一种青钱柳组培苗快速增殖的方法

摘要

本发明公开了一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，属于植物组培技术领域。主要通过青钱柳种胚获得无菌苗，再通过无菌苗的继代增殖培养、壮苗培养、生根培养等过程获得大量高质量的组培苗。本发明方法中组培苗增殖系数高，增殖芽长势较强，不仅为快速增殖青钱柳试管苗提供了一条新途径，而且为以后青钱柳工厂化育苗及通过基因工程的方法改良青钱柳抗性，为青钱柳遗传体系的建立打下基础。

权利要求

1.一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：将在种胚无菌萌发培养基：1/2MS+3.0-5.0mg·L-1 GA3萌发的无菌苗用于增殖培养，将无菌苗接种到1/2MS+3 .0-5 .0mg·L -1 6-BA+0 .05mg·L -1 IAA的培养基中进行无菌苗的增殖培养；将增殖培养得到的芽转接到1/2MS+0 .5mg·L -1 IAA+3  .0-5  .0mg·L -1 GA3 的培养基中进行壮苗培养；最后进行生根培养，生根培养基为：1/2MS+0 .5mg·L -1 IBA+0 .5mg·L - 1 NAA。

2.根据权利要求1所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，种胚无菌萌发的培养基：1/2MS+3 .0mg·L -1 GA3。

3.根据权利要求1所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，增殖培养培养基：1/2MS+3 .0mg·L -1 6-BA+ 0 .05mg·L -1 IAA。

4.根据权利要求1所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，增殖培养后进行壮苗培养；壮苗培养基：1/2MS+0 .5mg·L -1 IAA+5 .0mg·L -1 GA3。

5.根据权利要求1所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗，炼苗保持空气相对湿度为80％以上，3-5天后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为黄土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1，用薄膜盖住营养杯口，保持恒定的气候条件，两周后取出薄膜，逐步进行正常水肥管理。

6.根据权利要求1-5任一项所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，种胚接种暗培养5天后，再到光照条件下培养20-25天；将种胚萌发的无菌苗切下接种后暗培养3天，再到光照条件下培养30天进行增殖培养；将增殖培养得到的芽转接后暗培养1-3天，再转到光照条件下壮苗培养25-30天；将壮苗培养获得的2-3cm高的苗转接后暗培养5天，再转到光照下培养25天后生根。

7.根据权利要求6所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，暗培养为每天24h全程暗培养；培养温度为26±1℃。

8.根据权利要求6所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，光照培养条件：光照强度为2100-2200lx，光照时间14h/d；培养温度为26±1℃。

9.根据权利要求1-5任一项所述的一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，其特征在于，种胚萌发、增殖培养和壮苗培养所采用的培养基均附加蔗糖30g·L -1，琼脂7g·L -1，pH调至 

5 .4-5 .6；生根培养基附加蔗糖20g·L -1，琼脂7g·L -1，pH调至5 .4-5 .6。

说明书

一种青钱柳组培苗快速增殖的方法

技术领域

[0001] 本发明属于组织培养领域，具体涉及一种以青钱柳种胚为外植体获得无菌苗，继而对无菌苗进行大量快速增殖培养，获得完整组培苗的组织培养方法。

背景技术

[0002] 青钱柳为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属的落叶乔木，又名摇钱树、麻柳、青钱李，是我国重点保护的珍稀特有濒危植物之一，主要分布在我国江西、浙江、湖南、福建、四川等省份的山区。青钱柳具有巨大药用开发价值，其叶具有明显的降血糖、降血压、清热解毒、止痛、提高人体免疫力的功效。青钱柳主要靠播种繁殖，但由于种子饱满率低，种皮比较坚硬，又具有深度休眠的特性，出苗率极低，不利于今后青钱柳的规模化育苗和产业化进程。李先民等对青钱柳扦插育苗进行了研究，结果表明通过不同基质配比、温度、湿度及激素处理的扦插生根率最高为35.6％，扦插繁殖生根难、速度慢、繁殖率低的缺点也限制了青钱柳的育苗进程。那么如何实现青钱柳快速繁育，提高组培苗增殖系数，正是当前科研人员正在解决的问题。

[0003] 组织培养具有繁殖速度快，不受季节和环境条件的限制等优点，是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。经科研人员的不断努力，青钱柳组织培养中的一些问题正在解决，主要集中在防止不同外植体褐变，离体胚的无菌萌发，愈伤组织的诱导及条件的优化等方面，但现有技术中青钱柳的壮苗培养过程中很难培养出健壮的无菌苗，不仅增殖系数低，增殖芽长势较弱，不利于青钱柳试管苗的大量快繁。以下是几项在青钱柳组培方面进展优秀的现有技术：

[0004] 如：青钱柳茎段腋芽的离体培养技术，鲁萌等2013.11，南京林业大学学报，中采用腋芽萌发进行青钱柳的离体培养，丛生芽增殖以WPM+0.3mg·L-1TDZ+0.3mg·L-1 6-BA增殖效果最佳，增殖系数为6.78。而且该文件中认为TDZ虽然有很高的细胞分裂活性，但是价格昂贵。另外，该方案中在增殖阶段只加了细胞分裂素6-BA和TDZ，并未加入低浓度的生长素IAA或者IBA，虽然增殖系数较高，但是增殖芽长势较差，叶片较小，较黄，不利于后期的壮苗培养及生根培养，最终导致生根率最高只有25％。

[0005] 青钱柳幼胚组织培养技术的研究，张金凤，采用WPM+0.1mg·L-1TDZ的培养基进行丛生芽增殖培养，增殖系数达到6.71。该方案同样使用的是TDZ，除了TDZ价昂贵外，在使用过程中青钱柳玻璃化苗的出现频率会增加，玻璃化程度加重，较难逆转，不利于第二次、第三次的继代增殖，因此，不利于青钱柳的工厂化大量育苗。此外，使用TDZ后虽然有较高的增殖系数，但青钱柳增殖芽叶片在玻璃化的同时也会生长出大量的愈伤组织，个别出现褐化死亡现象，也有一部分增殖芽在增殖过程中出现了叶片干枯、脱落的现象。而本发明中的配方不但增殖系数最高，而且长势较好，叶片较绿，更有利于后期的壮苗生根培养。

[0006] 青钱柳茎段腋芽萌发和丛生芽增殖，谢寅峰等2011.1，林业科学，中采用WPM+-1 -10.1mg·L TDZ+0.1mg·L NAA增殖效果最佳，增殖系数为7.33。但从该文件提供的组培苗生长情况的图片来判断，明显可以看出丛生芽的增殖效果非常差，芽的长势也不好。该方案在培养基中加了生长素NAA，虽然提高了增殖系数，但是芽苗质量依旧很差，有叶片卷曲，玻璃化严重的现象。可见该方案不能控制芽苗的玻璃化、褐化问题，还需要后续进一步完善。

[0007] 青钱柳离体胚的组织培养研究，乔卿梅等，广东农业科学，2009年第7期，未对芽增殖进行具体的研究，仅仅公开了：改良MS培养基+NAA0.5mg·L-1，成苗率可达93.33％，还认为6-BA对离体胚成苗则具有抑制作用。

[0008] 由上述现有技术可见，大部分的青钱柳组培技术在丛生芽的增殖时采用的WPM基础培养基，而且大多添加了TDZ这种昂贵的激素，而且玻璃化现象非常严重，增殖系数和苗的生长情况始终未达到理想的状态。

[0009] 申请人也在前期的研究中将现有技术中的各种方案进行了验证，发现确实存在上述的这些问题缺陷，因此，本发明申请人经过四年多时间的研究，在青钱柳组培丛生芽增殖方面进行技术攻关。在研究初期，首先使用的WPM培养基，发现在增殖培养过程中，大部分叶片较细，在培养后期叶片出现干枯死亡现象。之后我们使用了1/2MS培养基，在培养基中加入6-BA和少量的IAA，结果发现增殖芽长势较好，芽苗较嫩，愈伤组织较少，且在第二次、第三次继代增殖过程中长势更好，培养周期短，能够达到短时期内大量快殖的效果，不仅显著提高了丛生芽的增殖率，还保证了苗的生长态势。

[0010] 本发明通过利用青钱柳无菌试管苗获得高增殖系数的试管苗，再通过试管苗的壮苗和生根等一系列过程，旨在建立一个高效稳定的青钱柳离体快繁体系，为青钱柳快速繁殖及工厂化育苗奠定基础。

发明内容

[0011] 本发明的目的是针对目前青钱柳试管苗增殖系数低，苗长势差的问题，在此基础上，提供了一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，该方法利用青钱柳种胚萌发的无菌苗，其增殖系数高，苗长势健壮，壮苗效果好，关键还在于能够加速青钱柳工厂化育苗的可能性。

[0012] 本发明的目的是通过以下方式实现的。

[0013] 一种青钱柳组培苗快速增殖的方法，包括以下步骤：

[0014] 将无菌苗接种到1/2MS+3.0-5.0mg·L-1 6-BA+0.05-0.1mg·L-1IAA的培养基中进行无菌苗的增殖培养。

[0015] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，将种胚萌发的无菌苗用于增殖培养。优选种胚无菌萌发的培养基：1/2MS+3.0-5.0mg·L-1GA3；进一步优选种胚无菌萌发的培养基：1/2MS+3.0mg·L-1GA3。

[0016] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，增殖培养培养基：1/2MS+3.0-5.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA。优选：1/2MS+3.0mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1IAA。

[0017] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，增殖培养后进行壮苗培养。优选将增殖培养得到的芽转接到1/2MS+0.5mg·L-1IAA+3.0-5.0mg·L-1GA3的培养基中进行壮苗培养。进一步优选壮苗培养基：1/2MS+0.5mg·L-1IAA+5.0mg·L-1GA3。

[0018] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，增殖培养后进行壮苗培养，最后进行生根-1 -1培养。优选生根培养基为：1/2MS+0.5mg·L IBA+0.5mg·L NAA。

[0019] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗,炼苗保持空气相对湿度为80％以上,3-5天后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为黄土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1,用薄膜盖住营养杯口,保持恒定的气候条件,两周后取出薄膜,逐步进行正常水肥管理。

[0020] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，

[0021] 种胚接种暗培养5天后，再到光照条件下培养20-25天，获得种胚萌发的无菌苗。

[0022] 将种胚萌发的无菌苗切下接种后暗培养3天，再到光照条件下培养30天进行增殖培养。

[0023] 将增殖培养得到的芽转接后暗培养1-3天，再转到光照条件下壮苗培养25-30天。

[0024] 将壮苗培养获得的2-3cm高的苗转接后暗培养5天，再转到光照下培养25天后生根。

[0025] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，暗培养为每天24h全程暗培养；培养温度为26±1℃。

[0026] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，光照培养条件：光照强度为2100-2200lx，光照时间14h/d；培养温度为26±1℃。

[0027] 所述的青钱柳组培苗快速增殖的方法，种胚萌发、增殖培养和壮苗培养所采用的培养基均附加蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，pH调至5.4-5.6；生根培养基附加蔗糖20g·L-1，-1琼脂7g·L ，pH调至5.4-5.6。

[0028] 本发明主要解决了现有技术中青钱柳无菌苗增殖培养过程中增殖系数低，芽苗长势差的问题。该方法对青钱柳无菌苗增殖系数高，壮苗效果好，生根率有所提高；不仅大大提升了青钱柳无菌苗的繁殖速度，而且为以后通过工厂化大量繁殖青钱柳试管苗打下基础。

附图说明

[0029] 图1为本发明青钱柳无菌苗增殖10d的照片；

[0030] 图2为本发明青钱柳无菌苗增殖20d的照片；

[0031] 图3为本发明青钱柳无菌苗增殖30d的照片；

[0032] 图4为本发明青钱柳无菌苗增殖40d的照片；

[0033] 图5为本发明青钱柳壮苗培养20d的照片；

[0034] 图6为本发明青钱柳组培苗生根培养的照片。

具体实施方式

[0035] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0036] 实施例1

[0037] 依次进行以下操作：

[0038] 1、选取当年生青钱柳种子风干去翅后备用。将种子在浓硫酸中浸泡3h后去除碳化层，用自来水冲洗30min，然后浸泡3-5d，每天换水1-2次，然后在超净工作台中先用75％的酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％的HgCl2消毒30min，用无菌水冲洗5-6次，在-1无菌条件下剥取种胚，接种在1/2MS+3.0-5.0mg·L GA3基本培养基中，暗培养2-3天后转到光照条件下培养20-25天即可获得无菌苗，种胚萌发率在90％以上；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间12-14h/d。

[0039] 2、将种胚萌发无菌苗的芽切下接种到表1所示的A1-A13培养基配方中进行不定芽的继代增殖培养，优选1/2MS+3.0-5.0mg·L-1 6-BA+0.05-0.1mg·L-1IAA，暗培养3天，再到光照条件下培养30天，附加蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，pH 5.4-5.8；培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间14h/d；(见附图3-4)

[0040] 表1不同植物生长调节剂对青钱柳增殖培养的影响

[0041]

[0042] 3、将增殖的芽进行壮苗培养，将增殖的芽转接到表2所示的B1-B9培养基配方中进-1 -1行芽的壮苗培养，优选1/2MS+0.5mg·L IAA+3.0-5.0mg·L GA3，暗培养1-3天，再转到光照条件下培养25-30天，苗高为2.8-3.5cm，叶片数为3-8个。附加蔗糖30g·L-1，琼脂7g·L-1，pH 5.5，培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间14h/d；(见附图5)[0043] 表2不同植物生长调节剂组合对青钱柳壮苗伸长培养的影响

[0044]

[0045] 4、待试管苗长到2-3cm时接到表3所示的C1-C9培养基配方中进行芽的生根培养，优选1/2MS+0.5mg·L-1IBA+0.5mg·L-1NAA，暗培养5d后转到光照培养下20d后统计最高生根率达32.0％，附加蔗糖20g·L-1，琼脂7g·L-1，pH 5.5。培养温度为26±1℃，光照强度为2100-2200lx，光照时间14h/d。(见附图6)

[0046] 表3不同植物生长调节剂对青钱柳生根的影响

[0047]

[0048] 5、将生根后的苗先在人工气候箱中进行移栽前炼苗,炼苗保持空气相对湿度为80％以上,3-5天后从培养瓶中取出,洗净根部培养基,移栽到营养杯中,基质为黄土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1,用薄膜盖住营养杯口,保持恒定的气候条件,两周后取出薄膜,逐步进行正常水肥管理，移栽成活率较高。