一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂及用途

摘要

本发明涉及一种对脓毒症致病因子具有良好的广谱吸附作用的吸附剂，该吸附剂表面带有可特异性吸附上述致病因子的功能基，可以从血液等各种流体中清除包括病原体相关分子模式和/或炎症细胞因子在内的多种内源性和外源性脓毒症致病因子，并具有良好的血液相容性，可以通过全血或者血浆灌流的方式，选择性地清除脓毒症患者体内过量的脓毒症致病因子，从而治疗脓毒症。

权利要求

1.一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂，其特征在于：吸附剂由氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂和多胺功能基连接组成，其化学结构如下：其中，R1~R5任意选自H或OCH3；n1~n4是1~6的整数；n5是0~2的整数；X-NH-是氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述多孔聚丙烯酸酯树脂是聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述脓毒症致病因子是指病原体相关分子模式和/或炎症细胞因子。

4.根据权利要求3所述的吸附剂，其特征在于：所述病原体相关分子模式包含内毒素、细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA和/或真菌多糖。

5.根据权利要求3所述的吸附剂，其特征在于：所述炎症细胞因子包含TNF-α和/或IL-

6。

6.权利要求1 5任意所述吸附剂在制备血液净化器中的用途。

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说明书

一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂及用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，特别涉及一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂及用途。

背景技术

[0002] 脓毒症是机体对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。细菌、病毒、真菌等各种病原体入侵机体后释放的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)，如革兰氏阴性菌(G-菌)的脂多糖(LPS)和鞭毛蛋白、革兰氏阳性菌(G+菌)的肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)、分枝杆菌和螺旋体的脂蛋白和脂肽、细菌和真菌的甘露糖，细菌和病毒的非甲基化CpG DNA，以及病毒双股/单股RNA(dsRNA/ssRNA)等是导致脓毒症的外源性致病因子。因此，从患者体内清除这些分子对于脓毒症的治疗至关重要。此外，机体在PAMP的刺激下会产生大量炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)，形成细胞因子风暴，进一步诱导次级炎症介质的释放，引起级联放大的细胞因子瀑布效应，最终导致多器官功能障碍，危及生命。因此，细胞因子也是导致脓毒症的重要内源性致病因子，清除这些分子同样有利于脓毒症的治疗。

[0003] 为清除上述致病因子，国内外学者研究了大量血液净化用吸附剂。比如，为吸附内毒素，中国发明专利CN1528511公开了一种以球形壳聚糖、琼脂、纤维素或聚甲基丙烯酸酯为载体，二甲基胺为配体的内毒素吸附剂。CN102580683A公开了一种以纤维素、琼脂糖、聚乙烯醇、苯乙烯-二乙烯苯共聚物或者聚甲基丙烯酸甲酯为载体，脱氧胆酸和氨基酸或聚氨基酸未配基的内毒素吸附剂。CN106334540A公开了一种以大孔聚乙烯醇为载体，单壁或多壁胺基化碳纳米管为配基的内毒素吸附剂。CN103769060A公开了一种以苦柯胺B为配基，琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素或聚苯乙烯为载体，制备的吸附内毒素、细菌DNA和肽聚糖的吸附剂。CN105195114A还公开了一种以本发明所述的多胺功能基为配基，氨基化的琼脂糖或氨基化的聚苯乙烯树脂为载体，制备的吸附内毒素、细菌DNA、肽聚糖、脂磷壁酸、病毒RNA以及酵母多糖的吸附剂。以外，为吸附细胞因子，CN103585977A公开了一种以纤维素、琼脂糖、聚乙烯醇微球为载体，含4～18个碳原子的对烷基苯胺及其衍生物为配基的细胞因子吸附剂。CN106334541A公开了一种以纳米碳酸钙-苯乙烯-二乙烯苯为基本骨架，以甲苯、汽油和多碳醇混合物为致孔剂，以过氧化苯甲酰为引发剂而制成的细胞因子吸附剂。美国发明专利US8663148B2、US8758286B2、US9173989B2以及US9408962B2公开了一类以非多孔型聚苯乙烯为载体，表面共价交联肝素或硫酸乙酰肝素等功能基的细胞因子吸附剂。

[0004] 但是，壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇以及纤维素等载体机械强度差、易降解，聚苯乙烯等载体会吸附血中蛋白等有益成分，对血液相容性有不利的影响。此外，这些吸附剂只能吸附一种或极少数种致病因子，目前还没有能够广谱吸附多种PAMP和炎症细胞因子等致病因子的吸附剂。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂及用途。该吸附剂采用氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂接枝本发明所述的多胺功能基，不仅可以从血液等各种流体中吸附多种PAMP，还可以吸附炎症细胞因子，且具有良好的机械强度和血液相容性。该吸附剂制成的血液净化器，可用于从患者血液中清除包括PAMP和/或炎症细胞因子在内的多种内源和外源性致病因子。

[0006] 本发明的技术方案是：

[0007] 一种广谱吸附脓毒症致病因子的吸附剂，吸附剂由氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂和多胺功能基连接组成，化学结构如下：

[0008]

[0009] 其中，R1～R5任意选自H或OCH3；n1～n4是1～6的整数；n5是0～2的整数；X-NH-是氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂。

[0010] 所述多孔聚丙烯酸酯树脂是聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂中的任意一种。

[0011] 所述脓毒症致病因子是指病原体相关分子模式(PAMP)和/或炎症细胞因子。

[0012] 所述病原体相关分子模式(PAMP)包含内毒素、细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA和/或真菌多糖。

[0013] 所述炎症细胞因子包含TNF-α和/或IL-6。

[0014] 所述吸附剂在制备血液净化器中的用途。

[0015] 本发明所述的氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂的制备可以参考文献“杨德富等，丙烯酸系树脂.离子变换与吸附，1991，7(4)：293-306.”，其中氨基功能化的聚丙烯酸甲酯树脂的制备还可参考文献“何炳林等，亲水性亚胺二乙酸基螯合树脂合成与性能的研究.离子交换与吸附，1992，8(2)：159-153.”，氨基功能化的聚甲基丙烯酸甲酯树脂的制备还可参考文献“陈利等，新型疏水性酶载体的合成及其性能研究.离子交换与吸附，2014，30(2)：177-182.”。此外，也可以采用商品化的聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂。

[0016] 本发明所述多胺功能基的制备以及多胺功能基与树脂的共价连接可以按照申请人的发明专利CN105195114A中所述的方法进行。

[0017] 申请人的研究显示，本发明所述吸附剂主要具有以下显著特点：

[0018] (1)对内毒素、细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA和/或真菌多糖等多种PAMP，以及TNF-α和/或IL-6等多种炎症细胞因子具有良好的吸附作用；

[0019] (2)对血中总蛋白的吸附少，使用安全性较高；

[0020] (3)血液相容性好。

[0021] 申请人的试验表明，在氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂表面接枝多胺功能基制成的吸附剂能够吸附多种PAMP和/或炎症细胞因子，这种广谱的吸附效应对脓毒症的治疗具有重要意义。同时，吸附剂对血中蛋白成分的吸附较少，血液相容性好，机械强度高，因此使用安全性好。

[0022] 本发明所述吸附剂表面带有可特异性吸附上述致病因子的多胺功能基，以全血灌流或者血浆吸附的方式，选择性地清除脓毒症患者体内过量的PAMP和/或炎症细胞因子等致病因子，改善脓毒症患者的病情。

[0023] 综上所述，本发明所述的吸附剂具有良好的临床应用价值，可用于血中存在过量PAMP和/或炎症细胞因子的患者，特别是脓毒症患者的治疗。

[0024] 吸附剂表面的功能基是发挥吸附作用的重要因素，只要被吸附物质具有与功能基发生结合作用的结构，即可被吸附剂吸附。PAMP除了本发明实施例中所述的内毒素、细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA和真菌多糖以外，还有鞭毛蛋白和热休克蛋白等，炎症细胞因子除了本发明实施例中所述的TNF-α和IL-6以外，还有IL-1β，IL-8以及IL-10等，这些分子只要具有与本发明所述多胺功能基发生相互作用的结构即可被本发明所述吸附剂吸附。此外，除了脓毒症患者以外，其他疾病患者如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病患者体内也存在过量的PAMP和炎症细胞因子，因此当将本发明所述的吸附剂用于其他可能存在过量PAMP和炎症细胞因子的患者的治疗也是预期有益的。因此，本领域其他技术人员根据本发明的技术原理和方案或在本发明的启示下所做出的若干改进、改变、润饰、变形、替换，得到的类似的吸附PAMP和/或炎症细胞因子的吸附剂及其用途，也应视为本发明专利的保护范围之内。

附图说明

[0025] 图1是扫描电子显微镜观察的聚丙烯酸甲酯树脂吸附剂的图像；

[0026] 图2是扫描电子显微镜观察的聚丙烯酸甲酯树脂吸附剂表面局部图像；

[0027] 图3是扫描电子显微镜观察的聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂的图像；

[0028] 图4是扫描电子显微镜观察的聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂表面局部图像；

[0029] 图5是扫描电子显微镜观察的聚甲基丙烯酸甲酯树脂吸附剂的图像；

[0030] 图6是扫描电子显微镜观察的聚甲基丙烯酸甲酯树脂吸附剂表面局部图像。

具体实施方式

[0031] 以下实施例仅是对本发明进行详细说明的优选方案，其不以任何形式限制本发明。

[0032] 实施例1：吸附剂的制备

[0033] 氨基功能化的多孔聚丙烯酸酯树脂，如聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯和聚甲基丙烯酸甲酯树脂均购于南开大学化工厂，多胺功能基与树脂通过树脂表面的氨基进行共价连接，具体方法参照申请者的中国发明专利CN105195114A，主要步骤如下所述：

[0034] 步骤一：将10ml树脂分散于4ml四氢呋喃中，然后将50mg多胺功能基溶于少量四氢呋喃并滴加于前述溶液中，室温反应48小时，过滤，水洗，得到带有多胺功能基的树脂；

[0035] 步骤二：取步骤一制备的树脂10ml，加入10mM N,N-二异丙基乙胺1ml，醋酐1.5ml，室温反应8小时，过滤，然后溶于6ml甲醇中，在冰浴下滴加6M盐酸甲醇溶液4ml，室温反应2小时，过滤，水洗，最终得到吸附剂。采用扫描电子显微镜对吸附剂进行观察，结果如图1～6所示。

[0036] 实施例2：吸附剂的机械强度检测

[0037] 2.1实验方法：称取60g吸附剂，置于1000ml搅拌容器中，加入去离子水至260ml，开启电动搅拌，以1000转/分钟的转速搅拌20小时后，取上清液用300目滤网过滤，采用浊度仪检测滤液浊度，显微镜观察吸附剂表面磨损情况。

[0038] 2.2实验结果：经检测，基于聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯或聚甲基丙烯酸甲酯树脂的吸附剂的滤液浊度值均小于200NTU，显微镜观察吸附剂表面没有磨损的迹象，表明吸附剂具有较好的强度。

[0039] 实施例3：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂对内毒素的吸附性能试验

[0040] 3.1实验方法：(1)试验血液的准备：抽取犬静脉血(成年健康比格犬)，加入含有肝素钠抗凝剂的采血管(规格13×100mm，采血量5ml)中，每管5ml，作为抗凝犬血液(下同)。然后，每毫升抗凝犬血液加入内毒素(购于Sigma-Aldrich公司)1μg，备用；(2)吸附过程：量取1ml吸附剂置于锥形瓶中，加入含内毒素的试验血液10ml，放入恒温振荡器中，37℃振荡吸附2小时后取出锥形瓶，吸取血液样本，离心分离收集血浆，按照《中国药典》2015年版二部细菌内毒素检查法，采用鲎试剂(动态浊度法)分别检测吸附前、后内毒素的含量；(3)计算：
吸附率按如下公式计算：

[0041] A(％)＝(L0-Lt)/L0×100％

[0042] 式中：A为吸附率；L0为吸附前内毒素含量(EU/ml)；Lt为吸附后内毒素含量(EU/ml)。

[0043] 3.2实验结果：吸附前内毒素含量为191EU/ml，经吸附剂吸附后内毒素含量为38EU/ml，吸附率为80％。

[0044] 实施例4：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂对细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA和酵母多糖的吸附性能试验

[0045] 4.1实验方法：(1)试验血液的准备：取抗凝犬血液10ml，每毫升血液分别加入细菌DNA(购于上海生工生物工程股份有限公司)、肽聚糖(购于Invivogen公司)、细菌脂蛋白(购于Invivogen公司)、脂磷壁酸(购于Invivogen公司)、病毒RNA(购于Invivogen公司)或酵母多糖(购于Sigma-Aldrich公司)10μg，备用；(2)吸附过程：量取1ml吸附剂置于锥形瓶中，加入含细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA或者酵母多糖的试验血液10ml，放入恒温振荡器中，37℃振荡吸附2小时后取出锥形瓶，吸取血液样本，离心分离收集血浆，将血浆加入RAW264.7细胞中，孵育12小时后，取细胞培养液上清，用ELISA检测试剂盒(购于eBioscience公司)分别检测吸附前、后上清液中TNF-α的浓度(具体方法可参照申请者的中国发明专利CN105195114A)；(3)计算：细胞在细菌DNA等刺激下会产生细胞因子TNF-α，通过比较吸附前、后刺激细胞产生的TNF-α的浓度，将TNF-α的下降水平折算为吸附率，以此来评价吸附剂对细菌DNA等的吸附性能。吸附率按如下公式计算：

[0046] C(％)＝(C0-Ct)/C0×100％

[0047] 式中：C为吸附率；C0为吸附前刺激细胞产生的TNF-α浓度(pg/ml)；Ct为吸附后刺激细胞产生的TNF-α浓度(pg/ml)。

[0048] 4.2实验结果：含有细菌DNA、肽聚糖、细菌脂蛋白、脂磷壁酸、病毒RNA或酵母多糖的血液经吸附剂对处理后，对细胞的刺激作用(释放的TNF-α)较吸附前明显下降(表1)，表明吸附剂对上述分子具有显著的吸附作用。

[0049] 表1吸附剂对细菌DNA等病原体相关分子模式的吸附作用

[0050]

[0051] 实施例5：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂对细胞因子的吸附性能试验

[0052] 5.1实验方法：(1)试验血液的准备：取抗凝犬血液10ml，每毫升血液分别加入TNF-α或IL-6(购于eBioscience公司)2ng，备用；(2)吸附过程：量取1ml吸附剂置于锥形瓶中，加入含TNF-α或者IL-6的试验血液10ml，放入恒温振荡器中，37℃振荡吸附2小时后取出锥形瓶，吸取血液样本，离心分离收集血浆，用ELISA检测试剂盒(购于eBioscience公司)分别检测吸附前、后TNF-α和IL-6的浓度。另取中国发明专利CN105195114A中所述的吸附剂MTAM01P同法处理，作为对照组；(3)计算：吸附率按如下公式计算：

[0053] P(％)＝(S0-St)/S0×100％

[0054] 式中：P为吸附率；S0为吸附前的TNF-α浓度(pg/ml)；St为吸附后的TNF-α浓度(pg/ml)。

[0055] 5.2实验结果：吸附剂对TNF-α的吸附率达97％，对IL-6的吸附率达98％，具有显著的吸附作用，而吸附剂MTAM01P则几乎没有吸附作用(表2)。

[0056] 表2吸附剂对TNF-α和IL-6的吸附作用

[0057]

[0058] 实施例6：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂对血浆总蛋白的吸附试验

[0059] 6.1实验方法：量取1ml吸附剂置于锥形瓶中，加入抗凝犬血液10ml，放入恒温振荡器中，调节温度为37℃，振荡频率100次/分钟，振荡吸附2小时后取出锥形瓶，室温下静置，取样，采用全自动生化仪分别检测吸附前、后血浆总蛋白浓度。吸附率按如下公式计算：

[0060] T(％)＝(N0-Nt)/N01×100％

[0061] 式中：T为吸附率；N0为吸附前蛋白浓度(g/L)；Nt为吸附后蛋白浓度(g/L)。

[0062] 6.2实验结果：吸附前血浆总蛋白浓度为52.6g/L，吸附后血浆总蛋白浓度为48.3g/L，吸附率为8.2％，表明吸附剂对血浆中总蛋白只有少量吸附(通常吸附剂对总蛋白的吸附率应小于15％)。

[0063] 实施例7：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂的溶血性能检测

[0064] 7.1实验方法：在洁净锥形瓶中加入2ml吸附剂和10ml 0.9％氯化钠注射液，以37℃、200转/分钟振荡24小时制备浸提液。取8支洁净玻璃试管，分为4组，每组2支，每组分别加入0.9％氯化钠注射液(阴性对照)10ml、超纯水(阳性对照)10ml、吸附剂浸提液10ml以及吸附剂2ml。取抗凝犬血液加入试管中，每支0.2ml，轻摇混匀后置于37℃水浴加热60分钟，再以3000转/分钟离心5分钟，然后加入比色皿中，在545nm波长处测定吸光度，以超纯水为空白校正。溶血率按以下公式计算：

[0065] H(％)＝(As–An)/(Ap–An)×100％

[0066] 式中：H为溶血率；As为样品的吸光度；An为阴性对照组的吸光度；Ap为阳性对照组的吸光度。

[0067] 7.2实验结果：无论是以吸附剂的浸提液还是吸附剂直接与血液接触，溶血率仅分别为1.10％和1.88％(表3)，表明吸附剂无明显的溶血作用(通常吸附剂的溶血率应不高于5％)。

[0068] 表3吸附剂的溶血作用

[0069]

[0070] 实施例8：聚丙烯酸乙酯树脂吸附剂对血液成分的影响

[0071] 8.1实验方法：取犬静脉血2ml，分别加入2支血常规采血管中，每支1ml。一支作为空白对照，另一支加入0.1ml吸附剂，轻摇混匀后置于37℃水浴加热60分钟，然后采用全自动血细胞计数仪进行检测。

[0072] 8.2实验结果：与吸附剂接触后，血中白细胞、红细胞等主要成分略有下降(表4)，但无统计学差异(p>0.05)，表明吸附剂对血液成分没有显著影响。

[0073] 表4吸附剂对血液成分的影响

[0074]

[0075]

[0076] 上述实施例表明，本发明的吸附剂对PAMP和炎症细胞因子具有广谱的吸附作用，可以从血中有效的清除这些致病因子。吸附剂机械强度好，表明在使用时不会轻易发生破碎或微粒脱落。同时，还具有良好的血液相容性，表明安全性好。因此，本发明的吸附剂适用于脓毒症等体内存在过量PAMP和炎症细胞因子的患者的血液净化治疗。