一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开的枯草芽孢杆菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E66，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16426，保藏日期2018年9月5日。本发明的枯草芽孢杆菌具有对稻瘟病的广谱且高效的防效，可用于各种品系水稻的稻瘟病防治，尤其是叶瘟和穗颈瘟的防治。

权利要求

1.一株枯草芽孢杆菌E66，其特征在于，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E66，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16426，保藏日期2018年9月5日。

2.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌E66。

3.一种防治稻瘟病的方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌E66或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌剂为所述枯草芽孢杆菌E66的培养液。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

6.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌E66或如权利要求2所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

说明书

一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。

背景技术

[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物，栽培面积仅次于小麦和玉米。水稻产量占据世界粮食总产量的1/4以上，占据中国粮食总产量一半以上，全世界有一半以上人口的口粮作物是水稻。

[0003] 稻瘟病(Rice Blast)是世界上主要的水稻病害之一，是由子囊菌Magnaporthe oryzae(.T.T Hebert)Yaegashi&Udagawa(无性态：Pyricularia oryzae)引起的一种突发性强、易于流行的水稻重要病害之一，是世界性真菌病害。稻瘟病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。稻瘟病分布广泛，全球85个国家均有发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病在全球每年造成10-30％的水稻产量损失，每年的产量损失可以养活全世界6千万人口。目前对该稻瘟病菌的防治主要采用抗瘟品种的利用和化学药剂为主，由于稻瘟病菌生理小种易产生变异、抗病品种易退化及长期化学防治易产生抗药性，长期使用不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加农产品有毒化学物质的残留量，对世界食品安全带来极大的威胁，直接危害人类健康。因此，探索新的、有效的防治途径具有重要意义。

[0004] 从1980年代起，芽孢杆菌作为生防制剂开始应用于农业生产中，采用芽孢杆菌(Bacillus)作为高效绿色杀菌剂防治稻瘟病已经成为水稻生产中的一个重要手段。芽孢杆菌最能体现生物防治的特点，它的作用靶标或对病原菌的作用一般都是多因子的，或称多效的，故不易使靶标菌产生抗药性。Taguchi等(2003)研究报道枯草芽孢杆菌IK-1080的培养滤液，可以减轻叶瘟的发生率7.70-13.80％，减少产量损失52.20-73.50％。刘波微等(2006)进行了枯草芽孢杆菌Xi-55的田间药效试验，其发酵液在四川浦江和洪雅县田间最高防治效果分别为73.95％和81.15％，平均增产10.71％。张芬等(2011)报道枯草芽孢杆菌T429的发酵液温室盆栽防治效果达到69.40％。Meng等(2015)将枯草芽孢杆菌T429制成粉剂，当使用浓度是50-75g/667m2时，对稻瘟病的田间防治效果在77.6％-78.5％，田间防治效果比枯草芽孢杆菌T429水剂提高了8.0％以上。沙月霞等(2016)从水稻叶片分离的枯草芽孢杆菌SYX04和SYX20发酵液对叶瘟的防治效果是71.5％-85.1％，对穗瘟的防治效果是63.5％-85.6％。

[0005] 由此可见，枯草芽孢杆菌防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足联合国世界粮食组织关于粮食安全发展的要求，对于减少化学农药的使用和农田生态环境的改善具有重要意义，但是本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有广谱且高效防效的枯草芽孢杆菌菌株。

发明内容

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌[0007] 根据本发明的一个方面，提供一株枯草芽孢杆菌E66，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E66，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16426，保藏日期2018年9月5日。

[0008] 根据本发明的另一个方面，提供一种菌剂，包含枯草芽孢杆菌E66。

[0009] 根据本发明的又一个方面，提供一种防治稻瘟病的方法，其包括枯草芽孢杆菌E66或枯草芽孢杆菌E66菌剂施用于水稻作物。

[0010] 可选择地，枯草芽孢杆菌E66菌剂为枯草芽孢杆菌E66的培养液。

[0011] 可选择地，稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

[0012] 根据本发明的再一个方面，提供一种枯草芽孢杆菌E66或枯草芽孢杆菌E66菌剂在防治稻瘟病中的用途。

[0013] 可选择地，稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

[0014] 本发明的有益技术效果为：

[0015] 1、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌属于植物内生菌，防治效率更高，这体现在可用更少的芽孢量获得相似或更好的防效。

[0016] 2、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌具有更广谱的防治效果，其对我国南方和北方不同品系的水稻均有很好的叶瘟和/或穗颈瘟防治效果。

[0017] 3、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌对水稻叶瘟和穗颈瘟的防治效果较好。

[0018] 4、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌对水稻促生、促产效果较好。

[0019] 5、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌对多种植物病原菌具有良好的拮抗作用。

[0020] 保藏信息

[0021] 本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)E66，已于2018年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.16426。

附图说明

[0022] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0023] 图1是本发明的枯草芽孢杆菌E66菌株在LB培养基平板上的培养形态。

[0024] 图2是本发明的枯草芽孢杆菌E66菌株与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

[0025] 图3本发明的枯草芽孢杆菌E66与多种植物病原菌的平板对峙图片。

[0026] 图4是本发明的枯草芽孢杆菌E66发酵培养液对稻瘟病菌侵染结构抑制的图片。

[0027] 图5是本发明的枯草芽孢杆菌E66无菌上清液抑制后的稻瘟病菌P131菌丝和分生孢子的图片。

[0028] 图6是本发明的枯草芽孢杆菌E66菌株生防活性物质检测图片。

[0029] 图7是本发明的枯草芽孢杆菌E66产生的挥发性物质对稻瘟病菌P131的抑制图片。

具体实施方式

[0030] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征向量可以相互任意组合。

[0031] 实施例1：枯草芽孢杆菌E66的分离及筛选

[0032] ①样品采集：采集样品为水稻品种宁粳50号，地点为宁夏回族自治区灵武市梧桐树乡。连同水稻的根系一起拔出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。

[0033] ②分离方法：选取健康水稻植株根、茎和叶片，称取1g，放入1％次氯酸钠浸泡10min，70％酒精中浸泡1min，表面消毒处理3次，加入无菌水反复清洗(至少10次)。取最后一次冲洗液100μL涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)平板上，28℃恒温培养箱中培养
72h，检测表面消毒效果。表面消毒后的根、茎和叶段在无菌研钵中磨成匀浆(加入少量无菌水)，然后梯度稀释，吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基平板上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h。挑取单菌落，在NA固体培养基平板上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于40％甘油中，于﹣80℃超低温冰箱中保存备用。

[0034] ③芽孢杆菌的筛选：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，生长4d后在菌饼两侧相距2cm处接种芽孢杆菌菌饼作对峙培养，设置空白对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。2d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图2。

[0035] 肉汤培养基(NA)：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH 7.3±0.1，121℃灭菌20min。

[0036] 番茄燕麦培养基：燕麦片30g，加水1000mL，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后，加入150mL番茄汁，加水补足1000mL，加琼脂粉17-20g后分装灭菌(121℃，20min)。

[0037] 经鉴定，该枯草芽孢杆菌菌株特征如下：菌落粗糙，不规则圆形，菌落外缘呈现放射状波纹，白色，不透明，无润泽度。革兰阳性菌，芽孢杆状，0.7-0.8×2.0-3.0微米，单个或链状排列，着色均匀，无荚膜，运动。

[0038] 发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2018年9月5日，保藏编号为CGMCC NO.16426。

[0039] 实施例2：枯草芽孢杆菌E66菌株的生物活性测定：

[0040] (1)芽孢杆菌E66发酵培养液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，菌饼两侧相距3cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入芽孢杆菌的发酵液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1和图2。

[0041] (2)芽孢杆菌E66无菌上清液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，菌饼两侧相距3cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入芽孢杆菌的无菌上清液作对峙培养，以无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设10皿重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带。

[0042] LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.4-7.6，121℃灭菌30min。LB固体培养基：在液体培养基基础上加入15g琼脂粉。

[0043] 菌株无菌上清液的制备：将已活化24h的供试菌株E66单菌落分别接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm/min振荡培养72h后，发酵培养液在4℃、10000rpm/min离心20min去除菌体，上清液经过滤(0.22μm)除菌，即得无菌上清液。

[0044] 表1芽孢杆菌E66菌株与稻瘟病菌的对峙培养

[0045]

[0046] 注：表中的实验数据为三次重复的平均值(±标准误)。

[0047] (3)芽孢杆菌E66菌株在温室盆栽条件下的生防效果：挑选健康水稻品种G19，1％次氯酸钠溶液消毒10min，75％酒精冲洗3次，无菌水冲洗5次，28℃人工气候箱催芽，待芽长到1cm时播种于塑料小水桶里(水桶底部直径18cm×高21cm×水桶上部直径24.5cm)。种植8
28d后喷施待测芽孢杆菌发酵液，芽孢浓度为1×10CFU/mL，每个水桶喷施20mL，每个处理4个重复。24h后接种稻瘟病菌孢子悬浮液，孢子浓度为1×106CFU/mL。7d后调查叶瘟发生情况，计算病情指数和防效大小，结果见表3。

[0048] 稻瘟病叶瘟室内调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准(表2)(枯草芽孢杆菌等生物农药对寒地水稻稻瘟病的防治效果.农药,52(2):132-135，2013.)。

[0049] 表2为稻瘟病叶瘟室内调查分级标准

[0050]

[0051]

[0052] 生防效果计算公式：

[0053]

[0054]

[0055] 表3芽孢杆菌E66在温室条件下对叶瘟的防治效果测定

[0056]处理 病情指数 防治效果(％)
E66 5.18±1.05b 76.57±1.15a
三环唑 4.88±1.14b 77.91±1.43a
绿地康 3.42±0.52b 84.51±0.69a
清水对照 22.09±2.43a /

[0057] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0058] (4)芽孢杆菌E66菌株的田间防治效果试验

[0059] 在宁夏回族自治区平罗县姚伏镇小店子村金富源合作社水稻种植基地进行芽孢杆菌E66的田间药效试验，试验菌株芽孢量是1×108CFU/mL，平均每个试验小区面积是50m2，4个重复小区，分别调查芽孢杆菌E66对叶瘟和穗颈瘟的防治效果。

[0060] 调查方法按《农药田间药效试验准则》，稻瘟病叶瘟调查分级标准是：0级：无病；1级：仅有针尖大小的褐点；3级：小而圆以致稍长的褐色坏死灰斑，直径1-2mm；5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10％；7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为26％-50％；9级：全面叶片死亡。

[0061] 穗颈瘟调查分级标准，0级：无穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟；1级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数＜5％；2级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为6％-10％；3级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为11％-20％；4级：有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为21％-30％；5级：有穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为
21％-30％；6级：穗颈瘟造成瘪粒数＞80％。结果见表4。

[0062] 生防效果计算公式：

[0063]

[0064]

[0065] 表4芽孢杆菌E66菌株对稻瘟病的田间防治效果

[0066]

[0067] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。水稻品种为宁粳47号。

[0068] (5)芽孢杆菌E66菌株对水稻秧苗的促生能力：选取健康且长势一致的水稻种子G19放入芽孢杆菌E66的发酵培养液中浸种1h后取出放在铺有滤纸的培养皿内，在28℃，RH为70％的人工气候箱培养，48h后调查种子露白数量。每个处理重复3皿。取健康且长势一致的水稻种子放入芽孢杆菌E66的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，生长1个月后调查水稻秧苗的根长和株高，结果见表5。

[0069] 表5芽孢杆菌E66对水稻秧苗的促生能力

[0070]

[0071] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0072] (6)芽孢杆菌E66菌株对多种植物病原菌的拮抗作用：

[0073] 在PDA培养基平板上中央放置尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeospoioides)、苹果叶枯病菌(Alternaria alternate)、海棠叶枯病菌(A.alternate)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、草莓叶枯病菌(A.alternate)、小麦立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的菌饼(1cm)，分别在菌落边缘两侧相距2cm处接种芽孢杆菌E69(划线2mm)，置于培养箱28℃黑暗培养，5次重复。2-5天后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表6。

[0074] 表6芽孢杆菌E66菌株对多种植物病原菌的拮抗作用

[0075]

[0076] (7)芽孢杆菌E66菌株对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：

[0077] 菌株E66发酵培养液对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：培养72h的供试菌株无菌上清液与稻瘟病菌P131孢子悬浮液(1×106CFU/mL)以1∶1的比例混匀，混合液在2mL无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用激光共聚焦显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见图4。

[0078] 菌株E66无菌上清液对稻瘟病菌侵染结构的抑制作用：培养72h的供试菌株无菌上6
清液与稻瘟病菌P131孢子悬浮液(1×10CFU/mL)以1∶1的比例混匀，混合液在2mL无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，采用激光共聚焦显微镜观察稻瘟病菌的菌丝、分生孢子以及附着胞的形态变化。结果见图5。

[0079] (8)芽孢杆菌E66菌株生防活性物质检测

[0080] 淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含有0.2％可溶性淀粉的LB平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色10min，用70％乙醇洗板，能产生淀粉酶的菌株，在黑色的背景下，其菌落生长处周围可形成无色的透明圈，如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理3个重复，结果见表7。

[0081] 蛋白酶的检测：将活化的待测菌株穿刺接种于1％脱脂牛奶琼脂平板上，30℃培养24、48、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有蛋白酶的产生，每个处理3个重复，结果见表7。

[0082] 葡聚糖酶检测：待测菌接种于含有ABP培养基的平板上，30℃培养48、72h后，观察平板中是否出现消解圈，若有消解圈产生则表明有葡聚糖酶的产生，每个处理3个重复，结果见表7。

[0083] 嗜铁素检测：嗜铁素用CAS培养基检测，将活化的待测菌接种于CAS检测培养基平板上，30℃培养72h后，观察平板中是否产生橘黄色晕圈，若出现橘黄色则表明有嗜铁素的产生，每个处理重复3次，结果见表7。

[0084] 纤维素酶的检测：将分离到的菌株活化后接种于纤维素筛选培养基平板上，28℃恒温倒置培养2d，用0.1％的刚果红染色液浸染10min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶，则会在菌落周围出现清晰的透明圈，每个处理重复3次，结果见表7。

[0085] 挥发性物质的检测：在番茄燕麦培养基平板中央接种一片直径1cm的稻瘟病菌P131菌块，在另一个同样大小的NA培养基平板上涂布培养E69菌株，将前者反扣于后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以未涂布E69菌株的NA平板作空白对照，于28℃下恒温培养6d后，分别测量涂布E69菌株和对照培养的稻瘟病菌菌落直径，计算相对抑制率。每个处理5个重复，结果见表7和图7。

[0086]

[0087] ABP培养基的制作：用研钵将块状茯苓研碎成粉末，使其可通过120目的筛子，KH2PO4 6.8g，K2PHO4·12H2O 17.9g，酵母提取物6.7g，茯苓粉(或β-1.3-葡聚糖)5.0g，苯胺蓝120mg，琼脂粉12g，H2O 1L，pH值为6.8，水1L。

[0088] CAS培养基的制备：酪胨9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1L水中。

[0089] 纤维素富集培养基(1L):NaCI 6g,MgS04 0.1g,KH2P04 0.5g,CaC12 0.1g,(NH4)S04 2.0g,K2HP04 2.0g，琼脂15g,CMC-Na 5g，pH调至7.0；纤维素筛选培养基(1L):在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。

[0090] 刚果红染色液:用蒸馏水溶解刚果红，终浓度为0.1％(w/v)。

[0091] 刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCI溶液。

[0092] 表7芽孢杆菌E66菌株生防活性物质检测

[0093]

[0094] 注：数据为三次重复的检测结果；“+”是检测出结果，“-”是未检测出[0095] 需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

[0096] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。