用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法

摘要

本发明公开一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法，内参基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；构建方法，如下：利用高加索三叶草7个组织转录组数据，选择7个表达稳定的内参基因，同时选用在三叶草属中常用的1个传统内参基因作为对照；将上述候选内参基因进行引物设计，对每个cDNA进行常规PCR扩增，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数；对获得的数据进行内参基因稳定性评估分析，最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数。该内参基因做参照物用于检测高加索三叶草基因表达水平变化，用于校正上样量和上样过程中存在的试验误差，保证实验结果的准确性。

权利要求

1.一种C257504基因作为高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的应用，其序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的构建方法，其特征在于，方法如下：

(1)利用高加索三叶草7个组织转录组数据，从中选择7个表达稳定的内参基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7,SEQ ID No.8所示，同时选用在三叶草属中常用的1个传统内参基因作为对照，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，共8种候选内参基因；所述的高加索三叶草7个组织包括根蘖植株的叶片、茎、根颈、膨大有芽根蘖节、膨大无芽的根蘖节、水平根和无根蘖主根；

(2)将上述8种候选内参基因进行引物设计，对每个cDNA进行常规PCR扩增，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数；

(3)对获得的数据采用三个内参基因稳定性评估软件geNorm、NormFinder和BestKeeper进行分析，最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数；通过使用高加索三叶草根、茎和叶中的基因进行验证，如序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列表达稳定性最高。

3.一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的qRT–PCR方法，其特征在于，其qRT–PCR扩增的正向引物序列如序列表SEQ ID No.9所示，反向引物序列如序列表SEQ ID No.10所示。

说明书

用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法。

背景技术

[0002] 基因表达分析广泛应用于生命科学领域,其研究的深入对探寻疾病相关基因和调控机理、揭示生命奥妙等方面至关重要。在转录水平进行基因表达定量中,如实时荧光定量PCR(Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)、RNA印迹(Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protection assay,RPA)、基因芯片(gene chip)等,为获得更加准确可信的结果,都需要内参基因对目标基因的表达水平进行标准化衡量。

[0003] 聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR技术)由于具有耗时短、特异强、灵敏高等特点，被广泛应用于基因表达的定量分析。由于PCR技术灵敏度高，容易出现假阳性、假阴性的检测结果，内参基因作为qPCR反应的内部参照，具有校准样品量和反转录效率的作用，提高试验数据的准确性。理想的内参基因应该是在所有样本中均表达稳定，因此，利用qRT-PCR对目标基因进行相对定量的准确性依赖于使用经过系统验证的、表达稳定的内参基因，从而排除PCR检测过程中可能出现的假阳性、假阴性结果。

[0004] 高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)是豆科三叶草属中唯一具有地下根蘖的多年生长寿命牧草，具有发达的地下根蘖，与同属的其它植物相比，具有较强的抗寒、抗旱和耐牧性。利用基因表达分析的方法挖掘高加索三叶草优异基因和调控网络，是进行三叶草属植物遗传改良的前提。目前三叶草属植物基因表达分析中使用的多是传统的内参基因，这些传统的内参基因并未经过系统验证，稳定性较差，导致三叶草属植物基因表达分析的准确性较差。现实中并不存在不同试验条件下都恒定表达的理想内参基因。尤其是在非生物胁迫条件下,随着环境的变化内参基因的稳定性也会受到不同程度影响。为了研宄高加索三叶草的不同组织、不同生长发育阶段及非生物胁迫条件下的功能基因表达，筛选特定条件下的最佳内参基因或基因组合是十分必要的。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法，该内参基因做参照物用于检测高加索三叶草基因表达水平变化，用于校正上样量和上样过程中存在的试验误差，保证实验结果的准确性。

[0006] 本发明的目的通过如下技术实现：一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

[0007] 本发明还具有如下技术特征：

[0008] 1、一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的构建方法，如下：

[0009] (1)利用高加索三叶草7个组织转录组数据，从中选择7个表达稳定的内参基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7,SEQ ID No.8所示，同时选用在三叶草属中常用的1个传统内参基因作为对照，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，共8种候选内参基因；

[0010] (2)将上述8种候选内参基因进行引物设计，对每个cDNA进行常规PCR扩增，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数；

[0011] (3)对获得的数据采用三个内参基因稳定性评估软件geNorm、NormFinder和BestKeeper进行分析，最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数；通过使用高加索三叶草根、茎和叶中的基因进行验证，如序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列表达稳定性最高。

[0012] 2、如上所述的一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的应用，其qRT-PCR扩增引物的正向引物序列如序列表SEQ ID No.9所示，反向引物序列如序列表SEQ ID No.10所示。

[0013] 本发明具有如下有益效果及优点：通过本发明筛选到的C257504内参基因实验技术简单，在高加索三叶草不同组织部位稳定表达，是高加索三叶草PCR表达分析的最佳内参基因。

[0014] 1.表达稳定性高：本发明利用高加索三叶草转录组数据，在转录组水平比较了基因的表达水平和稳定性，从中筛选了合适的内参基因，而传统的内参基因在转录组分析中表达水平和稳定性并不高。因此，本发明获得的内参基因的稳定性要优于目前所使用的传统内参基因。

[0015] 2.重复性强：本发明分析了新内参基因在高加索三叶草不同组织部位的表达稳定性，因此，本发明获得的内参基因具有广泛的适用性和重复性。

[0016] 3.提高可靠性：所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。附图说明：

[0017] 图1为候选内参基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测结果图；

[0018] 图中100bp、25bp、500bp、75bp、1000p、200bp表示对应条带的大小1-c236159、2-c257504、3-c258625、4-c262187、5-JF968419.1、6-c267370、7-c268173、8-c271437；

[0019] 图2为c257504内参基因在高加索三叶草不同组织中PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图中：1-根蘖植株的叶片、2-茎、3-根颈、4-膨大有芽根蘖节、5-膨大无芽的根蘖节、6-水平根、7-无根蘖主根；

[0020] 图3为高加索三叶C261263基因草转录组测序中的表达量图；

[0021] 图4为高加索三叶C261427基因草转录组测序中的表达量图；

[0022] 图5为高加索三叶草C261263基因在候选内参基因中的相对表达量图；

[0023] 图6为高加索三叶草C261427基因在候选内参基因中的相对表达量图。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0025] 实施例1

[0026] 1.样品取样

[0027] 试验材料为生长第三年的高加索三叶草，试验地位于东北农业大学校内实验田。于高加索三叶草根蘖性状表现最明显的根蘖株丛期进行取样，分别挖取表现出根蘖性状植株的叶片、茎、根颈、膨大有芽根蘖节、膨大无芽根蘖节、水平根和无根蘖主根，共计7个组织样品，每个样品取10株混合，按组织部位单独保存，每个组织3次生物学重复进行测序，取样后-80℃低温冷冻保存，备用。

[0028] 2.RNA提取、文库构建及转录组测序

[0029] 用Trizol法分别提取7个组织部位的RNA，每个RNA均需满足A260/A280在1.8～2.0之间，以及A260/A230在1.8～2.0之间；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测，在Hiseq 2500测序平台进行RNA-seq二代转录组测序分析，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的cDNA。

[0030] 3.转录组数据筛选内参基因

[0031] 分析高加索三叶草各组织部位转录组数据，在高加索三叶草7个组织转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列:

[0032] c236159：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1；

[0033] c257504：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.2；

[0034] c258625：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.3；

[0035] c262187：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.4；

[0036] c267370：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.6；

[0037] c268173：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.7；

[0038] c271437：核苷酸序列见序列表SEQ ID No.8；

[0039] 利用白三叶草中常用的内参基因JF968419.1作为对照，核苷酸序列见序列表SEQ ID No.5。

[0040] 表1 PCR扩增反应体系表

[0041]试剂 用量(μL)
ddH2O 6
2×Taq Master Mix 10
Primer1(10μM) 1
Primer2(10μM) 1
cDNA 2
总体积 20

[0042] 4.内参基因引物设计

[0043] 将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80～150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，反应体系见表1。反应条件设定为:95℃预变性5min接着进行30个循环(95℃变性15s，每对引物的最佳退火温度15s，72℃延伸60s),最后72℃延伸5min，反应完成后扩增产物放置于4℃保存。对每个PCR扩增产物进行凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带(图1)。

[0044] 5.qRT-PCR实验

[0045] 将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，qRT-PCR反应体系见表2。反应条件设定95℃预变性5min接着进行30个循环(95℃变性15s,每对引物的最佳退火温度15s，72℃延伸60s),最后72℃延伸5min，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数(表3)。

[0046] 表2 qRT-PCR扩增反应体系表

[0047]试剂 用量(μL)
2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10
Primer1(10μM) 0.4
Primer2(10μM) 0.4
cDNA 2
ddH2O 7.2
总体积 20

[0048] 表3候选内参基因的引物序列及其PCR扩增特征表

[0049]

[0050] 6.候选内参基因评估

[0051] 对获得的数据采用三个内参基因稳定性评估软件geNorm、NormFinder和BestKeeper进行分析,最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数。

[0052] (1)采用geNorm软件分析上述候选内参基因的稳定性，(geNorm软件通过计算某一基因与其他基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价，M值越大，稳定性越差，反之，越稳定)，表达最稳定的候选内参基因是c271437，其次是c268173和c258625，最不稳定是JF968419.1。

[0053] 同时，geNorm软件会产生内参基因的配对差异值Vn/n+1,并以此确定试验需要应用的最佳内参基因数目，0.15为取舍值，如小于0.15，则说明不需要n+1个内参基因进行校正目的基因表达。本实验V2/3小于0.15，说明不需要引入第3个基因，2个基因就足够了，考虑2个基因组合不利于简化实验操作，所以确定单独的基因作为内参因。

[0054] (2)对上述所有候选内参基因在每个样本中的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数用NormFinder软件计算基因表达稳定值M，根据得到的所有基因表达稳定值M的到上述所有候选内参基因的稳定性的排列顺序依次是:c257504、c258625、c271437、c268173、c262187、c267370、JF968419.1(对照)、c236159。与geNorm相似，排在前三位的基因均为其次是c257504、c271437.graph_c3、c258625，最不稳定的基因为c236159。

[0055] (3)使用BestKeeper软件计算所有候选内参基因的扩增达到阈值时的循环数的标准差SD变异系数CV，以及各候选内参基因间的泊松相关系数R，以此来确定候选内参基因的表达稳定性，标准差SD小于1的候选内参基因被认为是稳定表达的基因，标准差SD越小，变异系数CV越小，该候选内参基因越稳定，泊松相关系数R值越大的候选内参基因越稳定；反之，越不稳定，由表4可知，上述候选内参基因中，c257504为最稳定的候选内参，其次是c268173和c271437。

[0056] 利用geNorm、NormFinder和Best Keeper三个内参筛选软件得到的共同的稳定性最好的前四个候选基因依次是1-c257504、2-c271437、3-c268173、4-c258625，共同的稳定性最差的两个候选内参基因是JF968419.1和c236159。

[0057] 表4 geNorm、NormFinder和BestKeeper软件综合分析结果表

[0058]

[0059] 7.内参基因稳定性验证

[0060] 分析上述筛选到的c257504在所有样本中的表达稳定性，对样本的cDNA进行qRT-PCR实验，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2。通过根、茎和叶组织样本中蔗糖代谢相关的C261263和激素信号传导相关的C261427的表达分析来验证筛选出的内参基因的稳定性。在C261263和C261427基因的表达中，用c257504作为内参时，表达量正常，其表达量和转录组测序结果中的表达量较为一致(图4-5、图5-6)，说明其表达量稳定，所以确定基因c257504作为筛选得到的最终内参基因。