一种抗VEGF的单克隆抗体及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201811466201.5
文献号 : CN109134651B
文献日 : 2019-02-22
发明人 : 何虹霖 , 姜伟东
申请人 : 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 , 上海复宏汉霖生物制药有限公司
摘要 :
本发明属于生物医药抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗VEGF的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明的抗VEGF单克隆抗体具有良好的生物活性，能够有效结合VEGF蛋白，并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭VEGF蛋白与其受体相结合。该单克隆抗体能够单独或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及肿瘤的诊断和筛查中，具有制备治疗肿瘤、抗自身免疫性疾病等药物的良好前景。
权利要求 :
1. 一种抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
2. 如权利要求1所述抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区还包括CDR1、CDR2 和CDR3 区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示。
3. 如权利要求1所述抗VEGF的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的轻链可变区还包括CDR1’、CDR2’和CDR3’区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12所示。
4. 一种分离的核苷酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5. 如权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有编码如权利要求1所述抗VEGF的单克隆抗体的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。
8.一种如权利要求1所述抗VEGF的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a)在表达条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，表达抗VEGF的单克隆抗体；
b)分离并纯化步骤a)所得抗VEGF的单克隆抗体。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含有效量的如权利要求1所述抗VEGF的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的抗VEGF的单克隆抗体在制备VEGF分子阻滞药物中的用途。
说明书 :
一种抗VEGF的单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗VEGF的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 肿瘤的生成和发展与新血管生成有密切的联系，通常肿瘤开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离非常接近，而且能在较长的一段时间里保持休眠状态。有些肿瘤细胞可能转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅促进原发性肿瘤继续生长，而且使转移性肿瘤细胞传播并重新建群。实体瘤与正常细胞相比，新血管形成让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势。在乳腺癌及一些其它肿瘤中，在肿瘤组织切片中观察到微脉管密度与患者存活之间存在一定的相关性(Weidner et al, N. Eng1. Med. 324 (1991) 1-8:Horak et al, Lancet
340(1992)1120-1124和Macchiarini,等,Lancet340(1992)145-146) 。虽然尚未完全了解控制新血管发生的精确机制，但是肿瘤相关新血管的形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡，参见Folkman，NatMed(1)：27-31(1995)。除肿瘤之外，新血管的发生和生成有可能与多种疾病的发生机制相关，例如：眼内新血管综合征，增殖性视网膜病或年龄相关的黄斑变性(AMD) 、类风湿性关节炎和银屑病Folkman,etal,Bio1.Chem267(1992)10931-
10934；Klagsbrun,et al ,Annu. Rev.Physio1. 53 (1991) 217-239等。
340(1992)1120-1124和Macchiarini,等,Lancet340(1992)145-146) 。虽然尚未完全了解控制新血管发生的精确机制，但是肿瘤相关新血管的形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡，参见Folkman，NatMed(1)：27-31(1995)。除肿瘤之外，新血管的发生和生成有可能与多种疾病的发生机制相关，例如：眼内新血管综合征，增殖性视网膜病或年龄相关的黄斑变性(AMD) 、类风湿性关节炎和银屑病Folkman,etal,Bio1.Chem267(1992)10931-
10934；Klagsbrun,et al ,Annu. Rev.Physio1. 53 (1991) 217-239等。
[0003] 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，VEGF与内皮细胞膜上其受体，血管内皮细胞生长因子受体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor）结合，引起受体的自身磷酸化，从而激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK），实现有丝分裂原特性，诱导内皮细胞增生。VEGF是最好表征的和最强力的血管发生正调节物之一， Ferrara, N.;Kerbel，R.S Nature438：967-74(2005)。C除了在血管发生和血管生成(vasculogenesis)中起到发生因子作用之外，VEGF作为多效性生长因子，还展现了在其它生理学过程中的多种生物学效应，诸如调节内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入等功能，Ferraraand et al., EndocrineRev.18：4-25(1997)。还有研究报导了VEGF对数种非内皮细胞类型，诸如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和施旺细胞的促有丝分裂效果，Sondell et al.,J.Neurosci.19:5731-5740(1999)。
[0004] VEGF作为病理学状况中血管发生的主要调节物，使其成为了一种非常有价值的药物靶点，针对该靶点进行了大量的工作。但是，以VEGF为靶点进行治疗时，会引起涉及多种细胞因子的情况发生。例如，炎性细胞可通过分泌炎性细胞因子参与血管发生，所述炎性细胞因子可影响内皮细胞活化、增殖、迁移和存活，相关综述见Albini，A.，Tosetti，F.，Benelli，R. Noonan，D.M.。与靶向VEGF和成纤维细胞生长因子信号传导的化合物的组合治疗中，不仅提高了抗肿瘤效力且延迟了晚期阶段肿瘤中抗药性的产生。有研究表明，肿瘤浸润性基质成纤维细胞，可以成为促血管发生因子的来源之一Dong，J.etal. EmboJ23：2800-10(2004)等。
[0005] 抗VEGF中和抗体可抑制裸鼠中各种不同人肿瘤细胞系的生长(Kim et al., (Nature)362:841-844(1993)等)，对于治疗肿瘤或其他由于新血管引起的疾病，抗VEGF的单克隆抗体或其他抑制剂是一种比较好的选择。利用单克隆抗体结合VEGF，不仅可以清除掉血液中的VEGF，还可以阻断VEGF与VEGFR结合，阻止血管内皮细胞增殖信号，起到抑制肿瘤血管生成的作用，达到抑制肿瘤生长之目的。人源化的单克隆抗体贝伐单抗，是一种用于肿瘤治疗的抗VEGF抗体，并且是批准用于癌症治疗的一种血管生成抑制剂。然而，贝伐单抗的价格较为昂贵，该药品在中国各省2016年-2017年组织的药品招标采购中，最低中标价为5000多元（100mg/瓶），若某结直肠癌患者需每两周给药一次，每次用量3-4瓶（100mg/瓶），则患者个人仅一个月，就需在贝伐珠单抗上花费将近三、四万元。
[0006] 因此，现有的抗VEGF单克隆抗体还存在种类少、选择性不强、亲和力较低以及价格昂贵等缺陷。因此研发新型抗VEGF单克隆抗体，使其具有更低的毒副作用，更佳的临床药效，并且能够降低成本，在价格上能够被癌症患者所承受，已成为亟待解决的问题。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的抗VEGF单克隆抗体，其具有良好的生物学活性，对VEGF蛋白具有良好的亲和力，具有良好的配体-受体结合抑制能力和细胞增殖抑制能力，在低浓度时，其细胞增殖抑制能力优于对照抗体bevacizumab。本发明提供的新的抗VEGF单克隆抗体能够用于制备抗肿瘤、抗感染性疾病、抗自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物，从而完成了本发明。
[0008] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗VEGF单克隆抗体的氨基酸序列。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供编码所述抗VEGF单克隆抗体的核苷酸分子。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。
[0011] 本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。
[0012] 本发明的第五个目的在于提供一种所述抗VEGF单克隆抗体的制备方法。
[0013] 本发明的第六个目的在于提供包含所述抗VEGF单克隆抗体的组合物。
[0014] 本发明的第七个目的在于提供所述抗VEGF的单克隆抗体在制备VEGF分子阻滞药物中的用途。
[0015] 为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
[0016] 本发明采取的技术方案之一为：一种抗VEGF的单克隆抗体，该单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
[0017] 本发明所述抗VEGF的单克隆抗体为常规的单克隆抗体，其包括两条抗体重链和两条抗体轻链，其中包括重链可变区和轻链可变区。较佳的，本发明所述抗VEGF的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。更佳地，该单克隆抗体的重链可变区还包括CDR1、CDR2 和CDR3 区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示。更佳地，该单克隆抗体的轻链可变区还包括CDR1’、CDR2’ 和CDR3’ 区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12所示。更佳地，所述抗VEGF单克隆抗体为人源的。
[0018] 所述抗VEGF单克隆抗体可以是抗体的全长序列，也可以是抗VEGF人源抗体的片段，所述片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。优选的，所述抗VEGF人源抗体是人源的。更优选的，所述抗VEGF人源抗体为IgG1、IgG2或IgG4型抗体。
[0019] 本发明进一步提供所述抗VEGF人源抗体的衍生物，所述衍生物为VEGF人源抗体的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白、抗体/抗体片段-化学偶联物；所述抗VEGF人源抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv等。
[0020] 较佳地，所述抗体/抗体片段-因子融合蛋白具体为抗体-因子融合蛋白、或抗体片段-因子融合蛋白。较佳地，所述抗体/抗体片段-化学偶联物具体为抗体-化学偶联物、或抗体片段-化学偶联物。
[0021] 本发明所述单克隆抗体可以由本领域常规技术制备，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，较佳地是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
[0022] 本发明采取的技术方案之二为：一种分离的核苷酸分子，其编码所述抗VEGF单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码所述单克隆轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0023] 较佳地，所述抗VEGF单克隆抗体的重链编码核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其轻链编码核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。
[0024] 所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码所述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。
[0025] 本领域技术人员知晓，编码上述单克隆抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列。本发明中多聚核苷酸的同系物或其保守型变异序列，可以通过对编码该单克隆抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
[0026] 本发明采取的技术方案之三为：一种表达载体，其含有编码如上所述抗VEGF的单克隆抗体的核苷酸分子。
[0027] 本发明所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明中的表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
[0028] 较佳地，所述表达载体选自pHLX101、pEE14.4、pCHO 1.0或pcDNA3.1中的一种或多种的组合，更佳地为pcDNA3.1。本发明从单克隆培养的细胞株中筛选获取目的抗体的基因序列，用以构建真核表达载体，表达后即可重建抗体的活性，获得抗VEGF单克隆抗体。
[0029] 本发明采取的技术方案之四为：一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的表达载体。所述表达载体含有编码如上所述抗VEGF的单克隆抗体的核苷酸分子。
[0030] 本发明所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO、HeLa细胞系、骨髓细胞系如SP2/0细胞系、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或E.coliTG1 、YB2/0细胞系等以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞中的一种或多种的组合。更佳地为E.coli TG1、BL21细胞（表达单链抗体或Fab抗体）或者CHO-K1细胞（表达全长IgG抗体）。
[0031] 将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0032] 本发明采取的技术方案之五为：上述抗VEGF的单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：
[0033] a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，表达抗VEGF的单克隆抗体；
[0034] b)分离并纯化步骤a)所得抗VEGF的单克隆抗体。
[0035] 本发明所述的宿主细胞的培养方法，所述抗VEGF的单克隆的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及单克隆抗体分离纯化技术手册。
[0036] 本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0037] 本发明采取的技术方案之六为：一种组合物，其包含有效量的如上所述抗VEGF的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
[0038] 本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物以所述单克隆抗体为活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括（但不限于）乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的单克隆抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式对抑制剂进行给药。
[0039] 本发明提供的抗VEGF单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗VEGF单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。所述抗VEGF单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。
[0040] 对于本发明公开的抗VEGF的单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的载体较佳地包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂较佳地包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使抗VEGF单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂较佳地包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂较佳地包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液较佳地包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。
[0041] 本发明采取的技术方案之七为：如上所述抗VEGF的单克隆抗体在制备VEGF分子阻滞药物中的用途。
[0042] 所述用途更佳地为制备VEGF分子阻滞药物上的用途，优选的，所述制备VEGF分子阻滞药物中的用途具体为制备肿瘤治疗或肿瘤诊断类药物上的用途。
[0043] 本发明所述的药物较佳地为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物，更佳地为抗肿瘤药物、治疗自身免疫性疾病药物，优选地为抗肿瘤药物。本发明所述抗VEGF的单克隆抗体可以单独使用或与其他抗肿瘤药物联合使用。所述其他抗肿瘤药物为本领域常规抗肿瘤药物，包括抗体类药物或小分子抗肿瘤药物。所述抗体类药物为本领域常规抗体类药物，较佳地包括抗PD-1单克隆抗体、伊匹单抗等。所述小分子抗肿瘤药物为本领域常规药物，包括紫杉醇、5-Fu嘧啶等。
[0044] 其中所述抗肿瘤药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌和/或头颈肿瘤中的一种或多种。
[0045] 本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
[0046] 本发明中抗VEGF的单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。
[0047] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0048] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0049] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供的抗VEGF单克隆抗体具有良好的生物活性，在哺乳动物细胞中具有较高的表达量，在较大浓度范围内对VEGF具有显著的亲和力、抑制配体-受体结合的能力以及细胞增殖抑制能力，并且在低浓度范围内（约0.1μg/mL -1μg/mL），本发明所得抗VEGF单克隆抗体的细胞增殖抑制能力优于对照抗体bevacizumab。该单克隆抗体能够单独，或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗以及诊断和筛查中，能够有效应用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中，并可能会为广大肿瘤患者提供新型单克隆抗体类药物，从而有效降低用药成本，显著缓解肿瘤病患的经济压力。
附图说明
[0050] 图1为本发明表达并纯化得到的VEGF重组蛋白的SDS-PAGE分析结果。
[0051] 图2为本发明抗VEGF单克隆抗体的亲和力实验结果。
[0052] 图3为本发明抗VEGF单克隆抗体的配体-受体结合抑制实验结果。
[0053] 图4为本发明抗VEGF单克隆抗体抑制HUVEC细胞增殖实验结果。
具体实施方式
[0054] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10 30℃。~
[0055] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0056] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0057] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999 ； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0058] 实施例1表达和纯化人VEGF胞外区重组蛋白
[0059] 合成人VEGF-Fc融合基因（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成），其中VEGF基因序列为SEQ ID NO:13，Fc基因序列为SEQ ID NO:14，两段序列连接即为VEGF-Fc融合基因，设计正向和反向引物分别为：
[0060] 5’-atccgccggcaagccgccaccatgaactttctgctgtcttgg-3’（SEQ ID NO:15）和[0061] 5’-tcactacgtatcatttacccggagacagggagaggctc-3’（SEQ ID NO:16），用于扩增得到编码VEGF-Fc融合蛋白的基因，在基因的上下游分别引入限制性内切酶位点Ngo MIV和Sna BI，PCR条件为95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 15s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。
[0062] PCR产物经琼脂糖凝胶回收（回收试剂盒为Omega bio-tek公司产品）纯化后，加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切产物经DNA回收试剂（Omega bio-tek公司产品）纯化后与用相同限制性内切酶酶切的载体pHLX101（由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1）进行连接反应。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。将获得的阳性克隆在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒（Omega bio-tek公司产品）提取阳性克隆质粒。
[0063] 采用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的方法将质粒DNA转染到293F细胞中（Invitrogen），转染6个小时后，将细胞离心，更换新鲜的293 freestyle Medium培养液（GIBCO公司产品），继续摇床培养。24和48小时后可对细胞进行观察，转染后第3天开始每天对细胞计数，表达时间通常为7-10天，当活细胞密度低于30%时收获细胞培养液上清。将细胞培养液上清用Protein A亲和柱（购买自Invitrogen）进行纯化，最终得到人VEGF胞外区重组蛋白。纯化得到的VEGF重组蛋白的SDS-PAGE分析结果如图1所示。
[0064] 实施例2 抗VEGF人源抗体真核表达载体的构建、表达、纯化和鉴定
[0065] 抗体重链（SEQ ID NO:1）和轻链（SEQ ID NO:7）基因均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。使用PCR反应对上述重链和轻链的编码DNA序列进行扩增，在抗体重链和轻链的基因两端引入适当的酶切位点，其中在抗体重链基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和Sna BI酶切位点，正向和反向引物序列分别为：
[0066] 5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’（SEQ ID NO:17）和
[0067] 5’-GCTCTACGTATCATTTACCTGGAGACAGGGAGAGGC-3’（SEQ ID NO:18），在抗体轻链可变区基因5’端及3’端分别引入Ngo MIV和SnaB I，正向和反向引物序列分别为：
[0068] 5’-ACCTGCCGGCAAGCCGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTC-3’（SEQ ID NO:17）[0069] 和5’- GCATCTTACGTATTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAG -3’（SEQ ID NO:19）。采用PCR反应，条件为95℃10s，60℃10s，72℃10s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。PCR扩增后，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。将PCR产物克隆入pMD18-T载体，交由生工公司测序并分析可变区基因序列。测序结果为：编码抗VEGF单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。抗VEGF单抗重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。该单克隆抗体的重链可变区还包括CDR1、CDR2 和CDR3 区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示。其轻链可变区还包括CDR1’、CDR2’ 和CDR3’ 区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12所示。
[0070] 轻链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和SnaB I进行酶切，重链可变区基因加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切后经DNA纯化试剂盒进行纯化，并与相同限制性内切酶消化的载体pHLX101。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。获得的阳性克隆在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒提取阳性克隆质粒。
[0071] 利用Invitrogen公司的Neon系统，将线性化的质粒DNA转染至CHO细胞（购买自ATCC）。转染后的CHO细胞进行稀释克隆化培养，在含有50 μmol蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）的94113培养基（Irvine Scientific公司产品）中进行筛选，从而获得单克隆细胞系，将其命名为2VA7。
[0072] 将获得的单克隆细胞系2VA7在含有50 μmol蛋氨酸亚氨基代砜的94113培养基中进行摇瓶培养，表达时间通常为7-14天，当活细胞密度低于50%时收获细胞培养液上清。利用羊抗人IgG Fd（Meridian公司产品）以及辣根过氧化物酶标记的羊抗人轻链恒定区进行双夹心ELISA法检测表达上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人的IgG纯品作为标准品。实验结果显示，表达获得的目的蛋白可以被两个抗体识别，具有人IgG抗体特征，并且构建的人源抗体表达量在200 500µg/ml，具有较高的表达水平。采用Protein A亲和层~析柱从细胞培养上清中分离纯化目的单克隆抗体2VA7。
[0073] 实施例3 抗VEGF人源抗体亲和力鉴定
[0074] 抗体亲和力鉴定。将实施例1中制备得到VEGF重组蛋白按2µg/ml包被到酶标板中（工作体积30μL），4℃静置过夜。用含有0.05%的Tween 20 的常规磷酸盐缓冲液（PBST）洗3次。用5%的脱脂牛奶室温封闭1小时。用PBST洗3次，将实施例2制备获得的单克隆抗体2VA7配制成26.5µg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度，每孔加入30µl，室温静置1小时。用PBST洗3次，加入30µl 1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人轻链恒定区二抗（Millipore公司产品），室温静置1小时。用PBST洗4次，加入TMB显色，并用2M的H2SO4终止反应。用酶标仪在450nm下读数，利用bevacizumab（购买自罗氏公司）做为对照。抗VEGF单克隆抗体的亲和力实验结果如图2所示，从结果可看出，本发明筛选所得单克隆抗体2VA7在较大浓度范围内（约0.01μg/mL-10μg/mL），对VEGF重组蛋白具有显著的亲和力，其亲和力与阳性对照抗体bevacizumab相似。
[0075] 实施例4 表达人VEGFR2胞外区重组蛋白
[0076] 合成人VEGFR2-AP融合基因（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成），其中VEGFR2基因序列为SEQ ID NO:20，AP基因序列为SEQ ID NO:21，两段序列连接即为VEGFR2-AP融合基因，设计正向和反向引物分别为：
[0077] 5’-TAACGGGGCCGGCAAGCCGCCACCATGCAGAGCAAGGTGCTGCTGGCC-3’（SEQ ID NO:22）和
[0078] 5’-TCACTACGTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCTG-3’（SEQ ID NO:23），用于扩增得到编码VEGFR2-Fc融合蛋白的基因，在基因的上下游分别引入限制性内切酶位点Ngo MIV和Sna BI，PCR条件为95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，DNA聚合酶为TAKARA公司产品。
[0079] PCR产物经琼脂糖凝胶回收（回收试剂盒为Omega bio-tek公司产品）纯化后，加入限制性内切酶Ngo MIV和Sna BI进行酶切，酶切产物经DNA回收试剂（Omega bio-tek公司产品）纯化后与用相同限制性内切酶酶切的载体pHLX101（由上海复宏汉霖生物技术有限公司构建，参见中国专利201210211812.1）进行连接反应。连接产物转化到DH5α大肠杆菌，涂布在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT琼脂培养基上。将获得的阳性克隆在含有50µg/ml羧苄青霉素的2YT液体培养基中培养，经过Invitrogen公司测序验证后，用质粒大抽试剂盒（Omega bio-tek公司产品）提取阳性克隆质粒。
[0080] 采用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的方法将质粒DNA转染到293F细胞中，转染6个小时后，将细胞离心，更换新鲜的293 freestyle Medium培养液（GIBCO公司产品），继续摇床培养。24和48小时后可对细胞进行观察，转染后第3天开始每天对细胞计数，表达时间通常为7-10天，当活细胞密度低于50%时收获细胞培养液上清。
[0081] 实施例5 配体-抗体结合抑制功能鉴定
[0082] 将实施例1中制备得到VEGF重组蛋白按2µg/ml包被到酶标板中，4℃静置过夜。用PBST洗3次。用5%的脱脂牛奶室温封闭1小时。用PBST洗3次。将实施例2制备获得的单克隆抗体2VA7配制成2µg/ml浓度，并进行3倍梯度稀释，共8个梯度。将实施例4中制备得到的VEGFR2细胞表达上清，用PBST按1:400稀释，然后与稀释好的抗体按1:1混合，加入到酶标板中，室温静置1小时。用PBST洗6次。用pNPP显色过夜，利用bevacizumab（购买自罗氏公司）做为对照。抗VEGF单克隆抗体的配体-受体结合抑制实验结果如图3所示，从结果可以看出，本发明筛选所得单克隆抗体2VA7在较大浓度范围内（约0.1μg/mL-10μg/mL），都能有效抑制VEGF与其受体VEGFR2的结合，其配体-受体结合抑制能力与对照抗体bevacizumab相似，能有效抑制VEGF与其受体VEGFR2的结合。
[0083] 实施例6 抗体对于血管内皮细胞增殖的抑制功能鉴定
[0084] HUVEC细胞（购买自BCRC）用加有EGM TM-2 SingleQuots（购买自Lonza）的EBM ®-2培养基（购买自Lonza）进行培养，按每孔6000个细胞/100μl接种到96孔培养板中培养过夜。小心吸去上清，按每孔2.4μg/ml VEGF/50μl加到96孔培养板中。将实施例2制备获得的抗体
2VA7配制成15µg/ml浓度，并进行2倍梯度稀释，共8个梯度，再按每孔50μl加到96孔培养板中。将已加入样品的细胞培养板放置于CO2培养箱中，37oC，5% CO2，孵育70 74 h。每孔加入~
20μl MTS，将细胞培养放置于CO2培养箱中，37 oC，5% CO2，孵育3.5 h。利用bevacizumab（购买自罗氏公司）做为对照，用酶标仪在490nm下读数。抗VEGF单克隆抗体抑制HUVEC细胞增殖实验结果如图4所示，从结果可以看出，本发明筛选所得单克隆抗体2VA7对HUVEC细胞具有显著的抑制细胞增殖的能力，在高浓度时(约10μg/mL)，其细胞增殖抑制能力与对照抗体bevacizumab相似，在低浓度范围内（约0.1μg/mL -1μg/mL），单克隆抗体2VA7的细胞增殖抑制能力显著优于对照抗体bevacizumab。
2VA7配制成15µg/ml浓度，并进行2倍梯度稀释，共8个梯度，再按每孔50μl加到96孔培养板中。将已加入样品的细胞培养板放置于CO2培养箱中，37oC，5% CO2，孵育70 74 h。每孔加入~
20μl MTS，将细胞培养放置于CO2培养箱中，37 oC，5% CO2，孵育3.5 h。利用bevacizumab（购买自罗氏公司）做为对照，用酶标仪在490nm下读数。抗VEGF单克隆抗体抑制HUVEC细胞增殖实验结果如图4所示，从结果可以看出，本发明筛选所得单克隆抗体2VA7对HUVEC细胞具有显著的抑制细胞增殖的能力，在高浓度时(约10μg/mL)，其细胞增殖抑制能力与对照抗体bevacizumab相似，在低浓度范围内（约0.1μg/mL -1μg/mL），单克隆抗体2VA7的细胞增殖抑制能力显著优于对照抗体bevacizumab。
[0085] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。