只有少数实验被应用于临床治疗。主要是由于免疫系统可以很容易地识别出纳米颗粒作为入侵者，产生强烈的免疫排斥反应，限制了对肿瘤组织的药物传递效率。

发明内容

[0008] 为了克服现有技术存在的问题与不足，本发明的目的之一是提供一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料，该材料具有免疫逃逸和同源靶向能力、可实现肿瘤的部分消融，同时肿瘤细胞膜诱导产生一定抗肿瘤免疫反应。

[0009] 本发明的目的之二是提供一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料的制备方法，通过在介孔纳米颗粒表面包覆肿瘤细胞膜，同时介孔纳米颗粒负载葡萄糖氧化酶(GOx)。制备过程简单，操作方便，节约原材料，实验原材料来源丰富。

[0010] 本发明的目的之三是提供肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料的用途，通过负载的葡萄糖氧化酶实现对肿瘤的饥饿疗法。

[0011] 本发明的目的之四是提供肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料的用途，通过将CMSN-GOx饥饿疗法联合PD-1免疫疗法，可以提高抗肿瘤效果。

[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0013] 第一方面，本发明提供一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料，由介孔纳米颗粒、肿瘤细胞膜，和葡萄糖氧化酶组成，其中介孔纳米颗粒负载葡萄糖氧化酶，肿瘤细胞膜包覆负载葡萄糖氧化酶的介孔纳米颗粒。

[0014] 优选地，上述介孔纳米颗粒为介孔二氧化硅，介孔二氧化钛，介孔MCM-48，介孔氮杂碳纳米颗粒，介孔碳，介孔氧化钨，介孔氧化铝，磁性介孔硅任意一种。

[0015] 进一步的，上述介孔纳米颗粒为介孔二氧化硅，即MSN，其获得的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料为CMSN-GOx。

[0016] 第二方面，本发明提供一种肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-GOx的制备方法，包括以下步骤：

[0017] 1)、负载葡萄糖氧化酶的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：在pH值为7.4的PBS缓冲液中介孔二氧化硅纳米颗粒与葡萄糖氧化酶混合，两者浓度均为0.05mg/ml，室温下通过磁力搅拌器搅拌过夜，使介孔二氧化硅纳米颗粒负载葡萄糖氧化酶；

[0018] 2)、肿瘤细胞膜的制备：将B16-F10细胞在直径10厘米培养皿中孵化，细胞数量大约为1×108个，然后用细胞刮板分离，在700g离心处理5分钟；收集到的细胞在预冻PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，在600g离心5分钟；获得的细胞颗粒悬浮在低渗的溶液中，该低渗溶液包含0.05μl/μl氟化膜蛋白提取试剂缓冲液(赛默飞)和0.05μl/μl苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(碧云天),根据说明书的指示，在冰浴中孵化10-15分钟，将溶液中的细胞反复冻融，在4℃，700g离心10min，上清液14000g离心30min，收集细胞膜碎片，利用Avanti挤出机，在400纳米的聚碳酸酯多孔膜上，对肿瘤细胞的细胞膜进行了11次挤压；

[0019] 3)、CMSN-GOx的制备：在pH值为7.4的PBS缓冲液中介孔二氧化硅纳米颗粒与肿瘤细胞膜混合，两者浓度均为0.05mg/ml；采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行了11次挤压，然后用离心机去除多余的步骤2)制得的肿瘤细胞的细胞膜，新制备的CMSN-GOx在4℃PBS中过夜。

[0020] 第三方面，本发明提供肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-GOx在制备治疗肿瘤药物的应用。

[0021] 第四方面，本发明提供有效量的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-GOx与有效量的PD-1免疫抑制剂在制备治疗肿瘤的药物组合中的应用。

[0022] 优选地，所述PD-1免疫抑制剂选自ebioscience公司

[0023] 本发明的原理如图1所示：

[0024] 介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)负载葡萄糖氧化酶(GOx)获得MSN-GOx，然后，通过挤出器挤压方法将肿瘤细胞膜包裹在MSN-GOx纳米材料表面。由于肿瘤细胞膜赋予纳米颗粒表面功能化，CMSN-GOx可以逃脱免疫清除，具有同型靶向功能，从而显著增强其肿瘤部位的富集能力。CMSN-GOx负载的葡萄糖氧化酶可以切断癌细胞的葡萄糖来源，而且产生有毒的过氧化氢来增强抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长。此外，肿瘤细胞膜有利于树突状细胞的成熟，诱导免疫反应，并能将相关抗原有效地传递给肿瘤的抗原呈递细胞，以增强PD-1免疫检查点的阻断效应。

[0025] 本发明的肿瘤细胞膜包覆的负载葡萄糖氧化酶的纳米材料CMSN-GOx具有如下优点：

[0026] 1、由于肿瘤细胞膜赋予纳米颗粒表面功能化，CMSN-GOx可以逃脱免疫清除，具有同型靶向功能，从而显著增强其肿瘤部位的富集能力。

[0027] 2、CMSN-GOx可以切断癌细胞的葡萄糖来源，抑制肿瘤生长，诱导免疫反应。

[0028] 3、由CMSN-GOx实施的饥饿疗法联合PD-1免疫疗法能更有效地消融肿瘤并诱导自适应性的免疫反应，这是第一次在仿生领域报道，具有很大的临床应用潜质。

[0029] 4、由CMSN-GOx实施的饥饿疗法联合PD-1免疫疗法具备良好的生物相容性，关键器官没有明显的组织损伤。

附图说明

[0030] 图1本发明的实验机理图；

[0031] 图2CMSN-GOx的表征图；

[0032] A.MSN(左)和CMSN(右)透射电镜图，左边及右上标尺为50μm，右下图标尺为100μm；B.MSN和CMSN的水和动力学半径和Zeta点位；C.肿瘤细胞膜、MSN和CMSN的SDS-PAGE；D.分别在无糖和有糖培养基中pH值的测定；E.分别在无糖和有糖培养基中细胞活性；F.CLSM图片表示单个B16-F10细胞与CMSN孵育后，细胞核、MSN和肿瘤细胞膜分别标记DAPI、Cy5、FITC。
标尺为5μm。

[0033] 图3经过各种处理后B16-F10的细胞凋亡情况，标尺,100μm。

[0034] 图4经过各种处理后RAW 264.7细胞和B16-F10细胞在不同培养时间下的Si含量，(n＝6)。

[0035] 图5经过各种体内治疗的结果图；

[0036] A.动物实验进程图；B-C.实验老鼠经过不同处理后其肿瘤体积与小鼠体重的变化趋势；(n＝5)D-E.老鼠经过不同实验处理后肿瘤组织碎片分别负染HE和Ki-67。

[0037] 图6A 老鼠经过不同实验处理后肿瘤组织碎片TUNEL负染结果图；

[0038] 图6B老鼠经过不同实验处理后诱导DC成熟数据图，标尺为10μm。

[0039] 图7经过不同条件处理后18F-FDG在小鼠体内的吸收PET成像图；

[0040] 图8老鼠的T细胞在不同实验处理后各组中流式数据图；

[0041] A.肿瘤浸润中CD4+T细胞所占的比例；B.肿瘤浸润中CD8+T细胞所占的比例；C.不同实验组中CD4+FoxP3+T细胞的流式数据图；D.肿瘤浸润中CD4+FoxP3+调节T细胞所占比例；E.CD8+肿瘤浸润T细胞，CD4+效应T细胞相对Treg细胞所占比例。所有数据(n＝3)[0042] 图9不同实验处理后老鼠的生物安全性数据(H&E)，标尺为50μm。

具体实施方式

[0043] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。一、实验部分[0044] 1、材料与试剂

[0045] PBS(pH＝7.4)和牛胚胎血清购自赛默飞(美国)。介孔二氧化硅纳米颗粒购于上海羧菲生物有限公司，直径80-100nm。乙二胺四乙酸、多聚甲醛、DAPI、FITC、FDA、PI、CCK-8、BCA试剂盒和磷钨酸购自西格玛(美国)。SDS样品缓冲液和SDS凝胶购自碧云天(中国)。DSPE-PEG-Cy5购自nanocs(美国)。PD-1免疫抑制剂购自ebioscience(美国)。其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

[0046] 2、负载负载葡萄糖氧化酶的介孔二氧化硅纳米材料(以下简称：MSN-Gox)的制备[0047] 准备1毫升PBS包含50μg MSN纳米颗粒与50μg的GOx混合，室温下通过磁力搅拌器搅拌过夜，使MSN纳米粒子负载GOx；

[0048] 3、肿瘤细胞膜的制备

[0049] 将B16-F10细胞在直径10厘米培养皿中孵化,细胞数量大约为1×108个，然后用细胞刮板分离，在700g离心处理5分钟。收集到的细胞在预冻PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬和在离心机600g 5分钟。获得的细胞颗粒悬浮在低渗的1ml包含50μl氟化膜蛋白提取试剂缓冲液(赛默飞)和50μl phenylmethanesulfonyl(PMSF)(碧云天)的溶液中,冰浴孵化10-15分钟，在此之后，上述溶液中的细胞反复冻融，4℃700g离心10min。上清液14000g离心30min，收集细胞膜碎片。利用Avanti挤出机，在400纳米的聚碳酸酯多孔膜上，对肿瘤细胞的细胞膜进行11次挤压。

[0050] 4、制备肿瘤细胞膜包覆的MSN(以下简称：CMSN)和CMSN-GOx复合材料[0051] 将1毫升PBS包含50μg MSN与20μg肿瘤细胞膜混合。采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行了11次挤压，然后用离心机去除多余的肿瘤细胞膜。最后，新制备的CMSN在4℃PBS中过夜，以供进一步使用。

[0052] 肿瘤细胞膜包覆到CMSN-GOx表面，准备1毫升PBS包含50μg MSN与50μg肿瘤细胞膜混合。采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行了11次挤压，然后用离心机去除多余的肿瘤细胞膜。最后，新制备的CMSN-GOx在4℃PBS中过夜，以供进一步使用。

[0053] 5、表征CMSN

[0054] 用DLS测定了纳米颗粒的水动力直径和Zeta电位。50μg MSN或CMSN悬浮在1毫升1×PBS和测量在室温下进行。用TEM(JEM-2010HT,Japan)对CC-MSN的形貌进行了表征。TEM样品通过与含CMSN的悬浮液滴接触60s，用磷钨酸对其进行负染30s，表征前在环境条件下干燥。

[0055] 6、SDS-PAGE蛋白分析

[0056] 采用SDS-PAGE法对蛋白质进行分析。用BCA试剂盒测量了SDS样品缓冲液中的MSN和CMSN。将样品加热至95℃，5min，20g的样品装入10％SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个空中。样品在120V条件下运行2h，然后将聚丙烯酰胺凝胶洗2小时，洗净后，观察。

[0057] 7、GOx催化实验

[0058] 首先，在葡萄糖不存在或存在的情况下测量GOx诱导的pH值变化。即MSN-GOx和CMSN-GOx(50g/mL)与葡萄糖(1mg/mL)混合，或单独分散在蒸馏水中。用pH计测量溶液的实时pH值。

[0059] 8、CMSN稳定性实验

[0060] 通过将MSN和DSPE-PEG-Cy5混合，肿瘤细胞膜混入FITC，将MSN标记为Cy5，肿瘤细胞膜标记为FITC。在37℃下，50μg CMSN与B16-F10细胞在37℃，5％的二氧化碳培养箱中孵化4h。然后用PBS洗涤3次，用PFA在室温下固定30分钟，用DAPI染色，然后用CLSM(IX81,Olympus,Japan)进行成像。DAPI、FITC和Cy5通道分别获得蓝色、绿色和红色荧光的图像。

[0061] 9、细胞毒性实验

[0062] CCK-8检测用于评估纳米颗粒对B16-F10癌细胞的细胞毒性。细胞在96孔培养皿中孵育，培养12小时。然后分别在无糖和有糖的情况下，在培养基中添加了MSN-GOx和CMSN-GOx(50g mL-1)，而加PBS没有任何颗粒的细胞被用作对照。然后在37℃，5％的二氧化碳培养箱中孵化24h,孵育结束后，加入5mg mL-1CCK-8PBS溶液，培养皿培养4小时，最后用微板读取器(Emax Precision,USA)测定细胞的450nm吸光度值。对孔板的背景吸光度进行了测量和减除。将处理组的光密度(OD)值除以对照组(C)的OD值(T/C 100％)，计算出细胞毒性。10、体外免疫逃避和肿瘤靶向实验

[0063] RAW 264.7和B16-F10细胞在12孔板培养12h。分别将50μg红细胞膜包裹的介孔二氧化硅(同肿瘤细胞膜包覆介孔二氧化硅方法)RBC-MSN、MSN和CC-MSN加入到孔板中。获得的细胞用PBS洗三次，然后在4h 37℃，5％的二氧化碳的条件下孵育，最后用PBS清洗三次。为了量化Si的摄取，在每孔板中加入0.5mL 1％的Tween 80，在1:1:1H2O/HF/HNO3混合物中加热，使细胞溶解。在室温下搅拌混合12h，100℃加热6h去除酸。然后用1ml的去离子水重新悬浮样品，每个样品的Si含量用ICP-MS测定。

[0064] 11、体内治疗评估

[0065] 雌性C57B6小鼠购自湖北省疾病预防控制中心。B16-F10肿瘤细胞(5×105)被移植到C57B6老鼠，小鼠随机分为5组，包括PBS，PD-1单克隆抗体,MSN-GOx，CMSN-GOx,CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体。从第8天开始，每隔3天，静脉注射50μg MSN-GOx和CMSN-GOx,共4次。从第9天开始，20μg PD-1单克隆抗体通过腹腔注射，每3天注射一次，一共注射3次。从第6天开始，每三天给老鼠称重。肿瘤体积计算为(长x宽2)/2。第19天，实验终止，老鼠被安乐死。用H&E、Ki-67、TUNEL染色。

[0066] 12、流式细胞仪分析

[0067] 为了分析不同实验处理后老鼠的肿瘤中的免疫细胞，利用胶原酶/透明质酸酶和DNase对肿瘤进行采集和消化。获得的细胞溶解于红细胞裂解缓冲液(碧云天)，并通过尼龙滤网过滤(70μm)。单细胞悬浮液在PBS中被重新悬浮，2％FBS。为了分析T细胞，制备的细胞被标记带有荧光染料的anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8抗体。对于调节性T细胞的分析，单个细胞被标记带有荧光染料的anti-CD4和anti-Foxp3抗体染色。为了评估树突状细胞，产生的细胞与被标记带有荧光染料的anti-CD11c、anti-CD80、anti-CD86抗体一起孵育，用流式细胞仪分析不同实验处理后骨髓源树突状细胞协同刺激分子CD80和CD86的上调比率。

[0068] 13、活体PET成像

[0069] 使用正电子发射断层扫描(PET)成像技术并计算18F-FDG在小鼠体内的吸收值。用PET系统进行体内PET成像，分别将50μl PBS,MSN-GOx(50μg),CMSN-GOx(50μg),PD-1单克隆抗体(20μg),CMSN-GOx(50μg)+PD-1单克隆抗体(20μg)注射如体内，其中PBS,MSN-GOx(50μg),CMSN-Gox尾静脉注射，PD-1单克隆抗体腹腔注射，用18F标记的葡萄糖模拟物18F-FDG对纳米颗粒的治疗效果进行量化。这为治疗后一小时内治疗区域的肿瘤代谢减少提供了定量的方法。

[0070] 14、体内毒性实验评估

[0071] 为了测试不同实验处理的潜在体内毒性，在第一次注射后的第30天，所有的小鼠都被安乐死，收集血液样本和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)。用H&E染色重要器官。

[0072] 二、结果

[0073] 透射电子显微镜(TEM)图像显示CMSN-GOx具备完整的核壳结构，同时观察到细胞膜厚度约为10nm，这与其他组报道的细胞膜厚度相一致。上述结果表明，肿瘤细胞膜成功地包覆在MSN纳米颗粒表面，如图2A所示。接下来利用动态光散射(DLS)来表征CMSN-Gox，通过对比包膜前后纳米颗粒的水动力半径和Zeta电位，发现水动力直径明显变大，Zeta电位的数值也明显变大，如图2B所示，这些变化的原因是肿瘤细胞膜具有一定的厚度和表面带有较少的负表面电荷。使用SDS-PAGE电泳法验证肿瘤细胞膜中蛋白的保留度，如图2C所示，在CMSN和肿瘤细胞膜中检测到相同的蛋白质条带，但在MSN纳米颗粒中没有检测到任何蛋白质条带。

[0074] 通过研究纳米材料负载的GOx对葡萄糖的分解反应，来评估细胞水平的饥饿疗法效果。如图2D所示，在无葡萄糖的培养条件下，MSN-GOx的pH值维持在7.4附近。相反，在含葡萄糖的培养条件下，葡萄糖被MSN或CMSN中的GOx分解产生葡萄糖酸，导致溶液的pH值下降明显(从7.4到3.6)。在肿瘤生长过程中，葡萄糖作为能量供给来促进肿瘤细胞增殖。相比传统的饥饿疗法只切断葡萄糖供应，本实验的饥饿疗法不仅切断葡萄糖供应，而且产生有毒的过氧化氢来增强抗肿瘤效果。正如预期的那样,在含葡萄糖的培养条件下，CMSN+GOx和MSN+GOx都能明显的抑制肿瘤细胞的增殖。(图2E)

[0075] 为了检测我们制备的仿生材料具备肿瘤靶向的能力，把B16-F10细胞与CMSN孵化，并分别在MSN和肿瘤细胞膜上连接Cy5和FITC。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示Cy5(红色)和FITC(绿色)位置几乎完全重叠并聚集在细胞核附近(图2F),说明CMSN具备完整的核壳结构并对B16-F10细胞有一定的靶向能力。

[0076] 利用CCK-8检测来评估治疗效果，如图3所示，其中红色(死细胞)、绿色(活细胞)，CMSN-GOx处理后的红色荧光最强，说明细胞凋亡最多。

[0077] 通过细胞摄取实验进一步验证制备的材料具备免疫逃避和肿瘤靶向的能力。不同的纳米颗粒分别与B16-F10和RAW264.7细胞共培养，然后细胞摄取Si含量通过ICP-MS来检测。如图4所示，CMSN-GOx表现出较低的巨噬细胞吞噬，较高的肿瘤细胞摄取，进一步证明了肿瘤膜包覆的纳米颗粒具备免疫逃避和肿瘤靶向的能力。

[0078] 动物实验进程如图5A所示。小鼠肿瘤消融分别通过CMSN-GOx或MSN-GOx的饥饿疗法，PD-1免疫治疗以及CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合治疗，然后将经过不同方式处理后的小鼠的肿瘤体积和体重进行检测。如图5B所示，可以清楚地看到，小鼠通过单一的饥饿疗法(CMSN-GOx或MSN-GOx)或免疫疗法(PD-1)处理后，其肿瘤的增殖没有得到明显抑制，然而，小鼠经过CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合治疗后，可以观察到明显的抑制肿瘤增殖现象。小鼠的体重没有出现明显的变化，说明我们材料生物相容性好，没有引起其他部位的病变。此外，我们用细胞组织学来研究肿瘤细胞的增殖。如图5D-E中所示，对不同方式治疗后的小鼠的肿瘤组织进行(H&E)染色分析，发现经过CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体治疗的小鼠肿瘤组织消融最明显。此外，利用Ki-67进行染色处理和研究，相比较单一治疗的模式，发现小鼠通过CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合治疗后，肿瘤细胞增殖得到明显的抑制。如图6A中所示，TUNEL染色得到了相同的结果，小鼠经过联合治疗后，肿瘤细胞明显凋亡。上述组织学结果说明，CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合治疗可以使小鼠的肿瘤增殖得到明显抑制。

[0079] 树突状细胞(DCs)是最重要的抗原呈递细胞，在启动和调节先天和适应性免疫方面起着重要作用。为了研究经过CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体处理的小鼠体内DCs的状态，收集B16-F10细胞进行CD11c/碘化丙啶负染，然后使用流式细胞仪进行分析。在小鼠体内肿瘤抗原一旦暴露，未成熟的DCs在转移至淋巴结区域时会吞下肿瘤抗原并将其加工成多肽。然后，这些未成熟的DCs将转化为成熟的DCs，并在到达淋巴结时向T细胞受体呈现主要的组织相容性复合肽。由于协同刺激分子CD80和CD86被公认为DC成熟的生物标志物，因此通过分析活体内CD80和CD86水平来评估DC的成熟水平。为了研究CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体能更好地诱导体内的DC成熟，通过提取小鼠中骨髓源DCs，然后利用流式细胞仪研究协同刺激分子CD80和CD86的上调比率。在小鼠皮下注射剂量相同的50μl PBS,PD-1单克隆抗体(20μg),MSN-GOx(50μg),CMSN-GOx(50μg),CMSN-GOx(50μg)+PD-1单克隆抗体(20μg)，注射三天后小鼠致死，将淋巴结中的CD80和CD86共染色并通过流式细胞仪检测。如图6B所示，相比于未包膜组，可以明显观察到经过CMSN-GOx处理的小鼠的CD80和CD86有一定的提高，说明包膜有利于DCs成熟。相比于其他治疗的小鼠，用CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合治疗的小鼠体内CD80和CD86的百分比最高。综上所述，联合治疗可以产生更强的免疫刺激效果，从而有助于增强免疫治疗。

[0080] 为了进一步评估CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体在小鼠体内的治疗效果，使用正电子发射断层扫描(PET)成像技术并计算18F-FDG在小鼠体内的吸收值。PET成像具有优良的成像灵敏度，广泛用于疾病诊断和治疗领域。分别从冠状、横向和矢状图来分析小鼠全身18F-FDG摄取量(图7)。PET图像结果显示，CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体处理的小鼠肿瘤区域对18F-FDG的摄取量最小，说明联合治疗可以达到最佳的肿瘤消融效果。

[0081] 为了更好的理解CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体联合疗法在小鼠体内的治疗过程，使用流式细胞仪来分析小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞)增殖情况。在小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)不仅能有效杀死B16-F10细胞，而且促进效应T细胞(CD4+)在适应性免疫中发挥作用。通过观察图8A-C，清楚观察到小鼠经过CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体处理后，CD8+CTL的数值和效应T细胞的数值明显高于其他组。使用Foxp3作为CD4+标记物，它可以帮助T细胞筛选出效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)。相反，调节性T细胞(Tregs)(CD3+CD4+Foxp3+)，可以明显抑制抗肿瘤免疫反应。收集肿瘤中的T细胞，通过CD4和Foxp3联合染色后，利用流式细胞仪进行分析。尽管经过CMSN-GOx饥饿治疗的小鼠出现了类似疫苗的免疫反应，但是由于大量的Treg进入肿瘤区域导致其抗肿瘤效果并不令人满意。为了解决这一问题，PD-1免疫疗法将被引入到饥饿疗法中。如图8D所示，PD-1免疫治疗可以显著降低Treg(CD3+CD4+Foxp3+)在肿瘤中的比例。因此，在肿瘤组织中，小鼠经过CMSN-GOx+anti-PD-1联合治疗后，肿瘤组织的CD8+Treg、CD4+Teff/Treg比值明显提高(图8E)。另外，比较图8D-E中CMSN-GOx和MSN-GOx两组会发现，在纳米颗粒上包覆的肿瘤细胞膜后能提高肿瘤组织中细胞毒性T细胞，效应T细胞比例(CD8+Treg和CD4+Teff/Treg比值)，并降低Treg的比例，这可能是由肿瘤细胞膜诱导的免疫反应造成的。本研究表明，在纳米颗粒表面包覆肿瘤细胞膜有助于免疫治疗，这是第一次在仿生领域报道。

[0082] 为了进一步验证CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体在体内的生物相容性，将进行组织分析。如图9所示，发现H&E切片结果显示关键器官没有明显的组织损伤。上述结果表明，CMSN-GOx+PD-1单克隆抗体具备良好的生物相容性和具有很大的临床应用潜质。

[0083] 综上所述，本发明报道了CMSN-GOx饥饿疗法联合PD-1免疫疗法可以提高抗肿瘤效果。由于肿瘤细胞膜赋予纳米颗粒表面功能化，CMSN-GOx可以逃脱免疫清除，具有同型靶向功能，从而显著增强其肿瘤部位的富集能力。CMSN-GOx可以切断癌细胞的葡萄糖来源，抑制肿瘤生长，诱导免疫反应。令人满意的是，与单一疗法相比，饥饿疗法联合免疫疗法能更有效地消融肿瘤并诱导自适应性的免疫反应。此外，本发明还引入了PET成像来表征肿瘤部位葡萄糖代谢水平，可以更加直观观察到联合治疗的治疗效果。因此，利用肿瘤膜包裹纳米颗粒与免疫治疗相结合的治疗模式，在未来拥有一定的应用潜质。