一种产表面活性剂细菌及其在煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃的应用

摘要

本发明公开了一种产表面活性剂细菌及其在煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃的应用。该菌株筛选自焦化污泥，经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，命名为Pseudomonas aeruginosa Rh5，于2018年1月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:60313。该产表面活性剂细菌可以应用在O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃。该产表面活性剂细菌能大幅度原位降低煤/石油化工废水中的多环芳烃，原位降解多环芳烃超过90％，使外排污泥中多环芳烃的含量大幅度降低，极大地降低了外排煤化工污泥的环境风险，并同时提高了脱氮效果。

权利要求

1.一种产表面活性剂细菌，其特征在于，该菌株为Pseudomonas aeruginosa Rh5，于

2018年1月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:60313。

2.权利要求1所述的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5应用于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃。

3.一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5进行适应焦化废水驯化，得到驯化后的Rh5菌株；

(2)待处理的煤/石油化工废水通入O1/H/O2生物流化床，进水依次经过O1阶段、H阶段和O2阶段，其中O1阶段和O2阶段均通入空气，O2阶段的上清液回流到H阶段；O1/H/O2生物流化床稳定运行15天后，在O1阶段投加驯化后的Rh5菌株；在O2阶段流加葡萄糖，并投加驯化后的Rh5菌株。

4.根据权利要求3所述的一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法，其特征在于，所述驯化后的Rh5菌株在O1和O2阶段投加量均为：1L驯化后的Rh5菌株/

100L待处理的煤/石油化工废水。

5.根据权利要求3或4所述的一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法，其特征在于，所述驯化后的Rh5菌株的密度为OD＝3.0。

6.根据权利要求3或4所述的一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法，其特征在于，所述葡萄糖流加量根据O2进水的C/N比决定，按照C/N质量比为4:1进行流加。

说明书

一种产表面活性剂细菌及其在煤/石油化工废水中原位削减

多环芳烃的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产表面活性剂细菌及其在O1/H/O2(好氧/缺氧/ 好氧)工艺的煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃的应用。

背景技术

[0002] 煤/石油化工业在我国工业当中占有非常重要的地位，其环境问题也非常突出。其中，耗水量和污染物产生量分别占全国总量8％和10％左右，还存在着大量的多环芳烃(PAHs)等有毒和难降解有机物。这类废水中以焦油、长链烷烃、酚类、苯类为代表的有机物其COD值处于3000-30000mg/L范围内，普遍能检测到杂环芳烃、多环芳烃之类的持久性有机污染物。以煤化工的焦化行业为例，2016年焦炭行业排放的焦化废水达到3.5×108m3，约占全国工业废水排放总量的2.2％。炼焦过程贡献了全国PAHs总量的16％以上，估算该行业每年排放到环境中PAHs会达到5000t。作为该类废水中的特征有机污染物，PAHs会以各种形式存在于废水处理的各个工艺阶段，在此过程中，强疏水性的PAHs极易转移到污泥相中，导致其在污泥中不断累积。2012年开始实施的《炼焦化学工业污染物排放标准》(GB 16171-2012) 明确规定了该类废水中PAHs的排放限值，其中总PAHs的限值为0.05mg·L-1，苯并[a]芘的限值为0.03μg·L-1，此标准的提出进一步表明PAHs是煤和石化行业控制的重点。目前该类废水工艺设计主要集中于满足BOD、COD、总氮和挥发酚等常规指标的合格性，虽然可以通过活性炭尾水吸附等手段满足焦化废水中PAHs的出水排放限值的要求，但作为焦化废水中的特征有机污染物，PAHs会以较高浓度的形式存在于焦化废水处理的各个工艺阶段中，中间物料特别是污泥的排放值得关注，一些稳定运行的煤化工废水处理站排水中总PAHs浓度虽然都已达标，外排污泥中的PAHs却很高，因为PAHs具有强疏水性，吸附到污泥相是其在废水处理工程中的重要去向。研究分析表明焦化废水处理工程排放的污泥中PAHs的含量达到 3-10g/kg污泥(农用污泥中的控制限值为3mg/kg)，这样的污泥排放到外界中会造成严重的环境负担，转移到污泥中的PAHs因为污泥的缺氧和微生物传质问题，将更难生物降解。
目前缺乏规范的处理方法，法律法规也缺乏针对性，对排放污泥的多环芳烃含量没有限定。
这些高含量多环芳烃的污泥尽管通过堆肥、填埋和焚烧等一系列方法处理处置后，仍然会对水体、土壤、农作物以及大气环境造成二次污染。如何有效解决该类废水和污泥中以PAHs 为代表的疏水性有机物所带来的环境污染问题，已经成为此领域中一个亟待解决的课题。

[0003] 微生物降解PAHs由于其经济性和有效性而得到广泛研究，但制约微生物降解污泥中 PAHs的关键步骤主要是传质过程，PAHs作为亲脂性的有机物，富集在污泥中，降低了PAHs 的生物有效性，表现为PAHs从污泥相中转移到微生物体内的传质受限问题，PAHs的传质速度成为这一过程的制约因素。因此，如何加快PAHs的传质速度和强化微生物降解效果，成为多环芳烃降解的关键问题。生物表面活性剂由于其良好的增溶性能、环境友好性、生物可利用性等优点，近年来也应用于环境修复中。但是生物表面活性剂价格相对昂贵，而且在充足有机碳源存在的工业废水，外来碳源的添加也会增加生物降解的负荷，因此生物表面活性剂应用于工业废水处理系统提高PAHs等疏水性有机物生物降解仍鲜见报道。

[0004] 目前现有技术中已公开从污泥中筛选产表面活性剂细菌用于去除土壤中烃类等碳氢化合物、有机物和重金属污染的土壤，以及用于原油回收和泄漏处理等，但现有公开的菌种及处理工艺对煤/石油化工废水中多环芳烃的削减效果并不明显。主要原因是煤/石油化工废水原水的高毒性及在水处理过程中pH、盐度等指标变化较大，因而需要有适应煤/石油化工废水原水的高毒性、较广pH、较高盐度的菌种及合适的水处理工艺。现有的煤/石油化工废水处理多采用前置厌氧的工艺，比如A/O1/O2、A1/A2/O、A1/A2/O1/O2工艺，而产表面活性剂菌是好氧菌，因而需采用前置好氧工艺接种产表面活性剂菌用于煤/石油化工废水中多环芳烃的原位削减。已有的文献表明，前置厌氧工艺也不适用于煤/石油化工废水处理，因为煤/石油化工废水原水的高毒性及对厌氧微生物的严重抑制，因而效果甚微，很难达到理想效果，甚至没有检测到产甲烷菌。例如，Zhao等对韶钢二期A/O1/H/O2焦化废水处理工艺-1 -1进行了研究，指出在第一个厌氧单元A进水COD为1530mg·L ，出水COD为1390mg·L ；Zhu等对韶钢二期A/O1/H/O2厌氧A单元中微生物的分析研究发现，污泥中没有产甲烷菌的存在；
Sahariah 等采用A1/A2/O生物流化床对焦化废水进行降解，其A1厌氧反应器对苯酚和COD的去除率分别仅为3％和2％左右。

发明内容

[0005] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种适应煤/石油化工废水的产表面活性剂细菌。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述产表面活性剂细菌在O1/H/O2(好氧/缺氧/好氧)工艺的煤/石油化工废水中原位削减多环芳烃的应用。

[0007] 本发明的再一目的在于提供一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法。

[0008] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0009] 一种产表面活性剂细菌，该菌株筛选自焦化污泥，经鉴定为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，命名为Pseudomonas aeruginosa Rh5，于2018年1月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:60313。

[0010] 本发明提供的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5可以应用于原位削减 O1/H/O2(好氧/缺氧/好氧)工艺的煤/石油化工废水多环芳烃。

[0011] 一种基于O1/H/O2工艺的煤/石油化工废水原位削减多环芳烃的方法，包括以下步骤：

[0012] (1)将筛选得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5进行适应煤/石油化工废水驯化，得到驯化后的Rh5菌株；

[0013] (2)待处理的煤/石油化工废水通入O1/H/O2生物流化床，进水依次经过O1阶段(一级好氧流化床)、H阶段(缺氧流化床)和O2阶段(二级好氧流化床)，其中O1阶段和O2阶段均通入空气，O2阶段的上清液回流到H阶段；O1/H/O2生物流化床稳定运行15天后，在 O1阶段投加驯化后的Rh5菌株；在O2阶段流加葡萄糖，并投加驯化后的Rh5菌株。

[0014] 表面活性剂可以作为良好的增溶剂，增强多环芳烃在水中的溶解性，从而增强微生物的利用性，提高废水中多环芳烃的降解。生物表面活性剂较之于化学表面活性剂，具有极低的 CMC，良好的增溶性和生物可利用性，但生物表面活性剂价格相对昂贵，应用于废水处理成本高。煤石油化工废水因为含有大量的煤焦油、苯系物、烃类、PAHs等疏水性有机物质，有提供生物表面活性剂菌群生长的环境，因而我们在废水处理O1/H/O2工艺中，在O1富含碳源阶段投加筛选得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5，经过驯化适应焦化废水的生存环境后，此菌种一方面可以利用废水中的有机物净化废水，另一方面又能分泌表面活性剂增溶多环芳烃，把多环芳烃等强疏水性有机物洗脱出来，加强多环芳烃与降解菌之间的传质，提高微生物对多环芳烃的利用。在O1及H阶段，COD已经降解了90％以上，因而到了O2阶段，碳源严重不足，如果不额外投加碳源，就不能提供足够的碳源给硝化菌和好氧反硝化菌，影响出水氨氮及总氮的指标，也会影响其他物质的降解，同时大部分微生物对难降解有机物的利用，需要其他容易降解碳源共基质及共代谢。因而在O2阶段，我们除了投加产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5，还流加葡萄糖补充碳源，流加的葡萄糖，一方面可以为微生物好氧硝化反硝化提供碳源，另一方面，也可以作为产表面活性剂细菌 Pseudomonas aeruginosa Rh5的碳源而产表面活性剂，增溶多环芳烃等疏水性有机物，同时也可以作为难降解有机物的共基质利用底物，从这两方面提高微生物对多环芳烃的利用。O2的上清液回流给H段，回流液里面的氧气保持了H工段的微缺氧水解条件。

[0015] 优选的，所述驯化后的Rh5菌株在O1和O2阶段投加量均为1L菌株/100L待处理的煤/ 石油化工废水。

[0016] 优选的，所述驯化后的Rh5菌株的密度为OD＝3.0。

[0017] 优选的，所述葡萄糖流加量根据O2进水的C/N比决定，按照C/N＝4:1(质量)进行流加。所述流加葡萄糖具体是指：检测废水中的C质量和N质量，添加葡萄糖让C和N的质量含量达到4:1，为微生物提供足够的碳源用于生长及脱氮、并降解难降解有机物。

[0018] 所述O1/H/O2生物流化床在现有文献(于哲.焦化废水好氧处理的硝化抑制与脱氮除碳协同的电化学生物流化床构建[J]《, 华南理工大学》,2013)中公开。

[0019] 上述方法能大幅度原位降低煤/石油化工废水中的多环芳烃，原位降解多环芳烃超过 90％，使外排污泥中多环芳烃的含量大幅度降低，极大地降低了外排煤化工污泥的环境风险，并同时提高了脱氮效果。

[0020] 基于煤/石油化工废水原水的高毒性及对厌氧微生物的严重抑制，针对前置厌氧A工段对高浓度煤石油化工废水的效果不明显以及多环芳烃削减的不明显，本发明针对高浓度煤/石油化工废水处理本技术采用好氧工段前置的O1/H/O2生物流化床工艺，并通过在O1阶段投加一定比例的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5，产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5利用废水中的焦油、烷烃等有机物产表面活性剂，增溶废水中的多环芳烃等难溶解有机物，提高多环芳烃与降解微生物之间的传质，提高多环芳烃的生物降解率。在 O1/H/O2工艺中，O1阶段为抵抗高毒性负荷、焦油、煤油、长链烷烃等大部分有机物的氧化分解过程，氰化物、硫氰酸盐及硫化物等毒性抑制物质的完全转化过程，毒性大为降低，不构成对后续H阶段的厌氧菌抑制；H阶段为复杂有机物水解酸化与反硝化反应结合的单元；废水经过了O1阶段及H阶段的降解，有机物已经去除了90％以上，到了O2阶段是彻底除碳脱氮阶段，剩下的COD都是最难降解的有机物，包括富集于污泥中的多环芳烃，而好氧反硝化菌也需要外加碳源进行彻底脱氮，因而我们在O2阶段也投加产表面活性剂细菌 Pseudomonas aeruginosa Rh5，进一步强化多环芳烃的原位生物降解，同时投加葡萄糖碳源，提供给产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5作为碳源产表面活性剂的同时，加强其他污染物异养降解菌的活性，既达到多环芳烃原位高效削减，也达到其他污染指标的降低。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0022] 本发明得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5菌株能产生Rh5生物表面活性剂，该Rh5生物表面活性剂是鼠李糖脂，拥有较低的CMC，且具有更好的耐酸碱和耐盐性，对高盐度和极端pH环境下的污染环境的生物修复具有潜在的应用价值。

[0023] 煤/石油化工废水因为含有大量的煤焦油、苯系物、烃类、PAHs等疏水性物质，接种本发明筛选到的产表面活性剂细菌于煤/石油化工废水中，一方面可以利用废水中的主要污染物焦油、苯类、烃类等作为能源而净化废水，另一方面又能通过分泌表面活性剂增溶PAHs，把 PAHs等强疏水性有机物洗脱出来，加强PAHs与功能降解菌之间的传质，并且从共基质方面提高多环芳烃降解菌对PAHs的生物降解。

附图说明

[0024] 图1为本发明产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5的16s rDNA系统发育树。

[0025] 图2为本发明产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5的筛选流程。

[0026] 图3为Rh5生物表面活性剂的红外光谱图。

[0027] 图4为Rh5生物表面活性剂的临界胶束浓度检测结果。

[0028] 图5为Rh5生物表面活性剂的耐酸耐碱性检测结果。

[0029] 图6为Rh5生物表面活性剂的耐盐性检测结果。

[0030] 图7为实施例1的工艺流程图。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0032] 本发明提供了一种产表面活性剂细菌，该菌株筛选自焦化污泥，经鉴定为铜绿假单胞菌 (pseudomonas aeruginosa)，命名为Pseudomonas aeruginosa Rh5，于2018年1月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为 GDMCC NO:60313。

[0033] 本发明提供的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5菌株(简称为Rh5菌)的生理生化指标测定结果列于表1中。

[0034] 表1.Rh5菌株的生理生化指标

[0035]

[0036] +表示实验结果为阳性，–表示实验结果为阴性。

[0037] 从表中可以看出，Rh5菌属于革兰氏阴性菌并且不能产生芽孢；Rh5菌能在有氧的条件下氧化葡萄糖，在无氧的条件下则不能利用葡萄糖，说明Rh5菌不能发酵葡萄糖；淀粉水解实验结果为阳性，说明Rh5菌含有淀粉水解酶，能利用淀粉；接触酶实验结果为阳性，说明 Rh5菌含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢产生氧气；产气实验结果为阴性，说明Rh5菌不能分解含硫化合物，从而不能产生硫化氢气体；吲哚实验结果为阴性，说明Rh5菌不含有色氨酸酶，从而不能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚；V-P和M-R实验结果为阴性，说明Rh5菌不能将葡萄糖分解为丙酮酸，从而不能产酸或形成二乙酰。此外，Rh5菌株在培养的过程中还能使培养基变为蓝绿色。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步鉴定该Rh5菌属于铜绿假单胞菌属。

[0038] 通过对Rh5菌16s rDNA测序结果，如SEQ ID NO：1所示。对比分析，在Genbank上 BLAST后，发现其与铜绿假单胞菌KVD-HM 52(登录号：KJ872834)相似性高达98％。通过构建系统发育树(图1)可知Rh5菌株与铜绿假单胞菌亲缘关系最近。综上所述，证明本发明提供的Rh5菌为铜绿假单胞菌。

[0039] 此外，经检测，本发明提供的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5菌株能利用焦油、长链烷烃、葡萄糖作为碳源产表面活性剂鼠李糖脂，其未经提纯的粗产品鼠李糖脂量为3650mg/L，未经提纯的粗产品的CMC为96.5mg/L。

[0040] A、产表面活性剂菌筛选流程

[0041] 本发明提供的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5从焦化废水污泥中筛选得到，工艺流程如图2所示，筛选过程如下：

[0042] 取10mL焦化废水的泥水混合物，加入90mL无菌水，220rpm振荡2h；静置30min后取上清液10mL接种到装有90mL无机盐培养基(配方见表2)的摇瓶中，并加入1％煤焦油 (v/v)为唯一碳源进行驯化；于30℃、220rpm的恒温摇床中培养3d，以摇瓶中的菌液作为菌种，再取10mL再分别接种到90mL含有1％煤焦油(v/v)的无机盐培养基(配方见表2) 中进行培养，在上述条件下再培养3d；如此反复富集驯化培养10个周期；

[0043] 取富集驯化培养后的菌液0.1mL涂布于蓝色凝胶平板培养基(配方见表2)上，放置于 30℃的恒温培养箱中培养3d，挑选平板菌落中表面光滑，形状统一，并且出现蓝色晕圈的菌落作为接下来分离纯化的菌落；接着将分离到的菌株在蓝色凝胶平板培养基(配方见表2) 上用平板划线法接种，并在30℃下培养2d，保存蓝色晕圈较大的菌落；将该菌株接种于产表面活性剂培养基(配方见表2)，在温度为30℃、转速为220rpm的恒温培养箱中培养3d 后，取发酵液去除菌体后测定排油圈直径以确定初筛得到的菌株是否能产表面活性剂；

[0044] 将有菌种长出的培养皿取出，在超净工作台中观察平板划线处长出菌落的形态，在显微镜下观察菌种是否为单一菌株，如果观察到仍有杂菌，则继续进行平板划线重复实验，直至平板划线处长出菌落的形态相似，并在显微镜下观察没有混杂菌，即可认定此菌株已经纯化，一共筛选到了7株产表面活性剂菌，经过对比7株菌的排油圈直径、表面张力和乳化指数挑选出具有最强表面活性能力的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5。

[0045] 将纯化得到的菌株、接种环及灭过菌的斜面培养基置于超净工作台中，接种环经灼烧灭菌后挑选菌株到斜面培养基上，做好标记，在30℃的恒温培养箱中静置培养至斜面长出菌株，取出此时的斜面培养基并置于4℃冰箱中保存。

[0046] B.菌株产表面活性剂的提取及性能试验：

[0047] 生物表面活性剂的产量

[0048] 把本发明得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5接种到以1％的葡萄糖作为碳源的产表面活性剂培养基(配方见表2)培养7d后，经过酸碱沉淀法后得到的Rh5 生物表面活性剂粗提物产量为3.65±0.35g·L-1，经过有机物提纯后，得到1.8±0.4g·L-1的纯化后的Rh5生物表面活性剂。

[0049] 表2培养基的组成

[0050]

[0051] 生物表面活性剂结构

[0052] 本发明得到的Rh5生物表面活性剂的红外光谱结果如图3所示。红外光谱在-12915cm 处出现尖锐的吸收峰，表明Rh5生物表面活性剂内部存在-CH2-反对称伸缩振动；
2852cm-1处出现另一个峰，表明Rh5生物表面活性剂内部存在-CH2-对称伸缩振动。2852cm-1-
2915cm-1内有强吸收峰，说明Rh5生物表面活性剂含有大量亚甲基基团。1379cm-1处出现的吸收峰表明Rh5生物表面活性剂含有烷基。在1729cm-1和1386cm-1出现的吸收峰表明Rh5生物表面活性剂含有羰基基团。位于1573cm-1处的峰与羧基的-COO-键伸缩振动相关联。在
3422cm-1， 3246cm-1和1552cm-1处没有峰表明Rh5生物表面活性剂不含N-H键，说明没有氨基。在3200 cm-1-3420cm-1处较宽的吸收峰和3320cm-1处的吸收峰对应的是糖脂的-OH伸缩，说明Rh5 生物表面活性剂含有糖脂。综上所述，本发明得到的Rh5生物表面活性剂的特征吸收峰与糖脂类生物表面活性剂基本一致。

[0053] 本发明得到的Rh5生物表面活性剂的酸性溴酚蓝实验、酸性亚甲基蓝实验、茚三酮显色反应实验、蒽酮-硫酸实验结果如表3所示。以阴离子表面活性剂十二烷基硫酸(SDS)和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)为对照，Rh5生物表面活性剂在酸性亚甲基蓝实验中的三氯甲烷层为蓝色，在酸性溴酚蓝实验中没有变蓝，说明Rh5生物表面活性剂是阴离子型表面活性剂。蒽酮-硫酸实验中Rh5生物表面活性剂有颜色变化而茚三酮显色反应实验中则没有颜色变化，说明Rh5生物表面活性剂的亲水基团是糖而不是脂类。

[0054] 表3.Rh5表面活性剂结构显色反应

[0055]

[0056] 从以上结果可知，本发明得到的Rh5生物表面活性剂属于糖脂类表面活性剂。结合以前的研究(Varjani等报道了由铜绿假单胞菌NCIM 5514在葡萄糖作为唯一碳源的情况下产生的生物表面活性剂经FTIR和薄层色谱分析是鼠李糖脂。现有技术也有报道表明铜绿假单胞菌 ZS1产生的生物表面活性剂也属于鼠李糖脂。)，可以推测出该Rh5生物表面活性剂应该是鼠李糖脂。

[0057] 生物表面活性剂的CMC(临界胶束浓度)

[0058] CMC是评价表面活性剂性能的一项重要指标。本发明得到的Rh5生物表面活性剂的 CMC测定结果如图4所示。由图可知，随着表面活性剂浓度的增加，水的表面张力是逐渐降低的，但降低的速率不同。当Rh5生物表面活性剂浓度较低时，水的表面张力降低速度较快；当其浓度达到一定值时，水的表面张力下降速率减慢，逐渐趋于平缓。表面张力下降速率转折点所对应的浓度就是Rh5生物表面活性剂的CMC，也就是说该点就是Rh5生物表面活性剂开始形成胶束的点。通过计算图5中两条线段的交点处的数值，得出Rh5生物表面活性剂的CMC为96.5mg·L-1。此时，它能将水的表面张力降低至30.5mN·m-1。一般而言，生物表面活性剂的CMC由于组成和纯化的不同，介于10mN·m-1-540mN·m-1之间。例如， Pseudomonas sp.BUP6菌生产的生物表面活性剂的CMC仅有48mg·L-1，而P.aeruginosa JBK1 菌生产的生物表面活性剂的CMC却达到了540mg·L-1。尽管如此，生物表面活性剂的CMC 要比一般的化学表面活性剂(SDS，2.01g·L-1)要低。综上所述，本发明产表面活性剂细菌 Pseudomonas aeruginosa Rh5产生的Rh5生物表面活性剂拥有较低的CMC。

[0059] 生物表面活性剂的耐酸耐碱耐盐性

[0060] 本发明还从表面张力和对石蜡油的乳化指数两方面考察了本发明得到的Rh5生物表面活性剂在不同pH、不同盐浓度下的稳定性，实验结果分别见图5和图6。由图5可知，Rh5 生物表面活性剂的表面张力和乳化指数在3.5-9.5的pH范围内并没有明显的改变，而且pH 在7左右时，乳化指数最高，表面张力最低，说明Rh5生物表面活性剂在pH为3.5～9.5的范围内尤其是中性环境中具有良好的稳定性。当pH低于3.5时，由于Rh5生物表面活性剂形成沉淀，导致表面张力升高，乳化指数降低。当pH高于9.5时，Rh5生物表面活性剂的离子化的羧基基团会大量聚集，从而导致其表面活性剂降低。由图6可知，当盐浓度在0-9％时，Rh5 生物表面活性剂的表面张力和乳化指数基本没有变化，而且当盐浓度升高至15％时，它依然能维持原来表面活性的90％，说明Rh5生物表面活性剂具有较高的盐耐受性。综上所述，Rh5 生物表面活性剂能在较宽的pH(3.5-9.5)和盐度(0-15％)范围内保持稳定。而其他研究者筛选得到的产表面活性剂菌的耐酸耐碱耐盐性与本发明实验结果则有较大的差异。Gogoi等筛选得到的一株铜绿假单胞菌NBTU-1所产的表面活性剂只有在碱性偏酸性(pH 6-9)的条件下能保持稳定；Priji等从山羊中筛选得到的铜绿假单胞菌BUP6所产的表面活性剂虽然在 pH为3-9的范围内能保持稳定，但耐盐性很差，当盐浓度升高到2％时，其表面活性只能维持到原来的60％。Bharali等从被柴油污染的土壤中筛选得到一株铜绿假单胞菌，它产的表面活性剂能在最高7％盐浓度下保持良好的表面活性剂，但其只能在碱性环境中保持活性。相比于这些研究结果，本发明得到的Rh5生物表面活性剂具有更好的耐酸碱和耐盐性，意味着它对高盐度和极端pH环境下的污染环境的生物修复具有潜在的应用价值。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例在现有的O1/H/O2工艺处理焦化废水原水的基础上，结合本发明从焦化废水的泥水混合物中筛选得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5原位削减多环芳烃；具体方法是：将筛选得到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5进行适应焦化废水驯化；将待处理的焦化废水原水通入O1/H/O2生物流化床，进水依次经过O1阶段(一级好氧流化床)、H阶段(缺氧流化床)和O2阶段(二级好氧流化床)；其中O1阶段和O2阶段均通入空气，O2阶段的上清液回流到H阶段；O1/H/O2生物流化床稳定运行15天后，在O1阶段投加驯化后的Rh5菌株；在O2工段流加葡萄糖，并投加驯化后的Rh5菌株，工艺路线如图7所示。菌株驯化及投加的具体参数如下：

[0063] (1)菌株的驯化：

[0064] 对筛选到的产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5菌株进行适应焦化废水产表面活性剂进行驯化，以浓度梯度增加配置模拟焦化废水的培养基，驯化过程分8个阶段，各阶段模拟焦化废水成份碳氮源培养基配方及浓度如表4。

[0065] 基础无机培养基：KH2PO4 50mg·L-1；K2HPO4 50mg·L-1；MgSO4 50mg·L-1；CaCl2 50 mg·L-1；FeCl2 25mg·L-1；CoCl2·6H2O 5mg·L-1；MnCl2·4H2O 5mg·L-1；AlCl3 2.5mg·L-1； (NH4)6Mo7O24 15mg·L-1；H3BO4 5mg·L-1；NiCl2·6H2O 5mg·L-1；CuCl2·5H2O 5mg·L-1； ZnCl2 5mg·L-1。

[0066] 表4.驯化阶段培养基碳氮源浓度

[0067]

[0068] (2)菌种培育及投加量：

[0069] 把驯化后的Rh5菌株进行高密度培养，至菌种密度为OD＝3.0后，投加于焦化废水中， 100L废水投加1L菌种，O1阶段和O2阶段同样的投加量。

[0070] (3)葡萄糖流加量：

[0071] 水处理工业葡萄糖。流加量根据O2进水的C/N比决定，按照C/N＝4:1进行流加，本试验装置流加量为：100g/m3/d。C/N按照4：1流加葡萄糖是指：检测废水中的C质量和N质量，添加葡萄糖，让C和N的质量含量达到4:1，为微生物提供足够的碳源用于生长及脱氮、并降解难降解有机物。

[0072] 本发明同时设置相同运行条件下仅使用现有的O1/H/O2工艺不投加菌源及碳源处理焦化废水的对照试验。

[0073] 上述两组试验中，焦化废水原水(即O1进水)及各阶段出水污染物运行平均指标分别见表5和6，废水处理运行条件见表7。

[0074] 表5.投加菌种及流加碳源的实施例1运行数据(单位mg/L,pH除外)

[0075]

[0076] 表6.未外加菌源及流加碳源的对照试验运行数据(单位mg/L,pH除外)[0077]

[0078] 表7.焦化废水处理运行条件

[0079]

[0080]

[0081] 从表5及表6的数据比较可以得知，投加了本发明产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5的O1出水，COD降低较多，泥相中的多环芳烃大幅度减少，水相中的多环芳烃略有升高，说明，O1工段中产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5的投加可以利用废水本身的有机物产生表面活性剂增溶多环芳烃，大幅度提高多环芳烃的降解。本发明中， O2工段同样进行产表面活性剂细菌Pseudomonas aeruginosa Rh5的投加，同时流加葡萄糖，同样大幅度提高了多环芳烃的降解，并且大幅度提高了氨氮及总氮的去除率。

[0082] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。