一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法转让专利
申请号 : CN201811126376.1
文献号 : CN109112124B
文献日 : 2021-05-21
发明人 : 杨长宪 , 叶志彪 , 廖晓利 , 朱顺华 , 裴利菲 , 王涛涛 , 李汉霞
申请人 : 华中农业大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种调控番茄腺毛形成的基因,其特征在于,所述调控番茄腺毛形成的基因lncRNA全长cDNA序列为1266bp;cDNA序列为SEQ ID NO:1。
2.一种如权要求1所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法,其特征在于,所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法,包括:步骤一:采用paired‑end ssRNA‑Seq,测定I型腺体毛、Wo基因突变体和野生型对照Ailsa Craig的转录组数据;
步骤二:利用TopHat2与参考基因组进行比对,再结合Cufflinks进行转录本的拼接,获得转录本;
步骤三:通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本,确定疑似lncRNAs;
步骤四:利用两种编码潜能分析软件PFAM和CPC,对疑似转录本分别进行编码潜能的预测,取交集,最终获得lncRNAs。
3.如权利要求2所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法,其特征在于,调控番茄腺毛形成的基因为:lncRNA000100;
所述的调控番茄腺毛形成的基因的克隆方法,进一步包括:RNA‑seq分别获得109,747,652、102,356,032、104,576,556、99,279,862、102,811,
164、105,689,184原始数据;去除低质量的原始数据,分别获得高质量的reads数
107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014;
利用TopHat2与参考基因组进行比对的结果,再结合Cufflinks进行转录本的拼接,共获得70965个转录本;
对70965个转录本进行进一步分析,通过去除表达量和可信度低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本、选择FPKM≥
0.5的转录本步骤,确定2356个转录本为疑似lncRNAs;
分别利用两种主流的编码潜能分析软件PFAM和CPC对2356个转录本分别进行编码潜能的预测,取交集,最终共获得1303个lncRNAs。
4.一种如权利要求1所述调控番茄腺毛形成的基因在番茄遗传改良中的应用,其特征在于,所述应用包括:
提取番茄叶片基因组RNA,利用反转录酶试剂盒将RNA反转录成cDNA;通过PCR扩增得到lncRNA000100产物,经1%琼脂糖凝胶检测,用回收试剂盒回收目的片段,用pEasy‑Blunt载体克隆,取5μL连接产物进行热击处理;转化大肠杆菌DH5α,涂布于含有氨苄青霉素/异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷/5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基‑B‑D‑半乳糖苷(Amp/IPTG/X‑gal)的LB固体平板上,37℃培养过夜,挑选蓝斑1个和白斑若干,于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中,于37℃200r/min振荡培养过夜,用小量法提取质粒;
将所述质粒用lncRNA000100特异引物进行检测,对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定。
说明书 :
一种调控番茄腺毛形成的基因及克隆方法
技术领域
背景技术
制已经较为清楚。番茄、薄荷、烟草等的部分茸毛为典型的腺体毛,其调控机制少有研究。番
茄茸毛中的腺体毛类型能够分泌甲基酮、倍半萜烯等次级代谢物而具有很好的抗虫性。番
茄是我国重要的蔬菜作物,由于抗虫性研究较为薄弱而阻碍了抗虫种质资源的应用。因此,
番茄腺体毛调控机制的研究对于利用腺毛资源来提高番茄的抗虫性和丰富植物细胞命运
调控的分子机制具有重要意义。番茄lncRNA000100具有这样的一些功能,因此研究番茄表
皮毛lncRNA000100对于丰富番茄茸毛调控途径以及植物细胞命运的调控机制具有重要的
意义。
中II型为多细胞基部,III型为单细胞基部;IV型腺体毛与I型腺体毛类似,只是多细胞颈部
较短;V型茸毛长度稍短,基部为单细胞;VI型腺毛包含一个由4个腺体细胞组成的腺体,体
积较大,易于观察;VII型腺毛的腺体不规则,由4‑8个细胞组成。不同番茄材料具有不同的
腺体毛类型和密度。潘那利番茄(Solanum pannellii)含有I、III、IV、VI、VII等5种类型,其
中IV型腺毛密度最高;多毛番茄(S.hirsutum)含有I、III、IV、V、VI、VII等6种类型,其中IV、
V、VI型腺毛密度大,I、III、VII型密度小;醋栗番茄(S.pimpinellifolium)含有II、V、VI等3
种类型;秘鲁番茄(S.peruvianum)含有I、V、VI、VII等4种类型;普通栽培番茄
(S.lycopersicum)含有I、III、V、VI、VII等5种类型。番茄体表密被的茸毛具有很好的抗虫
性。危害番茄主要为刺吸式昆虫,例如烟粉虱、温室白粉虱、银叶粉虱等。这些害虫既可以直
接取食危害番茄的生长发育,又可以携带病毒而传播病毒病。
病毒而传播病毒病。番茄近缘野生种是番茄抗虫育种的主要资源,其中多毛番茄、潘那利番
茄和秘鲁番茄的抗虫性研究较多,但由于其腺毛类型、密度等差异而导致其抗虫种类和抗
性强弱不同。多毛番茄对温室白粉虱、桃蚜、美洲斑潜蝇、叶螨等18种虫害具有抗性;潘那利
番茄对桃蚜、温室白粉虱、烟粉虱、甜菜夜蛾等9种害虫具有抗性;秘鲁番茄对南美番茄蛲
虫、烟粉虱等具有抗性。另外,针对番茄腺体毛产生次级代谢物的抗虫性,研究较多的为IV
和VI型腺毛产生的甲基酮、倍半萜烯和酰基糖等3种成分。潘那利番茄IV型腺毛由于具有较
高的酰基糖含量而对斑潜蝇、棉铃、烟粉虱等都具有良好抗性。姜烯是多毛番茄VI型腺毛分
泌的一种倍半萜烯,对马铃薯甲虫有明显毒害作用。多毛番茄VI型腺毛分泌的2‑十三烷酮
和2‑十一烷酮对除甜菜夜蛾以外的昆虫表现出很好的抗性。
GLABROUS1编码R2R3MYB转录因子,是拟南芥中克隆的第一个腺毛调控基因,它与bHLH蛋白
ENHANCER OF GLABRA3和GLABRA3,以及WD40蛋白TRANSPARENT TESTA GLABRA1相结合形成
复合体共同促进腺毛的形成。同时,另外一类R3MYB蛋白ENHANCER OF TRY AND CPC1
(ETC1)、CAPRICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)、TRICHOMELESS1(TCL1)负向调控腺毛的形成。棉
纤维具有与拟南芥茸毛类似的结构和调控机制。例如,与拟南芥茸毛形成关键基因GL1同源
的GaMYB2在棉纤维发育早期高表达,且异位表达能够恢复拟南芥突变体gl1的茸毛表型;
GaMYB109同样是与GL1同源的R2R3MYB类转录因子,在棉纤维细胞伸长过程中起作用;两个
编码含有WD重复结构域的基因—GhTTG1和GhTTG3,也能够恢复拟南芥突变体ttg1表皮毛,
说明这类转录因子同样在拟南芥茸毛和棉花纤维具有相同的调控功能。编码HD‑ZIP IV型
蛋白的OCL4基因被抑制表达后能够促进大型腺毛的形成。黄瓜腺毛基因Tu也被分离,其编
码C2H2锌指蛋白转录因子。薄荷、青蒿、番茄、烟草等体表的分泌腺毛形成的分子机制仍不
清楚,仅有较少基因被鉴定。MIXTA基因编码R2R3MYB转录因子,是第一个被发现参与调控腺
体毛形成的基因,其同源基因MYB MIXTA LIKE 1超量表达可以促进烟草腺毛数量的增加。
番茄中多种类型的腺毛可能受不同的基因调控。目前已知的番茄腺毛控制基因有Wo、dl、
gi、hl、hl‑2等13个。但仅有Wo被定位和克隆,该基因属于HD‑ZIP IV型转录因子,主要通过
与一个B型细胞周期蛋白直接互作共同调控番茄I型腺毛的形成。
植物感受低温抑制春化关键基因FLC的表达促进开花。最新研究表明FLC的反义转录本可以
形成2个lncRNAs,COOLAIR和COLDAIR。COOLAIR的表达量在春化初期急剧上升,而COLDAIR在
未春化之前就有少量表达,春化开始后持续增加。二者在春化过程的不同阶段发挥作用,低
温诱导低表达的COOLAIR持续产生可以抑制FLC的表达,从而促进开花。水稻生殖器官表达
谱分析确定多个组织特异性lncRNAs,这种特异性预示着这一类lncRNAs可能参与水稻的生
殖发育过程。水稻光敏雄性核不育表型受一个lncRNA的调节,LDMAR。LDMAR足够的表达水平
是维持花粉发育的决定因素;LDMAR单碱基突变导致其二级结构发生改变,表达水平下降造
成正处于发育阶段的花药提前程序化死亡,出现不育性状。白菜核不育两用系的可育系花
粉中特异表达的lncRNA,BcMF11,其异常表达促使绒毡层的提前降解和花粉败育,而且
BcMF11下调引起的绒毡层降解和花粉败育起始于减数分裂时期。Npc48是在拟南芥根、茎、
叶、花等各个组织中均有表达的lncRNA,过量表达后导致植株表现出叶锯齿、莲座叶直径增
大等异常表型外,而且开花时间也显著推迟。GmENOD40是在豆科植物根瘤特异性表达且于
共生固氮根瘤密切相关的lncRNA,其在水稻中的同源序列OsENOD40参与调控水稻的器官分
化和维管束组织的发育。黄瓜中CsM10是在不同组织、不同发育阶段和不同光照周期都有差
异表达一个lncRNA,推测其可能与黄瓜的雌雄分化相关。但是,到目前为止,lncRNA在植物
中的功能研究不多,也没有长链非编码RNA参与植物茸毛形成的报道。因此,深入研究
lncRNA000100调控番茄茸毛的形成机理对于丰富植物细胞命运调控具有重要意义。
发明内容
研究与应用。
个调控番茄腺毛形成的lncRNA000100。该lncRNA全长序列为1266bp。本发明利用克隆的
lncRNA000100基因在番茄中超量表达,显著抑制I型番茄腺毛形成。
似lncRNAs;
107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014;
FPKM≥0.5的转录本步骤,确定2356个转录本为疑似lncRNAs;
Blunt载体克隆,取5μL连接产物进行热击处理;转化大肠杆菌DH5α,涂布于含有氨苄青霉
素/异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷/5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基‑B‑D‑半乳糖甘(Amp/IPTG/X‑gal)的
LB固体平板上,37℃培养过夜,挑选蓝斑1个和白斑若干,于含Amp 100mg/L的液体LB培养基
中,于37℃200r/min振荡培养过夜,用小量法提取质粒;
附图说明
植株。
具体实施方式
限定本发明。
ATAACTCTCTTCGTTCTCTGTTTTTTCTTTATTATTTTTTCTATGATCCGACGAGTGCACGTTCTGTTCGTCTTACT
CTTCCTCTGATTCCACCAAACCGGCACAAATTGATTTGAACCGATGTTGTTGCCTGTTGATTACGAACATGGTTTTT
CGAGATTAAAAGAATTGAAATATTAGGGGTTTTGGTTCAAATCAATGATGAAAAATTGAAAGATTGAAAGTAGGGAA
TATGAAAGAAAATATAGTGTAAAAGATGGGGTGGAACAGTGAGGCAGAAGGGTGTTGGCCTCTTGCTTTTTGATCGT
CAGCGCAGGAAAAGATGTGAATGTACAATTGTATTTGTCACCGTTGAGATCGCTGAAGAGTCGAGGGTTGTCGAAGT
ACAAGGAAACACCATCAAATACTCTAATGGTGTTTTCTCATTTTCATACCATCTATACAAAAACAATTTGTACCATG
GCAGTAGCTTTTTCATTTTTGTTAGTTTATGTATATTCACTTGTACATGACTCTACAAAATCTCTGTTTTTTACCAC
ATTCAGGAAGAAATCTTGAACCACATTGAGGAAGAAAGCTAGAACTTTGAAGTCTCAACAATATTATTTAATTTAGT
GGGTCAGGTCTAAATTAAAAGATGGAACCAATTTTAAATGGTCAATTTAATTGAAATTGAGAATTTGGGGTCGATTT
AGGATAACCGTTAGTTTGGAGGATATATATGACAAGTTTGCTAACAGTGAGGGTATAAATAACTTCATTTTAACAGT
AGGGGTAAAGTTAACTTATAAATTAAAATTGAGGGGTATATTCAACATTACTATCATTATTAGTGTTGAATTAATTT
TTTTATTAACAGTAATATTGATAAGATTTTTATTAGAGTTACTAATATCTATGGACTATAACTTTTATTGGACTAGT
CTAAATTCCAAGTATCAAAAACTTCAAATGTTCAAATACGCCTTGTTATGAAAGTCGCTCATATATACCCCTATTTA
TAAATAAATGACTCACATATACTCTTTTCCTCTAATGAAAATGAAAAAAAAATTGAATCTAATTTTTTTATTATTTT
TGTATAAAAAAAATAATTCCATATGAGTAAATTTAATCCTCG
lncRNAs;
物学重复。
107276494、100109508、102147322、96925110、100477710和103228014。利用TopHat2与参考
基因组进行比对的结果,再结合Cufflinks进行转录本的拼接,共获得70965个转录本。为了
确定可能的lncRNAs,本发明对70965个转录本进行进一步分析,通过去除表达量和可信度
低的单外显子转录本、选择转录本长度>200bp的转录本、筛除与数据库注释exon区域有重
叠的转录本、选择FPKM≥0.5的转录本等步骤,确定2356个转录本为疑似lncRNAs。是否具有
编码潜能是判断转录本是否为lncRNAs的关键条件。
扩增得到lncRNA000100产物,经1%琼脂糖凝胶检测,用回收试剂盒(购自Axgen公司)回收
目的片段,用pEasy‑Blunt载体(购自Transgen公司)克隆,取5μL连接产物进行热击处理,具
体方法参照试剂盒说明书,转化大肠杆菌DH5α,涂布于含有氨苄青霉素/异丙基‑β‑D‑硫代
半乳糖苷/5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基‑B‑D‑半乳糖甘(Amp/IPTG/X‑gal)的LB固体平板上,37℃培
养过夜,挑选蓝斑1个和白斑若干,于含Amp 100mg/L的液体LB培养基中,于37℃200r/min振
荡培养过夜,用小量法提取质粒(购自北京普博欣公司,具体程序见该试剂盒的说明书)。将
该质粒用lncRNA000100特异引物进行检测,对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定,
测序工作由北京博奥生物技术有限公司完成。
到pEASY‑Blunt载体(购自Transgen公司)上,测序选择正确的阳性克隆,以XbaⅠ和KpnⅠ双酶
切带有目的基因H全长片段的克隆pEASY‑Blunt载体,同时以XbaⅠ和KpnⅠ双酶切pMV2载体,
回收连接后得到含lncRNA000100的重组超量表达载体,构建流程,该载体由35S启动子驱
动,选择标记基因为壮观霉素(Spec)。将lncRNA000100的超量表达载体转入Wo突变体
LA3186(引自美国番茄遗传资源中心),进行转化,获得了转基因植株。
凝胶电泳检测),非转基因番茄植株没有条带,阳性转基因植株有目标条带。确认有3株为阳
性的转基因植株。同时,由于Wo基因的纯合致死特性,导致该位点处于杂合状态,利用Wo基
因特异引物扩增并酶切,确定转基因植株含有Wo基因的突变。结果显示,转基因植株含有Wo
基因的突变(图5)。另外,利用QRT‑PCR引物检测转基因植株中lncRNA000100的表达变化,发
现转基因植株中该lncRNA明显上调。