一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA、慢病毒及其构建方法和用途

摘要

本发明针对牦牛RXFP2基因，设计合成干扰shRNA，连接到慢病毒载体中，制备出重组慢病毒质粒载体，然后将重组慢病毒质粒载体与病毒包装成所需的辅助载体共转染到293T细胞中，获得靶向RXFP2基因RNA干扰的重组慢病毒载体，为进一步研究牦牛RXFP2的功能奠定基础。本发明设计的shRNA能够有效降低RXFP2基因的表达量，细胞实验证明，利用上述shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因RNA干扰载体，能够显著降低RXFP2基因在细胞内的表达，并能够改变牦牛Bmu‑S1细胞的细胞周期、抑制其增殖并促进其凋亡。

权利要求

1.shRNA在用于制备抑制牦牛RXFP2基因表达的试剂中的用途，其特征在于，所述的shRNA包括一对序列如下所示的shRNA：上游序列是SEQ ID NO.7，下游序列是SEQ ID NO.8；

所述的用途中，shRNA插入于载体上，所述的载体是指hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro质粒；所述的shRNA是通过为BamH I和EcoR I酶切位点插入在质粒中；

所述的用途中还包括构建抑制牦牛RXFP2基因表达的慢病毒的步骤，包括：将上述的载体与psPAX2和pMD2.G共转染到宿主细胞培养；所述的宿主细胞是293T；

所述的hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro质粒的结构是由依次连接的CMV启动子、ZsGreen1基因、PGK启动子、Puromycin抗性基因、WPRE元件、3’LTR元件、PUC复制原点、AMP抗性基因、AMP启动子、5’LTR、Packaging signal序列、CPPT元件、hU6启动子所构成；并且，在hU6基因和CMV启动子有酶切位点BamH I和EcoR I。

说明书

一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA、慢病毒及其构建方法

和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因干扰载体及应用。

背景技术

[0002] 松驰素家族受体2(RXFP2)又称富含亮氨酸的G蛋白偶联受体8（LGR8），属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族，是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体。RXFP2在2005年被鉴定到，并命名为GREAT基因，哺乳动物的RXFP2基因主要在睾丸、子宫、肾、脑、肺等组织表达。研究表明，RXFP2和INSL-3基因突变和缺失与隐睾发生的密切相关，INSL-3由睾丸间质细胞产生，通过旁分泌作用到达睾丸引带与RXFP2结合，促进cAMP的产生和睾丸引带的发育。

[0003] 许多研究表明RXFP2对羊角性状有显著的影响，其在软质角和角的骨膜中特异性表达，表达量与羊角的性状和大小呈负相关。近年来发现RXFP2可能影响牛科动物的角的发育。Allais-Bonnet等通过对有角和无角90天胎牛角芽和额头皮肤组织的研究发现RXFP2参与了牛角芽的分化。赵娟花发现RXFP2基因在有角牦牛角基组织中mRNA相对表达量显著低于无角牦牛。

[0004] 慢病毒载体作为一类由慢病毒改建而来的慢病毒载体，与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体具有以下优点：（1）慢病毒载体携带并整合进入宿主细胞的目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达；（2）转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞；（3）可容纳较大的基因片段。小发夹RNA（shRNA）是一种具有发夹状结构的小分子RNA，它通过RNAi途径使特定基因的表达沉默。shRNA可构建成相应的载体，载体导入细胞后，能在细胞内稳定地转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性siRNA，因此可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。慢病毒载体与shRNA干扰的结合，已成为目前研究基因功能的常用研究工具。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种干扰牦牛RXFP2基因表达的shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因干扰载体及应用。

[0006] 本发明的第一个方面，提供了：

[0007] 一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA，选自以下四对中的任意一对：

[0008] 第1对：上游序列是SEQ ID NO.1，下游序列是SEQ ID NO.2；

[0009] 第2对：上游序列是SEQ ID NO.3，下游序列是SEQ ID NO.4；

[0010] 第3对：上游序列是SEQ ID NO.5，下游序列是SEQ ID NO.6；

[0011] 第4对：上游序列是SEQ ID NO.7，下游序列是SEQ ID NO.8。

[0012] 在一个实施方式中，所述的shRNA优选第4对。

[0013] 本发明的第二个方面，提供了：

[0014] 包含有上述的shRNA的载体。

[0015] 在一个实施方式中，所述的载体是指hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro质粒。

[0016] 在一个实施方式中，所述的shRNA是通过为BamH I和EcoR I酶切位点插入在质粒中。

[0017] 本发明的第三个方面，提供了：

[0018] 一种抑制牦牛RXFP2基因表达的慢病毒的构建方法，包括如下步骤：将上述的载体与psPAX2和pMD2.G共转染到宿主细胞培养。

[0019] 在一个实施方式中，所述的宿主细胞是293T。

[0020] 本发明的第四个方面，提供了：

[0021] 上述的shRNA在用于制备抑制牦牛RXFP2基因表达的试剂中的用途。

[0022] 本发明的第五个方面，提供了：

[0023] 上述的构建方法得到的慢病毒具有抑制牦牛Bmu-S1细胞增殖、促进牦牛Bmu-S1细胞凋亡、延长牦牛Bmu-S1细胞G1周期或者缩短牦牛Bmu-S1细胞S+G2周期等用途。

[0024] 有益效果

[0025] 本发明所述抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA4能有效抑制牦牛RXFP2基因mRNA的表达量。将所述抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA4构建于慢病毒载体上，然后将重组慢病毒质粒载体与病毒包装成所需的2个辅助载体共转染到293T细胞中，获得靶向工RXFP2基因RNA干扰的重组慢病毒载体，获得的载体既适合于体内研究，还适合于体外研究，因此，该重组质粒对于深入研究牦牛RXFP2基因的功能及分子育种均具有重要的科学意义及应用前景。同时，与人工合成的siRNA分子比较而言，RXFP2-shRNA慢病毒干扰载体，在基因转移效率和基因沉默的持续性、稳定性及特异性上具有显著的优越性，彰显了该技术的进步。针对牦牛RXFP2基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒表达系统，可为今后深入研究牦牛RXFP2基因的功能奠定了基础，可广泛应用于表达RXFP2基因的牦牛细胞，具有重要的应用前景和经济价值。

附图说明

[0026] 图1为hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro载体图谱。

[0027] 图2为Bmu-S1感染shRNA慢病毒荧光检测结果。

[0028] 图3为RFXP2-shRNA对RFXP2基因干扰的定量结果。

[0029] 图4为利用MTT法检测细胞增殖结果。

[0030] 图5为用流式细胞仪检测样本的细胞周期各阶段的细胞百分比情况。

[0031] 图6为的细胞周期各阶段的细胞百分比的统计分析情况。

[0032] 图7为细胞凋亡的检测结果。

具体实施方式

[0033] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

[0034] 本发明采用的技术方案是:

[0035] a.根据牦牛RXFP2 mRNA序列，根据RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，合成寡聚单链DNA片段；

[0036] b.将寡聚单链DNA退火成双链，双链的shRNA oligo分别插入到hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro载体慢病毒载体中，构建shRNA慢病毒重组质粒。

[0037] c.将构建得到的shRNA慢病毒重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染到293T细胞培养，即得到靶向RXFP2基因RNA干扰重组慢病毒载体。

[0038] 步骤b中，所述的hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro载体的多克隆位点连接双链DNA片段的酶切位点为BamH I和EcoR I。

[0039] 主要试剂和仪器、设备：

[0040] BamH I、EcoR I和Taq polymerase（NEB公司）

[0041] T4连接酶(Fermentas公司)；

[0042] 转染试剂Polyethylenimine (Polyscience, Cat # 23966)；

[0043] High-capacity cDNA reverse transcription kits：（Invitrogen 公司）；

[0044] SYBR Green MIX：（美国life公司）；

[0045] TRIZOL：（美国life公司）；

[0046] iQ5荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；

[0047] 荧光倒置显微镜（Olympus公司）

[0048] 低温离心机（Eppendorf公司）；

[0049] Nanodrop2000超微量分光光度计（Thermo Scientific公司）。

[0050] 一、寡核苷酸的设计及合成

[0051] 本发明针对RXFP2基因的ORF序列，人工设计合成并筛选靶位点作为靶序列，并将其设计为包含siRNA正义链、LOOP环（TTCAAGAGA）和siRNA反义链的shRNA结构，在正义链模板的5’端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AATT，与EcoR I酶切后形成的粘端互补。

[0052] 所述的双链DNA片段为以下四种序列中的一种:

[0053] 所述shRNA的具体序列如下：

[0054] shRNA1

[0055] 上游序列：

[0056] 5’-GATCCGAAATAAACCTCGAGGACAATTCAAGAGATTGTCCTCGAGGTTTATTTTTTTTTG-3’； （SEQ ID NO.1）

[0057] 下游序列：

[0058] 5’-AATTCAAAAAAAAATAAACCTCGAGGACAATCTCTTGAATTGTCCTCGAGGTTTATTTCG -3’。 （SEQ ID NO.2）

[0059] shRNA 2

[0060] 上游序列：

[0061] 5’-GATCCGCCTGAAGTGTCTACAGAAATTCAAGAGATTTCTGTAGACACTTCAGGTTTTTTG -3’； （SEQ ID NO.3）

[0062] 下游序列：

[0063] 5’-AATTCAAAAAACCTGAAGTGTCTACAGAAATCTCTTGAATTTCTGTAGACACTTCAGGCG -3’。 （SEQ ID NO.4）

[0064] shRNA 3

[0065] 上游序列：

[0066] 5’-GATCCGGATGTTTCAACCCATGAAGATTCAAGAGATCTTCATGGGTTGAAACATCCTTTTTTG-3’； （SEQ ID NO.5）

[0067] 下游序列：

[0068] 5’-AATTCAAAAAAGGATGTTTCAACCCATGAAGATCTCTTGAATCTTCATGGGTTGAAACATCCG-3’。 （SEQ ID NO.6）

[0069] shRNA 4

[0070] 上游序列：

[0071] 5’-GATCCGCCTTTGCGATCTAAAGTACCTTCAAGAGAGGTACTTTAGATCGCAAAGGCTTTTTTG -3’； （SEQ ID NO.7）

[0072] 下游序列:

[0073] 5’-AATTCAAAAAAGCCTTTGCGATCTAAAGTACCTCTCTTGAAGGTACTTTAGATCGCAAAGGCG-3’ （SEQ ID NO.8）

[0074] 二、慢病毒重组质粒的构建

[0075] 1、shRNA 的退火

[0076] 用无菌的 TE buffer 稀释引物使终浓度为100 µMol。分别吸取10 μl的上下游引物混合并吹打均匀放入 PCR 管内进行退火。程序如下：95℃ 30s，72℃ 2min，37℃ 2min，25℃ 2min结束后置于冰上放置几分钟后直接连接。

[0077] 2、shRNA载体的酶切及回收

[0078] 将shRNA载体用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行消化，酶切体系为shRNA vector 5μg，10*Buffer 5μl，BamH I 2μl，EcoR I 2μl，ddH2O补足 50μl。于37℃酶切约30min。酶切后进行电泳，将目的条带切下后加入3倍胶体积的QGbuffer 置于50℃水浴内将凝胶彻底融化，期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000 rpm离心30s。弃掉管内液体，向柱子内加入750 μl的PE buffer，离心1min。弃掉管内液体，再离心1min。换一个新的
1.5mL的EP管，向柱子内加入50 μl的EB buffer，离心1min，离心管中即为回收的载体。

[0079] 3、shRNA 载体与引物的连接

[0080] 分别采用上述的四对shRNA进行试验，将回收的线性化载体与引物进行连接，连接体系为：回收载体(50 ng) 3μl，Oligo引物(0.5µM)1 μl，T4 DNA ligase buffer 1.5 μl，T4 DNA连接酶1 μl，ddH2O补足15 μl于25℃水浴中孵育30 min。

[0081] 4、转化

[0082] 将感受态细胞置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上放置20 min，随后于42 ℃水浴中热击90 s。然后迅速置于冰上放置3min。加入1000 μl不含抗生素的LB培养基于37℃，150 rpm振荡培养45 min。3000 rpm离心2 min，弃掉约850 μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。

[0083] 5、重组质粒的鉴定

[0084] 挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养，PCR鉴定，电泳条带与与其相符的的克隆进行测序。

[0085] 三、RNA干扰效率的检测

[0086] 1、慢病毒包装

[0087] （1）转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到80% 90%时准备转染。~

[0088] （2）转染前1 2 h将需要转染的细胞换新鲜的培养基。~

[0089] （3）转染

[0090] 取无菌的 1.5mL EP 管， 转染体系按下表：

[0091] Opti-MEM                  1 ml

[0092] shRNA                     12 μg

[0093] psPAX2                    4.5 μg

[0094] pMD2G                     4.5 μg

[0095] Polyethylenimine (1mg/mL） 60 μl

[0096] 混匀后，室温放置15 min-20 min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染12 h后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染。

[0097] （4）转染18 20 h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15 ~mL新鲜的细胞培养基（含2%血清的DMEM）继续培养。

[0098] （5）换液48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，4℃，4500 g离心5 min，上清液用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugal filter devices中，4℃，4500 g，离心10 min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500 g，离心20 min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。将病毒以40 50 μl~分装，后保存于-80℃。

[0099] 2、病毒滴度测定

[0100] 将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10% FBS的细胞培养基。

[0101] 细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30 50％的融合密度；~

[0102] 2.2 第二天，当天转染时，将保存于-80℃冰箱中病毒液冰浴融化，用含有10%FBS的细胞培养液进行梯度稀释。稀释方法如下：

[0103] 1号稀释液：10 μl病毒液+90 μl病毒稀释用培养基

[0104] 2号稀释液：10 μl 1号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0105] 3号稀释液：10 μl 2号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0106] 4号稀释液：10 μl 3号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0107] 5号稀释液：10 μl 4号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0108] 6号稀释液：10 μl 5号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0109] 7号稀释液：10 μl 6号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0110] 8号稀释液：10 μl 7号稀释液+90 μl病毒稀释用培养基

[0111] 选取所需的细胞孔，吸去90 μl培养基，丢弃，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90 μl加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；

[0112] 第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100 μl的完全培养基；

[0113] 第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

[0114] 3、RNA干扰效率校测

[0115] （1）慢病毒感染牦牛Bmu-S1细胞

[0116] 将状态良好的Bmu-S1细胞按50-60%的密度铺到六孔板中，DMEM+10%FBS的培养基培养过夜。第二天更换新鲜培养基，按5 μl/ml的比例加入病毒，同时加入5 μg/ml的polybrene，72 h后收集相应孔中的细胞。

[0117] （2）细胞总RNA提取

[0118] 在收集的孔中加入1ml Trizol，裂解细胞，将裂解后的细胞转至1.5 ml离心管中，静置5 min。加200 µl氯仿，旋涡振荡10秒，静置5 min。放入离心机中，12,000 g 4℃离心15 min，将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，加入等体积的异丙醇，静止10 min后放入离心机中，12,000 g 4℃离心10 min。弃上清液，将异丙醇除尽，加入1000 µl 75%的乙醇，放入离心机中，12,000 g 4℃离心5 min。弃上清液，待沉淀干燥后加入DEPC水。-70℃保存。

[0119] （3）反转录

[0120] 逆转录反应试剂为：

[0121] 10×RT Buffer             2 ul

[0122] 25×dNTP Mix(100mM)      0.8 μl

[0123] 10×RT Random Primer      2 μl

[0124] MMLV                    1 μl

[0125] RNA                      5 μl

[0126] RNase Inhibitor           1 μl

[0127] RNase-free Water          8.2 μl

[0128] 总体积                    20μl。

[0129] 反应条件：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5min，4℃ hold，反应结束后，-20℃保存。

[0130] （4）荧光定量PCR

[0131] 每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。

[0132] PCR反应体系为：

[0133] Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG   10 μl

[0134] Forward Primer                          0.5 μl

[0135] Reverse Primer                          0.5 μl

[0136] cDNA                                    1 μl

[0137] ddH2O                                   8 μl

[0138] 反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 25 s，40个循环；循环结束后从58℃升高到95℃获取熔解曲线。

[0139] 使用的引物参见下表。

[0140]

[0141] 如图3所示，所构建的靶向RXFP2基因的shRNA抑制效率如下所示：

[0142]   shRNA1 shRNA2 shRNA3 shRNA4抑制效率 37% 13% 5% 95%

[0143] 检测干扰慢病毒对于Bmu-S1细胞增殖能力的影响

[0144] 采用将处于对数期的牦牛Bmu-S1细胞铺至96孔板培养过夜，转入病毒48 h；每孔加入100 μl MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h；每孔加入100 μl Formanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育4 h左右，紫色结晶全部熔解，在570nm测定吸光度。如图4所示，结果表明，慢病毒侵染组细胞增殖速度减缓，低于对照组细胞的增殖速度。

[0145] 检测干扰慢病毒对于Bmu-S1细胞凋亡的影响

[0146] 细胞铺至12孔板培养过夜，转入病毒48 h，PBS洗涤1次；4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗涤1次；0.1%Triton-X100冰浴2 min；PBS洗涤1次；再用0.3%过氧化氢室温孵育20 min，灭活切片内源的过氧化氢酶，PBS洗涤3次。在样品上加100 μl生物素标记液，30度孵育
1 h；PBS洗涤1次，滴加0.1-0.3 ml标记反应终止液，室温孵育10 min；PBS洗涤3次；在样品上加100 μl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min；PBS洗涤3次；滴加0.2-0.5 ml DAB显色液，室温孵育5-30 min；PBS洗涤3次，直接进行观察。如图7所示，结果表明慢病毒侵染组凋亡的细胞数量显著高于对照组。

[0147] 检测干扰慢病毒对于Bmu-S1细胞周期的影响

[0148] 将处于对数期的牦牛Bmu-S1细胞用胰酶消化，PBS吹散获得单细胞悬液，然后用75%的乙醇固定1 h，离心后收集细胞，用PBS清洗一次，加入PI（终浓度50μg/ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50 μg/ml）1 ml染色1 h，用流式细胞仪检测细胞周期。如图5和图6所示，结果表明，慢病毒侵染组细胞G1期显著高于对照组，S+G2期显著低于对照组。