降解多环芳烃-芘的厌氧型菌株及其筛选方法和应用

摘要

本发明涉及一株厌氧菌株Clostridium sp.LZ25及其处理工业污染物中多环芳烃中的应用；根据其生理生化特性及16S rDNA序列将其鉴定为梭菌属，保藏编号为：CGMCC NO:15046。菌株Clostridium sp.LZ25为厌氧型微生物，在含芘浓度为50mg/L的无机盐液体培养基中培养30d对芘的降解效率达45％；其对芘的降解率随接菌量的增加而升高，随初始浓度的升高而减少，同时对pH和温度的适应性较大。本发明基于代谢产物推测出Clostridium sp.LZ25厌氧降解芘的代谢途径，对含有多环芳烃类化合物的污染物的治理具有重要的应用价值。

权利要求

1.一株厌氧菌株，其特征在于，分类命名为Clostridium sp.LZ25，保藏编号为：CGMCC NO:15046。

2.权利要求1所述的Clostridium sp.LZ25的鉴定方法，其特征在于，根据Biolog微生物自动分析系统对Clostridium sp.LZ25的94种生化表型进行测试初步鉴定，利用通用引物扩增菌株Clostridium sp.LZ25的16S rDNA部分序列，将所获得的片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株Clostridium sp.LZ25鉴定至属。

3.权利要求1所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用。

4.根据权利要求3所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用，其特征在于，具体步骤如下：(1)菌株Clostridium sp.LZ25种子液培养：菌株Clostridium sp.LZ25种子液采用LB液体培养基，取平板保藏的菌株Clostridium sp.LZ25，在厌氧操作台用接种环挑取菌落接入含有LB液体培养基的厌氧瓶中振荡培养，菌体离心后收集种子液体浓缩物作为降解种子液；

(2)菌株Clostridium sp.LZ25降解芘：在含有芘的污染物中加入无机盐培养基，接入步骤(1)得到的种子液，厌氧条件下进行降解反应。

5.根据权利要求4所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用，其特征在于，步骤(2)中接入种子液量为1％-20％。

6.根据权利要求4所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用，其特征在于，步骤(2)中反应的pH值为4.8-9.6。

7.根据权利要求4所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用，其特征在于，步骤(2)中反应温度范围在22℃-50℃之间。

8.根据权利要求4所述的厌氧菌株Clostridium sp.LZ25在芘生物降解过程中的应用，其特征在于，步骤(2)中反应底物芘浓度范围在50mg/L-200mg/L之间。

说明书

降解多环芳烃-芘的厌氧型菌株及其筛选方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于受污染污泥与污水的生物降解处理技术领域，具体涉及一种降解多环芳烃-芘的厌氧菌株及其筛选、鉴定及应用。

背景技术

[0002] 芘是多环芳烃(PAHs)的一种，由于高致癌性，致突变性和致畸性，长期以来一直被列为美国环境保护局所列的优先控制有机污染物。多环芳烃作为环境中最普遍的持久性有机污染物之一，主要形成于化石燃料燃烧、生物质燃烧和原油释放、石油和煤焦油产品。释放到环境中的多环芳烃可以主要通过许多方法去除，包括挥发、光氧化、化学氧化、生物累积、生物降解和吸附。其中，生物降解是去除多环芳烃的最彻底和危害最小的方法，已成为污染治理的主要研究方向。

[0003] 在探求多环芳烃降解的过程中，筛选分离出高效降解菌株是多环芳烃微生物降解技术的关键。相对于低分子量的PAHs，四环及四环以上的高分子量(HMW)PAHs由于其分子结构复杂、难于被氧化、水溶性差等很难筛选出高效降解的菌株。芘是一种具有对称结构的四环芳烃，因其丰富性及其与其他高分子量多环芳烃的结构相似性，是研究高分子量多环芳烃生物降解的良好模型化合物。目前发现能够在有氧条件下降解PAHs的典型细菌有很多种，并且对2-5环多环芳烃的好氧降解机制进行了研究。尽管PAHs在有氧条件下的降解途径被广泛提出，但是探索厌氧降解途径的研究有限，特别针对高分子量PAHs。因此，对四环及四环以上的PAHs的研究目前还一直是研究的热点，特别是对四环及四环以上的PAHs的降解途径仍需深入探究。

发明内容

[0004] 发明目的：

[0005] 1、针对工业污泥及污水中含有较高浓度有毒有机污染物多环芳烃去除成本高、不彻底的问题，提供一种降解多环芳烃-芘的厌氧菌株和筛选方法，以及在形态特征、生理生化和分子水平上对芘降解菌株进行鉴定。

[0006] 2、提供一种该厌氧菌株在芘降解处理过程中的应用。

[0007] 技术方案：

[0008] 所述高效降解芘的厌氧微生物为梭状芽孢杆菌，其分类命名为Clostridium sp.LZ25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO:15046，保藏日期为：2017年12月11日，保藏地址为：中国.北京.中国科学院微生物研究所。

[0009] 本发明所述的Clostridium sp.LZ25的筛选方法：在以芘为唯一碳源的无机盐培养基中，从含油石化污泥中对芘降解菌株进行分离筛选。

[0010] 具体地，以含油石化污泥中的菌群为筛选目标，利用含芘的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化具有芘利用能力的厌氧菌株，将富集培养基稀释涂布至LB固体培养基厌氧培养，挑取形态不同的芘降解菌株进行划线分离获得纯培养，挑选其中对芘降解效率最高的菌株，即为Clostridium sp.LZ25。

[0011] 更为具体的步骤如下；

[0012] (1)以含多环芳烃石化污泥菌群作为筛选目标，取新鲜的污泥在生理盐水中振荡；

[0013] (2)向经灭菌的厌氧瓶中加入已过有机滤膜的芘丙酮溶液，开口放置过夜除去丙酮；

[0014] (3)在氮气气氛下向步骤(2)中的厌氧瓶中加入已灭菌的无机盐培养基；

[0015] (4)将步骤(1)中的悬液，以10％的接种量接入步骤(3)中以芘为唯一碳源的无机盐培养基中，恒温振荡培养；然后再次转接到含芘的无机盐培养基中继续培养；如此重复，直到培养基中芘浓度为200mg/L；

[0016] (5)将最后一次的培养液稀释并涂布到LB平板培养基上厌氧培养，平板反复画线分离，直至得到纯种菌Clostridium sp.LZ25。

[0017] 具体地，所述的无机盐培养基是由NaCl 24g/L、KCl 0.7g/L、MgSO4·7H20 0.7g/L、NH4Cl 1g/L、NaNO3 0.5g/L、KH2PO4 2g/L、Na2HPO4 3g/L，加水至1.0L配制，pH值6.5-7.5。LB培养基：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L。调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂15～20g/L、121℃灭菌20min。

[0018] 本发明所述的Clostridium sp.LZ25的鉴定方法：

[0019] Clostridium sp.LZ25在LB固体培养基上生长较快，30℃，72h可形成直径为1mm的黄色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明，菌体呈长杆状(1.02×2.0μm)。Biolog微生物自动分析系统对Clostridium sp.LZ25的94种生化表型进行测试，并鉴定菌种。在94个表型测试中分析了71个碳源利用测定和23个化学敏感性测定。由微量分析系统GENIII MicroPlateBiolog确定重要的生物化学特征如表1所示。其中Clostridium sp.LZ25可有效利用9种碳源，包括糊精、棉籽糖、D-山梨酸、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、α-丁酮酸和乙酰乙酸。同时化学敏感性测试中，对5种化学物质敏感，其中包括1％乳酸钠和萘啶酸，并且在pH6、1％NaCl和4％NaCl下都可以很好的生长。菌株LZ25生理生化鉴定的结果与梭状芽孢杆菌属的特征最为接近。

[0020] 具体地，将获得的纯培养物接种至Biolog所推荐的BUG培养基上，在IF-A接种液中制备菌悬液，在Biolog读数仪上读取微孔板数据，重复3次读数，最终再与数据库比对鉴定。

[0021] 所述的芘降解菌株Clostridium sp.LZ25分子水平上鉴定方法：利用通用引物扩增菌株LZ25的16S rDNA部分序列。将所获得的片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株LZ25鉴定至梭状芽孢杆菌属。

[0022] 所述的16S rDNA PCR扩增条件如下(所用酶为ExTaq)：95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸90s、30个循环、72℃延伸5min，1.0％的琼脂糖凝胶电泳确认扩增的16S rDNA片段。

[0023] 本发明还涉及所述的厌氧菌株Clostridium sp.strain LZ25(以下亦简称为LZ25)在芘降解处理过程中的应用，具体步骤如下：

[0024] (1)菌株Clostridium sp.Z25种子液培养：菌株Clostridium sp.LZ25种子液采用LB液体培养基，取平板保藏的菌株Clostridium sp.LZ25，在厌氧操作台用接种环挑去菌落接入含有LB液体培养基的厌氧瓶中振荡培养，菌体离心后收集种子液体浓缩物作为降解种子液；

[0025] (2)菌株Clostridium sp.LZ25降解芘：在含有芘的污染物中加入无机盐培养基，接入步骤(1)得到的种子液，厌氧条件下进行降解反应。

[0026] 所述的步骤(2)中的厌氧条件下进行降解反应，接入种子液量为1％-20％，优选为5-20％。

[0027] 所述的步骤(2)中的厌氧条件下进行降解反应，反应的pH值为4.8-9.6，优选的pH值为6.0-8.4。

[0028] 所述的步骤(2)中的厌氧条件下进行降解反应，反应温度范围在22℃-50℃之间，优选为30-40℃。

[0029] 所述的步骤(2)中的厌氧条件下进行降解反应，反应底物芘浓度范围在50mg/L-200mg/L之间，优选为50-100mg/L。

[0030] 根据芘降解菌株Clostridium sp.LZ25在培养过程中降解芘所产生的中间代谢产物，推测出菌株降解芘的代谢途径，具体步骤如下：

[0031] (1)芘降解菌株Clostridium sp.LZ25在最优条件下培养40d，每隔10d通过液相色谱测定培养物中芘残留量。

[0032] (2)选取芘降解率相对较高的体系，通过气质联用分析芘降解过程中的中间代谢产物。

[0033] (3)在中间代谢产物中，选用具有代表性的有机物作为底物，检测菌株对其的降解率，并分析代谢产物。

[0034] (4)综合分析中间代谢产物，根据分子结构分析菌株降解芘的代谢途径。

[0035] 本发明的有益效果：本发明的厌氧菌Clostridium sp.LZ25能够在厌氧条件下对多环芳烃，特别是芘进行降解，且具有较高的降解效率，应用于工业污泥及污水的处理中，为解决较高浓度有机污染物多环芳烃去除成本高、不彻底的问题提供了一种切实可行的方法。具体包括：

[0036] 1、该菌株对芘的厌氧降解效率高，随着接种量的增大，芘的降解速率明显增加。

[0037] 2、菌株LZ25在降解芘时对温度的适应范围较宽，能适应较为宽的pH范围和芘的浓度范围。

[0038] 3、本发明对于含有多环芳烃类化合物的污染物的治理上具有重要的应用价值。

附图说明

[0039] 图1基于16S rDNA基因序列同源性的Clostridium sp.LZ25系统发育树；

[0040] 图2菌株LZ25的芘降解曲线及其生长曲线；

[0041] 图3a菌株LZ25的芘降解特性，接种比对菌株LZ25降解芘的影响；

[0042] 图3b温度对菌株LZ25降解芘的影响；

[0043] 图3c pH对菌株LZ25降解芘的影响；

[0044] 图3d底物初始浓度对菌株LZ25降解芘的影响；

[0045] 图4 Clostridium sp.LZ25对芘降解中间产物的GC-MS分析；

[0046] 图5 Clostridium sp.LZ25对菲降解曲线；

[0047] 图6 Clostridium sp.LZ25对菲降解的中间产物的GC-MS分析；

[0048] 图7 Clostridium sp.LZ25对芘厌氧降解的途径。

具体实施方式

[0049] 下面对本发明的具体实施方式进行详细说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。

[0050] 下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法，所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。

[0051] 实施例一

[0052] 芘降解菌株Clostridium sp.LZ25的分离筛选：

[0053] (1)以含多环芳烃石化污泥菌群作为筛选目标，取新鲜的污泥10g与100mL 0.85％的生理盐水中振荡20min。

[0054] (2)向经121℃灭菌20min的厌氧瓶中加入已过0.22μm有机滤膜的芘丙酮溶液，为除去丙酮将厌氧瓶开口放置过夜。

[0055] (3)在充满氮气的厌氧操作台中向步骤(2)中容积为100mL或200mL的厌氧瓶中加入50mL或100mL已灭菌的无机盐培养基(pH＝6.5-7.5)，并加入0.1％刃天青溶液作为氧指示剂和半胱氨酸作为除氧剂，最后冲入氮气封口。其中无机盐培养基：NaCl 24g/L、KCl0.7g/L、MgSO4·7H20 0.7g/L、NH4Cl 1g/L、NaNO3 0.5g/L、KH2PO4 2g/L、Na2HPO43g/L；其中芘浓度为20mg/L-200mg/L。LB培养基：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L。LB培养基中加入琼脂15～20g/L制成LB平板培养基。以上培养基均使用高压蒸汽灭菌锅在121℃条件下灭菌20min。

[0056] (4)将步骤(1)中的悬液，以10％的接种量接入步骤(3)中的以芘(10mg/L)为唯一碳源的无机盐培养基中，恒温30℃振荡速率为180r/min培养7d。然后再次转接到20mg/L的PAHs无机盐培养基中，继续培养。如此重复，直到培养基中PAHs浓度为200mg/L。

[0057] (5)将最后一次的培养液进行10-1到10-9梯度稀释并涂布到LB平板培养基上，经过厌氧培养袋培养，30℃厌氧培养3d，挑选出生长迅速、丰富的单菌落，进行平板反复画线分离，直至得到纯种菌。为防止芘被光解，上述步骤均在暗室培养箱中操作。

[0058] (6)划线分离获得纯培养菌株，挑选其中对芘降解效率最高的菌株，命名为菌株LZ25。

[0059] (7)将菌株LZ25接种于以50mg/L芘为唯一碳源的液体无机盐培养基中，于30℃、180r/min摇床培养14d后，破坏性取样，用二氯甲烷萃取后，经旋转蒸发后，用甲醇定容，过
0.22μm有机滤膜，样品用于高效液相色谱检测分析。未接菌的对照培养液中芘的保留时间为7min左右，而接种菌株LZ25并培养14d后，培养液中芘的含量明显下降。

[0060] 实施例二

[0061] 芘降解菌株的鉴定：

[0062] 菌株在LB固体培养基上生长较快，30℃，72h可形成直径为1mm的黄色菌落，菌落边缘整齐，无光泽，突出，粘稠，湿润，光滑，不透明，菌体呈长杆状(1.02×2.0μm)。基于其生理生化特征(表1)及16S rRNA序列，菌株LZ25被鉴定为Clostridium属。最后将同源性高的菌株的碱基序列依次下载后，用clustaLZ进行相似性分析，并用MEGA 4软件采用Neighbor-Joining法构建系统发育树图(图2)。

[0063] Clostridium sp.LZ25可有效利用9种碳源，包括糊精、棉籽糖、D-山梨酸、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、α-丁酮酸和乙酰乙酸。同时化学敏感性测试中，对5种化学物质敏感，其中包括1％乳酸钠和萘啶酸，并且在pH6、1％NaCl和4％NaCl下都可以很好的生长。菌株LZ25生理生化鉴定的结果与梭状芽孢杆菌属的特征最为接近。

[0064] 表1菌株LZ25的生理生化特征测定

[0065]

[0066] 实施例三

[0067] 芘降解菌Clostridium sp.LZ25的降解特性，具体步骤如下：

[0068] (1)菌株LZ25种子液培养：菌株LZ25种子液采用LB液体培养基，取平板保藏的菌株LZ25，在厌氧操作台用接种环挑去菌落接入含有50mL LB液体培养基的厌氧瓶，30℃振荡培养72小时，摇床转速180r/min，获得的菌液以10％接种比重复活化两次后，菌体通过以12 000r/min离心10分钟收集种子液体浓缩物，并重悬于无机盐培养基中，制成OD600nm＝1.5的菌悬液作为降解种子液；

[0069] (2)菌株LZ25降解芘的动力学：在芘初始浓度为50mg/L的无机盐培养基中，按10％接种量接入种子液，于30℃，180r/min震荡培养，每隔一段时间破坏性取样，测定OD600和芘的残留浓度。

[0070] (3)接种量和pH对菌株LZ25降解芘的影响：在芘初始浓度为50mg/L的无机盐培养基中，分别按1％、5％、10％、20％的接种量接入种子液于30℃，180r/min震荡培养；分别于初始pH值4.2、6.0、7.2、8.4、9.6，30℃、180r/min震荡培养，测定接种量和pH值对菌株LZ25降解芘的影响。

[0071] (4)培养温度和底物初始浓度对菌株LZ25降解芘的影响：在芘初始浓度为50mg/L的无机盐培养基中，按10％接种量接入种子液，分别于22℃、30℃、38℃、50℃，pH 7.2，180r/min震荡培养；分别在芘初始浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L的无机盐培养基中，按10％接种量接入种子液，于30℃，180r/min震荡培养，测定培养温度和底物初始浓度对菌株LZ25降解芘的影响。

[0072] 由图2可以看出，菌株LZ25接种到培养基中5d，就开始降解芘，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，到30d后含50mg/L的芘降解至28mg/L左右。另外，从图中还可以看出，随着芘的降解，菌株LZ25的生长量经历了5d的停滞后，开始逐渐增加；当芘降解率达到最大时，菌株LZ25的生长量也达到最大；并且在30d-40d时，菌株LZ25的生长量开始下降。该结果表明菌株LZ25可以利用芘进行生长。

[0073] 随着接种量的增大，芘的降解速率明显增加。当接种量为1％时，芘在30d的降解率为21.2％；而当接菌量达到10％时，芘降解率升高速度减缓，接菌量为10％时，芘降解率为45.3％，接菌量升高至20％时，降解率达到50.0％(图3a)。Clostridium sp.LZ25在pH为7.2和8.4时，对芘的降解率基本相同；而在6.4时，芘的降解率就受到相对抑制；当pH为4.8和
9.6时，芘的降解率仅仅只有10％(图3b)。菌株LZ25在降解芘时对温度的适应范围较宽，在
30℃和38℃之间均具有很好的效果；即使在培养温度为22℃时，芘的降解率也可以达到
29％。此结果说明菌株LZ25产生的降解酶具有较强的温度适应性(图3c)。菌株LZ25对芘的降解速率随着底物浓度的增加而降低。当芘初始浓度为50mg/L时，其在30d的降解率为
45.3％；而当芘初始浓度为200mg/L时，其在30d的降解率仍然可以达到14.2％，说明该菌株对芘具有高效的降解效率(图3d)。

[0074] 实施例四

[0075] 芘降解菌Clostridium sp.LZ25对芘的降解途径：

[0076] 通过GC-MS进行定性分析，深入研究Clostridium sp.LZ25对芘厌氧降解过程中的一系列中间代谢产物。提取样品的色谱图表明，Clostridium sp.LZ25在对芘降解过程中形成了多种代谢产物。

[0077] 从图4中可知，与空白对照相比，Clostridium sp.LZ25的反应体系中在第10d发现了7种物质。13.426、13.169、11.411和13.350min的吸收峰经质谱比对分别为芘(C16H10，CAS：129-00-0)、4,5-二氢芘(C16H12，CAS：6628-98-4)、菲(C14H10，CAS:85-01-8)和1,1'-(1-亚丁烯基)双苯(C16H16，CAS：1726-14-3)；7.409、10.779和23.203min的吸收峰经质谱比对分别是对甲酚(C7H8O，CAS：106-44-5)、原儿茶酚(C7H6O4，CAS：99-50-3)和苯雌酚(C20H26O2，CAS：85-95-0)硅烷化后的产物；苯雌酚、对甲酚和原儿茶酚推测为1,1'-(1-亚丁烯基)双苯的经过多次代谢后的依次产生的产物。接种Clostridium sp.LZ25的反应体系在第20d的代谢产物中发现了另外两种新的代谢产物，色谱停留时间分别为6.575min和7.993min，经质谱比对后鉴定为苯酚(C6H6O，CAS：108-95-2)和苯乙醇(C8H10O，CAS：60-12-
8)硅烷化后的产物。

[0078] 由于在芘的中间代谢产物中发现了菲，我们在培养基中使用菲来进一步研究降解途径。生物降解实验表明，除芘外Clostridium sp.LZ25也可以降解菲。Clostridium sp.LZ25培养40天后，LZ25可降解50mg/L菲的44.4％(图5)。菲的降解时间较长。经过30天的培养，Clostridium sp.LZ25将初始浓度为50mg/L的菲降解为仅为24.5mg/L。以上都证实了Clostridium sp.LZ25可以利用芘和菲作为生长基质。

[0079] 为了进一步研究芘的降解途径，采用GC-MS技术对菲的代谢中间体进行定性分析。与菲空白对照相比，GC-MS分析鉴定了在第20天菲的厌氧代谢物(图6)，除了保留时间为
11.405min的菲，还在保留时间为6.682和7.402min为检测到苯酚和对甲酚硅烷化后的衍生物。最后，在第30天的培养中(图6)，菲的培养物中在15.365min的停留时间检测到经硅烷化后的2'-羟基-4'-甲基苯乙酮(C9H10O2，CAS：6921-64-8)。以上物质均分别通过标准品GC-MS分析证实。

[0080] 根据以上中间产物的分析，推导出Clostridium sp.LZ25厌氧降解芘的途径如图7所示。从中可以看出，芘通过加入两个氢原子还原成4,5-二氢芘，然后饱和碳原子上的c-c键切割产生菲。氢化还原可以看作是假设途径中芘的初始活化反应。随后，菲被降解为1,1'-(1-亚丁烯基)双苯。1,1'-(1-亚丁烯基)双苯可能转化为三种产物。一种途径是1,1'-(1-亚丁烯基)双苯通过水解羟基化转化为苯雌酚。苯雌酚进一步转化为对甲酚，对甲酚再羟基化而形成对羟基苄醇，再经过对羟基苄醛从而形成苯酚。对甲酚还可能通过羟基化和甲基的羧基化转化为原儿茶酸。1,1'-(1-亚丁烯基)双苯还可以通过水解并羟基化形成2’-羟基苯丙酮，再甲基化形成1-(2-羟基-5-甲基苯基)-1-丙酮，再羧基化转化产生原儿茶酸。
根据分子结构，1,1'-(1-亚丁烯基)双苯还可能产生一种降解产物肉桂醇，肉桂醇近一步降解为苯乙醇，苯乙醇最终转化为苯酚。