本发明主要涉及一种细胞表面标记特异性富集的人乳牙干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。发明还涉及其制备方法、生物学效力检测方法。本发明也涉及将通过本发明制备的细胞微胶囊用于再生医学的用途。
1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人乳牙干细胞微胶囊，其特征在于：所述干细胞为人乳牙干细胞，所述的人年龄是5至8岁，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记；
所述微胶囊包括微球内核及外壳，所述微球直径小于500μm；
所述微胶囊外壳材料选自壳聚糖膜，所述壳聚糖膜为共价交联。
2.一种权利要求1所述人乳牙干细胞微胶囊的制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1，将藻酸盐溶解于PBS中，配成1-3%的藻酸盐溶液，经0.22μm的滤膜过滤，分装保存；
步骤2，将培养至第四代的CD18阳性乳牙干细胞经胰酶消化，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；
步骤3，用藻酸盐溶液重悬步骤2得到的CD18阳性乳牙干细胞，调整细胞浓度为(1-2)×
步骤4，通过水平、竖直双通道微流体装置，将含有细胞的藻酸盐溶液经通道向下滴入装有0.1-0.2M氯化钙溶液的平皿中，形成细胞微球；大豆油经通道横向流动，截断藻酸盐溶液，控制细胞微球的大小；
步骤5，将微球在37℃条件下孵育15-45分钟，待完全交联形成；
步骤6，将藻酸盐细胞微球在(0.1-1)%壳聚糖溶液中包被15-45分钟；
步骤7，随后置于1-5 mg/ml京尼平水溶液中37℃条件下孵育1-10小时完成交联，制备细胞微胶囊；
步骤8，用α-MEM对细胞微胶囊进行清洗和收集，并接种于含10％-20% 胎牛血清、50μM-
200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
步骤9，采用光学显微镜观察形成的细胞微胶囊的形状和直径。
3.一种根据权利要求2所述人乳牙干细胞微胶囊的制备方法，其特征在于，所述培养至第四代的CD18阳性乳牙干细胞的制备步骤如下：步骤1，收集正常脱落的儿童乳切齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，从收集到开始提取乳牙干细胞的时间间隔不超过72小时；
步骤2，转移至生物安全柜，取出乳切齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；
步骤3，从残存的牙冠中分离出牙髓组织；步骤4，将牙髓组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小时；
步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人乳牙干细胞的单细胞悬液，
步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；
步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群；
步骤9，每3-4天换液，待细胞90%融合后，1：3传代，制备微球所用细胞为第四代。
4.一种权利要求1所述人乳牙干细胞微胶囊的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1，收集细胞微胶囊，并接种于含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
步骤2，培养24-48小时后，更换成成骨诱导培养基，即含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.05-0.5mM 地塞米松，10-100 mg/mL 维生素 C 和 5-15 mM β-磷酸甘油的 α-MEM 培养基，每3-4天换液；
步骤3，诱导培养4周后，用4%多聚甲醛室温条件下固定细胞微胶囊30分钟；
步骤6，将细胞微胶囊组织切片置于2%茜素红溶液，室温染色5min；
5.一种权利要求1所述人乳牙干细胞微胶囊的用途，其特征在于，用于骨疾病的再生医学和组织工程材料的制备。
一种细胞表面标记特异性富集的人乳牙干细胞微胶囊及其制
备方法
技术领域
[0001] 本发明主要涉及一种细胞表面标记特异性富集的人乳牙干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。发明还涉及其制备方法、生物学效力检测方法。本发明也涉及将通过本发明制备的细胞微胶囊用于再生医学的用途。
背景技术
[0002] 间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的多能干细胞，在机体的发育及发育成熟后组织器官稳态（Homeostasis）维持过程中起重要作用。它的这种特性使它成为再生医学理想的种子细胞，可用于多种组织器官的损伤修复。
[0003] 在修复过程中，植入干细胞长期存活并维持生物学特性是保证其疗效的关键。尽管间充质干细胞免疫原性低，且具有免疫调节活性，但动物实验结果显示，移植的间充质干细胞并不能保持长期存活。
[0004] 为了解决这一问题，可将干细胞经生物材料包裹，制成微胶囊。当移植入体内时，干细胞可在空间上和机体的免疫细胞及炎性环境保持隔离。同时，氧气、营养物质和代谢废物可通过具有半透膜特性的生物材料进行有效交换。这样，在不使用免疫抑制剂的前提下，植入的干细胞可长期存活并发挥功能。
[0005] 所述的生物材料选自天然高分子材料，胶原，藻酸盐，壳聚糖，透明质酸中的一种或多种。
[0006] 藻酸盐是海藻酸的盐类。海藻酸是从海带中提取的一种多聚糖醛酸，不溶于水，但其钠盐易溶于水。藻酸盐溶液通过和二价阳离子，如Ca2+交联可形成凝胶。藻酸盐凝胶无毒，注入体内后不会引起免疫反应，但缺点是孔隙大和不稳定。
[0007] 壳聚糖是几丁质的衍生物，可与京尼平发生共价交联，交联后具有无毒、生物相容性好、抗炎等特点。
[0008] 在藻酸盐凝胶外包裹一层壳聚糖膜，共价交联的壳聚糖膜可提供更好的稳定性。稳定的微胶囊可以延长细胞在体内的停留时间，提高其有效性。
[0009] 微胶囊的大小对包裹其中的细胞活率有较大影响。微胶囊的直径太大(>500μm)，营养物和氧气向微胶囊中心的细胞扩散不足，代谢废物不能及时排出，会导致细胞活率下降。微流体技术可以制备出粒径分布均匀，且直径小于500μm的微胶囊。
[0010] 乳牙干细胞是间充质干细胞的一种，而通过细胞表面标记特异性富集的亚群，优+选CD18乳牙干细胞亚群有更强的克隆形成能力，更优的成骨分化能力，具有优越的科研和临床应用前景。
发明内容
[0011] 本发明提供了一种细胞表面标记特异性富集的人乳牙干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。具体地说，是通过如下技术方案实现的：
[0012] 本方法采用了含有多种消化酶的组合来消化成人乳牙组织，获得单个细胞悬液。包括但不限于胶原酶、分散酶、透明质酸酶、胰酶、EDTA等，这些消化酶组合可大大提高细胞的得率。
[0013] 本方法中胶原酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。分散酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。
[0014] 本方法是通过细胞表面标记特异性富集，优选CD18来富集乳牙干细胞亚群，CD18可以使用荧光标记，或磁珠标记。相应的，精确的细胞分离技术包括流式细胞仪分选，或免疫磁珠分选。
[0015] 本方法中CD18阳性干细胞的体外扩增基础培养基可以是α-MEM，DMEM，D/F-12，RPMI-1640等。完全培养基是在基础培养基的基础上，添加胎牛血清、抗坏血酸2-磷酸酯、谷氨酰胺、青霉素、链霉素等。
[0016] 完全培养基中胎牛血清的浓度可以是5%，10%，15%，20%。抗坏血酸2-磷酸酯的浓度可以是50μM，100μM，150μM，200μM。其它添加物浓度是按照本领域公认的优化方案添加。
[0017] 本方法中CD18阳性干细胞的扩增传代比例可以是1：3，1：4，或1：5。用于制备微胶囊的细胞是第4代，第5代，或第6代的。
[0018] 本方法中用于制备细胞微球的藻酸盐溶液浓度可以是1%，2%，或3%。配制好的溶液需经0.22μm的滤膜过滤除菌。
[0019] 本方法中藻酸盐溶液重悬细胞的浓度为1×106/ml，1.5×106/ml,或2×106/ml。
[0020] 本方法中控制细胞微球大小的微流体装置为水平、竖直双通道设计，含有细胞的藻酸盐溶液竖直向下滴入装有氯化钙溶液的平皿中，形成细胞微球。大豆油水平横向流动，截断藻酸盐溶液，控制细胞微球的大小。通过该微流体装置制备的细胞微球直径小于500μm。
[0021] 本方法中制备细胞微球所用的氯化钙溶液浓度可以是0.1M，或0.2M，配制好的溶液需经0.22μm的滤膜过滤除菌。
[0022] 通过本方法制备的细胞微球需在37℃条件下的氯化钙溶液中孵育15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，或45分钟。
[0023] 本方法中用于制备细胞微胶囊的壳聚糖溶液浓度可以是0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，1%。配制好的溶液需经0.22μm的滤膜过滤除菌。
[0024] 用壳聚糖溶液包被细胞微球的时间为15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，45分钟。
[0025] 本方法中用于与壳聚糖交联的京尼平溶液的浓度可以是1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml。配制好的溶液需经0.22μm的滤膜过滤除菌。
[0026] 本方法中壳聚糖与京尼平交联的条件为37℃条件下孵育1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时。
[0027] 本发明还提供了一种细胞微胶囊体外生物学效力的检测方法。具体地说，是通过如下技术方案实现的：
[0028] 本方法将细胞微胶囊的体外成骨诱导分化能力作为评估细胞微胶囊生物学效力的方法。
[0029] 所用成骨诱导培养基是在基础培养基的基础上，添加地塞米松，维生素 C 和β-磷酸甘油等。
[0030] 成骨诱导培养基中地塞米松的使用浓度可以是0.05mM，0.1mM，0.15mM，0.2mM，0.25mM，0.3mM，0.35mM，0.4mM，0.45mM，0.5mM。
[0031] 维生素C的使用浓度可以是10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL，80mg/mL，90mg/mL，100mg/mL 。
[0032] β-磷酸甘油的使用浓度可以是 5 mM，6 mM，7 mM，8mM，9 mM，10 mM，11 mM，12 mM，13 mM，14 mM，15 mM。
[0033] 本方法将体外诱导培养4周的细胞微胶囊制作组织切片，通过茜素红染色来检测微胶囊中细胞的成骨分化能力，从而评估细胞微胶囊的生物学效力。
[0034] 本发明制备的细胞微胶囊可直接用于再生医学。
附图说明
[0035] 图1 CD18阳性干细胞亚群
[0036] 图2 CD18阳性干细胞亚群表型分析
[0037] 图3 微胶囊制备设备
[0038] 图4 CD18阳性干细胞微胶囊
[0039] 图5 增殖能力分析。
具体实施方式
[0040] 实施例1 CD18阳性乳牙干细胞的分离和培养
[0041] 材料与方法
[0042] 1，收集正常脱落的儿童乳切齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，从收集到开始提取乳牙干细胞的时间间隔不超过72小时；
[0043] 2，转移至生物安全柜，取出乳切齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；
[0044] 3，从残存的牙冠中分离出牙髓组织；
[0045] 4，将牙髓组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小时；
[0046] 5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人乳牙干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；
[0047] 6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
[0048] 7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；
[0049] 8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群。
[0050] 结果显示，培养的细胞为纺锤形，呈漩涡状生长（图1），细胞表型CD18阳性（图2）；
[0051] 9，每3-4天换液，待细胞90%融合后，1：3传代，制备微球所用细胞为第四代。
[0052] 实施例2 细胞微胶囊的制备
[0053] 材料与方法
[0054] 1. 将藻酸盐溶解于PBS中，配成1-3%的藻酸盐溶液，经0.22μm的滤膜过滤，分装保存；
[0055] 2. 将培养至第四代的CD18阳性乳牙干细胞经胰酶消化，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；
[0056] 3. 用藻酸盐溶液重悬收获的CD18阳性乳牙干细胞，调整细胞浓度为1-2×106/ml；
[0057] 4. 通过如图3所示的水平、竖直双通道微流体装置，将含有细胞的藻酸盐溶液经通道1竖直向下滴入装有0.1-0.2M氯化钙溶液的平皿中，形成细胞微球。大豆油经通道2水平横向流动，截断藻酸盐溶液，控制细胞微球的大小；
[0058] 5. 将微球在37℃条件下孵育15-45分钟，待完全交联形成；
[0059] 6. 将藻酸盐细胞微球在0.1-1%壳聚糖溶液中包被15-45分钟；
[0060] 7. 随后置于1-5 mg/ml京尼平水溶液中37℃条件下孵育1-10小时完成交联，制备细胞微胶囊。
[0061] 8. 用α-MEM对细胞微胶囊进行清洗和收集，并接种于含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
[0062] 9. 采用光学显微镜观察形成的细胞微胶囊的形状和直径。
[0063] 结果显示，制备的细胞微胶囊呈球状，大小均匀。细胞在其中均匀分布，呈圆形（图4）。
[0064] 实施例3 细胞微胶囊体外生物学效力检测
[0065] 材料与方法
[0066] 1. 收集细胞微胶囊，并接种于含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养；
[0067] 2. 培养24-48小时后，更换成成骨诱导培养基（含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.05-0.5mM 地塞米松，10-100 mg/mL 维生素 C 和 5-15 mM β-磷酸甘油的 α-MEM 培养基）；
[0068] 3. 每3-4天换液；
[0069] 4. 诱导培养4周后，用4%多聚甲醛室温条件下固定细胞微胶囊30分钟；
[0070] 5. 置PBS中15分钟；
[0071] 6. 脱水，透明，石蜡包埋，切片，脱蜡，复水；
[0072] 7. 将细胞微胶囊组织切片置于2%茜素红溶液，室温染色5min；
[0073] 8. 自来水冲洗后，用苏木精复染；
[0074] 9. 封片镜检。
[0075] 结果显示，在体外经3-4周成骨诱导培养后，通过茜素红染色（图5），可见微胶囊中细胞间有矿物沉积，表明微胶囊中CD18+乳牙干细胞可向成骨细胞分化，微胶囊包裹未影响其生物学特性。
