一种紫外光触发交联型近红外分子探针及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种光交联型近红外分子探针及其制备方法与应用。具体而言，本发明的制备方法包括以下步骤：构建、合成光交联型近红外分子探针DACF；光交联型近红外分子探针DACF在紫外光触发下在细胞内发生交联。本发明的探针经特定波长的光照射，产生高活性的卡宾中间体，与细胞内生物分子共价键结合，显著增加了探针在细胞内的摄取量，并延长了其滞留时间，能够实现对肿瘤细胞的长时间追踪。同时，利用探针的光热效应，可以更好地杀死肿瘤细胞。通过本发明的制备方法获得的光交联型近红外分子探针能够有效地提高探针在活体肿瘤内的富集量和滞留时间，实现了肿瘤的诊疗一体化，具有重要的科研及经济价值。

权利要求

1.一种紫外光触发交联型近红外分子探针，其特征在于，所述紫外光触发交联型近红外分子探针具有如下化学结构式：。

2.根据权利要求1所述紫外光触发交联型近红外分子探针，其特征在于，所述紫外光触发交联型近红外分子探针的制备方法包括以下步骤：（1）N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺发生酰胺缩合反应，得到化合物

1；

（2）化合物1脱去保护基团得到化合物2；

（3）化合物2与NHS活化的双吖丙啶反应，得到化合物3；

（4）化合物3脱去保护基团得到化合物4；

（5）化合物4与近红外染料反应，得到化合物5；

（6）化合物5与叠氮修饰的叶酸反应，得到所述紫外光触发交联型近红外分子探针；

化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的化学结构式分别如下：NHS活化的双吖丙啶的化学结构式如下：叠氮修饰的叶酸的化学结构式如下：

。

3.根据权利要求2所述紫外光触发交联型近红外分子探针，其特征在于，N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺的摩尔比为1∶1；化合物1脱去保护基团在二氯甲烷/三氟乙酸混合溶剂中进行。

4.根据权利要求2所述紫外光触发交联型近红外分子探针，其特征在于，化合物3脱去保护基团在N,N-二甲基甲酰胺/哌啶混合溶剂中进行；化合物4与近红外染料的摩尔比为

1.2∶1。

5.根据权利要求2所述紫外光触发交联型近红外分子探针，其特征在于，化合物5与所述叠氮修饰的叶酸的反应在抗坏血酸钠和硫酸铜存在下进行；化合物5、所述叠氮修饰的叶酸、抗坏血酸钠、硫酸铜的摩尔比为1∶1∶0.1∶0.05。

6.权利要求1所述紫外光触发交联型近红外分子探针在制备肿瘤内滞留时间延长的探针中的应用。

7.权利要求1所述紫外光触发交联型近红外分子探针在制备肿瘤诊断和/或治疗试剂中的应用。

说明书

一种紫外光触发交联型近红外分子探针及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于近红外染料功能化修饰技术领域，具体涉及一种紫外光介导的双吖丙啶基团对传统近红外染料Cypate修饰的制备方法，通过该方法制备的分子探针，以及该探针在制备肿瘤的近红外荧光成像和基于光热疗法（photothermal therapy，PTT）的抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 众所周知，有机近红外荧光染料具有良好的荧光量子产率、较低的生物毒性、可塑的分子结构、价格低廉等特点，被广泛应用于近红外生物成像。

[0003] 目前，最常见且已被FDA批准用于肿瘤成像的近红外染料是吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG），能产生近红外荧光，进行近红外荧光成像，还可以将吸收的光能转化为热，使局部温度升高，杀死肿瘤细胞，即光热治疗，从而实现肿瘤诊断和治疗的一体化。尽管大量文献报道，基于该类染料所合成的近红外荧光小分子探针能够有效地靶向肿瘤，并用于肿瘤成像和光热治疗，但是由于自身容易被细胞或者组织代谢排除，导致其在体内的血循环周期很短，严重影响了对肿瘤的成像与光热治疗效果。

[0004] 因此，发展一种能够促进探针在肿瘤部位富集并延长滞留时间的新策略和新方法对提高肿瘤成像与治疗效果意义重大。

发明内容

[0005] 为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明构建一种光交联型近红外分子探针，利用光触发交联反应，提高探针在肿瘤内的富集量和延长其滞留时间，进而有效的改善肿瘤的成像与治疗效果；该方法适用于多种近红外染料，为改善近红外分子探针在肿瘤的长时间追踪与治疗效果提供了新的策略与手段。

[0006] 本发明采用以下技术方案：

[0007] 一种紫外光触发交联型近红外分子探针，所述紫外光触发交联型近红外分子探针具有如下化学结构式：

[0008] 。

[0009] 上述紫外光触发交联型近红外分子探针在制备肿瘤诊断和/或治疗试剂中的应用。

[0010] 上述紫外光触发交联型近红外分子探针的制备方法，包括以下步骤：

[0011] （1）N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺发生酰胺缩合反应，得到化合物1；

[0012] （2）化合物1脱去保护基团得到化合物2；

[0013] （3）化合物2与NHS活化的双吖丙啶反应，得到化合物3；

[0014] （4）化合物3脱去保护基团得到化合物4；

[0015] （5）化合物4与近红外染料反应，得到化合物5；

[0016] （6）化合物5与叶酸反应，得到紫外光触发交联型近红外分子探针。

[0017] 一种酸敏感近红外染料的制备方法，包括以下步骤：

[0018] （1）N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺发生酰胺缩合反应，得到化合物1；

[0019] （2）化合物1脱去保护基团得到化合物2；

[0020] （3）化合物2与NHS活化的双吖丙啶反应，得到化合物3；

[0021] （4）化合物3脱去保护基团得到化合物4；

[0022] （5）化合物4与近红外染料反应，得到酸敏感近红外染料。

[0023] 一种延长近红外分子探针在肿瘤内滞留时间的方法，包括以下步骤：

[0024] （1）N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺发生酰胺缩合反应，得到化合物1；

[0025] （2）化合物1脱去保护基团得到化合物2；

[0026] （3）化合物2与NHS活化的双吖丙啶反应，得到化合物3；

[0027] （4）化合物3脱去保护基团得到化合物4；

[0028] （5）化合物4与近红外染料反应，得到化合物5；

[0029] （6）化合物5与叶酸反应，得到紫外光触发交联型近红外分子探针；

[0030] （7）将紫外光触发交联型近红外分子探针在肿瘤部位富集后，经紫外光照射，完成近红外分子探针在肿瘤内滞留时间的延长。

[0031] 上述技术方案中，将紫外光触发交联型近红外分子探针溶于PBS（磷酸缓冲盐，pH=7.2～7.4）注射液中（浓度为45 μM），注入荷瘤体内，然后等待探针在肿瘤部位达到最大富集量，经紫外光照射后，完成近红外分子探针在肿瘤部位滞留时间的延长。

[0032] 上述技术方案中，步骤（1）中，N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸与炔丙胺的摩尔比为1∶1；酰胺缩合反应在HOBt、HBTU和二异丙基乙胺存在下进行；酰胺缩合反应为室温反应15～24小时。

[0033] 上述技术方案中，步骤（2）中，化合物1脱去保护基团在二氯甲烷/三氟乙酸混合溶剂中进行；二氯甲烷、三氟乙酸的体积比为4∶1。

[0034] 上述技术方案中，步骤（3）中，所述反应在二异丙基乙胺存在下进行；化合物2、NHS活化的双吖丙啶、二异丙基乙胺的摩尔比为1∶1∶2。

[0035] 上述技术方案中，步骤（4）中，化合物3脱去保护基团在N,N-二甲基甲酰胺/哌啶混合溶剂中进行；N,N-二甲基甲酰胺、哌啶的体积比为4∶1。

[0036] 上述技术方案中，步骤（5）中，化合物4与近红外染料的摩尔比为1.2∶1；所述近红外染料为吲哚菁绿羧基衍生物Cypate。

[0037] 上述技术方案中，步骤（6）中，所述叶酸为叠氮修饰的叶酸；化合物5与叶酸的反应在抗坏血酸钠和硫酸铜存在下进行；化合物5、叶酸、抗坏血酸钠、硫酸铜的摩尔比为1∶1∶0.1∶0.05。

[0038] 上述技术方案中，步骤（7）中，紫外光照射时，波长为365～405 nm，照射强度为1～12 W/cm2，照射时间为1～10分钟；探针在肿瘤部位的富集时间为0.5～1小时。

[0039] 上述技术方案中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的化学结构式分别如下：

[0040]

[0041] NHS活化的双吖丙啶的化学结构式如下：

[0042]

[0043] 叠氮修饰的叶酸的化学结构式如下：

[0044]

[0045] 具体而言，本发明提供的方法，其包括如下步骤：

[0046] （1）构建、合成光交联型近红外分子探针：

[0047] 按照设计的合成步骤：首先炔丙胺与N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸发生酰胺缩合反应，随后用20%的三氟乙酸（二氯甲烷：三氟乙酸 = 4：1，v/v）；将中间体化合物Boc保护基团脱掉；接着与已经用NHS活化好的diazirine反应，所得的中间体化合物再用20%的哌啶（N,N-二甲基甲酰胺：哌啶 = 4：1，v/v）脱去保护基团Fmoc，与近红外染料Cypate发生酰胺缩合反应, 得到的中间体化合物进一步在抗坏血酸钠和硫酸铜催化下，与叶酸发生点击化学反应得到最终的探针DACF，结构式如下：

[0048]

[0049] （2）光交联型近红外分子探针DACF在紫外光照射后在细胞内的光交联作用：

[0050] 将步骤（1）中获得的所述光交联型性近红外分子探针溶于细胞培养基中，加入到4T1细胞培养皿中（浓度：1 μM），放入培养箱培养12 h。待探针与4T1细胞孵育时间结束，用PBS清洗一遍，加入新鲜的培养基后，并置于波长为365 405 nm的紫外光下照射，照射强度~
为1 12 W/cm2，照射时间为1 10分钟，分子探针即可与肿瘤细胞内的蛋白等大分子化合物~ ~
发生交联反应，从而延长其在肿瘤细胞内的滞留时间，有利于实现对肿瘤细胞的长时间追踪。

[0051] （3）光交联型近红外分子探针DACF在紫外光照射后在肿瘤内的光交联作用：

[0052] 将步骤（1）中获得的所述光交联型性近红外分子探针溶于PBS注射液中（浓度：45 μM），以尾静脉注射的方式将探针注入荷有两个瘤（4T1乳腺癌）的BALB/c/nu雌性裸鼠体内。待探针在肿瘤部位富集0.5 1小时后，置于波长为365 405 nm的紫外光下照射，照射强度为~ ~
1 12 W/cm2，照射时间为1 10分钟，分子探针即可与肿瘤细胞内的蛋白等大分子化合物发~ ~
生交联反应，从而延长其在肿瘤细胞内的滞留时间，有利于实现对肿瘤部位的长时间追踪诊断。

[0053] 本发明中，化合物5与叶酸反应后，使用半制备型高效液相色谱分离提纯，得到紫外光触发交联型近红外分子探针，产物为青蓝色的固体粉末。优选的，所述的高效液相色谱分离方法为：C18柱，3.5 μm，4.6×100 mm；流动相：A是三氟乙酸：水 = 1：1000；B是三氟乙酸：乙腈 = 1：1000；流速：1 mL/min；线性梯度洗脱程序：0 min，A：B = 95：5；12 min，A：B = 0：100。

[0054] 本发明中，紫外光照射的紫外光由紫外光发射装置提供，紫外光发射装置为手持式紫外灯或紫外激光器，优选紫外光发射装置为紫外激光器。

[0055] 本发明的制备方法通过光触发交联反应，提高探针在肿瘤细胞内的富集量和延长其滞留时间。

[0056] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0057] （1）本发明中首次使用了双吖丙啶（diazirine）功能化修饰近红外染料，光触发条件温和、简单；

[0058] （2）光交联型性近红外分子探针在紫外光触发下发生光交联反应不受外界环境影响；

[0059] （3）当探针进入肿瘤细胞后，在紫外光的照射下，会迅速转化为卡宾活性中间体，随后通过与C-H、O-H、N-H 和 S-H快速发生插入反应共价键交联于周围的大分子蛋白上，交联反应非常高效。

附图说明

[0060] 图1为实施例1中光交联型性近红外分子探针DACF的合成流程图；

[0061] 图2为实施例2中光交联型性近红外分子探针DACF的作用机理示意图；

[0062] 图3为实施例3中光交联型性近红外分子探针DACF的高效液相色谱纯度表征（a）和高分辨质谱表征（b）；

[0063] 图4为实施例4中光交联型性近红外分子探针DACF的紫外吸收光谱和荧光光谱情况（a）以及探针的毒性情况（b）；

[0064] 图5为实施例5中照射不同时间的405 nm激光后，4T1细胞的存活荧光照片；

[0065] 图6为实施例6中照射405 nm激光后，不同时间内4T1细胞的荧光照片（a）和对应的标准荧光强度图（b）；

[0066] 图7为实施例7中照射405 nm激光后，不同时间内老鼠肿瘤部位的近红外荧光照片（a）和对应的标准荧光信号强度图（b）；

[0067] 图8为实施例8中照射405 nm激光后，不同时间内老鼠肿瘤部位的光声照片（a）和对应的标准光声信号值（b）。

具体实施方式

[0068] 下文将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释和说明本发明中的技术方案，而并非旨在限制本发明的范围。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得。

[0069] 实施例1：光交联型近红外分子探针的合成与表征

[0070] （1）在100 mL 圆底烧瓶中加入炔丙胺（0.29 mL）、N,N-二甲基甲酰胺（30 mL）、HOBt（0.68 g, 5.04 mmol）、HBTU（1.91 g, 5.04 mmol）和二异丙基乙胺（1.08 g, 8.4 mmol）不断搅拌均匀。随后，向反应瓶中加入N-叔丁氧羰基-N’-芴甲氧羰基-D-赖氨酸（1.97 g, 4.2 mmol），继续搅拌，室温反应过夜（20小时）。反应结束后，旋蒸除去溶剂，加入30 mL乙酸乙酯重新溶解中间体化合物。随后有机相分别用30 mL去离子水、饱和碳酸氢钠和氯化钠水溶液各洗一次，用无水硫酸镁干燥后旋干，得到白色粉末状中间体1（其结构如图1中的化合物1所示）（1.95 g, 产率：92%）。

[0071] 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)，δ (ppm)：8.35 (s，1H)，7.90 (d，J = 7.5 Hz，2H)，7.74 (dd，J = 7.2，4.3 Hz，2H)，7.48 (d，J = 8.2 Hz，1H)，7.42 (t，J = 7.4 Hz，2H)，
7.34 (t，J = 7.4 Hz，2H)，6.77 (t，J = 5.1 Hz，1H)，4.25 (m，3H)，3.95 (d，J = 5.1 Hz，
1H)，3.86 (dd，J = 5.2，2.3 Hz，2H)，3.10 (t，J = 2.5 Hz，1H)，2.89 (d，J = 2.7 Hz，
13
2H)，1.56 (dd，J = 10.2，4.1 Hz，2H)，1.37 (s，11H)，1.23 (s, 2H)；C NMR (101 MHz，CDCl3)，δ (ppm)：171.02，155.84，143.24，140.82，127.29，126.63，124.59，119.53，78.77，
71.29， 66.61，54.15，46.65，31.49，29.16，28.71，27.96，21.94；MS (ESI-TOF) Calc’d for C29H35N3NaO5 [M+Na]+，528.2474；found，528.2470。

[0072] （2）在50 mL 圆底烧瓶中加入16 mL的二氯甲烷和4 mL的三氟乙酸搅拌均匀。随后将中间体化合物1（1.01 g, 2 mmol）加入反应瓶中，室温搅拌反应1 h。反应结束后，旋蒸除去反应液，用硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 10：1，v/v），得到白色固体中间体2（其结构如图1中的化合物2所示）（0.65 g, 产率：80%）。

[0073] 1H NMR (400 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)：8.43 (s，1H)，7.93 (d，J = 7.5 Hz，2H)，7.82 (s，2H)，7.77 (t，J = 7.2 Hz，2H)，7.55 (d，J = 8.3 Hz，1H)，7.46 (t，J = 7.3 Hz，
2H)，7.37 (t，J = 7.4 Hz，2H)，4.31 (d，J = 6.5 Hz，2H)，4.26 (d，J = 6.2 Hz，1H)，3.99 (dd，J = 13.6，8.9 Hz，1H)，3.90 (dd，J = 5.3，2.3 Hz，2H)，3.15 (t，J = 2.4 Hz，1H)，
2.80 (d，J = 5.4 Hz，2H)，1.61 (m，4H)，1.36 (m，2H)；13C NMR (101 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)：171.69，155.98，43.81，140.70，127.62，127.05，125.29，120.10，81.03，73.02，
65.59，54.22，46.64，31.17，27.94，26.52，22.40；MS (ESI-TOF) Calc’d for C24H27N3NaO3 [M+Na]+，428.1950；found，428.1932。

[0074] （3）在50 mL 圆底烧瓶中加入15 mL的二氯甲烷、NHS活化的双吖丙啶（NHS-diazirine）（0.25 g, 1 mmol）、中间体化合物2（0.41 g, 1 mmol）和二异丙基乙胺（278 μL, 2 mmol），室温搅拌反应2 h。反应结束后，有机相用25 mL去离子水洗三遍，25 mL氯化钠水溶液洗一遍，用无水硫酸镁干燥后旋干。随后用硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 20：1，v/v），得到白色固体中间体3（其结构如图1中的化合物3所示）（0.49 g, 产率：95%）。

[0075] 1H NMR (400 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)：8.30 (s，1H)，7.86 (d，J = 7.5 Hz，2H)，7.78 (s，1H)，7.70 (t，J = 7.0 Hz，2H)，7.43 (d，J = 8.2 Hz，1H)，7.39 (t，J = 7.4 Hz，
2H)，7.30 (t，J = 7.4 Hz，2H)，4.21 (dt，J = 16.2，6.8 Hz，3H)，3.90 (dd，J = 13.7，8.8 Hz，1H)，3.82 (d，J = 2.9 Hz，2H)，3.07 (s，1H)，2.97 (dt，J = 14.0，7.0 Hz，2H)，1.90 (t，J = 7.7 Hz，2H)，1.52 (m, 4H)，1.34 (dd，J = 14.1，7.2 Hz，2H)，1.24 (d，J = 39.2 Hz，2H)，0.93 (s，3H)；13C NMR (101 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)：172.22，170.88，156.37，
144.26，141.13，128.06，127.48，125.76，120.52，81.49，73.43，66.05，54.83，47.09，
31.95，30.24，29.13，28.36，19.74；MS (ESI-TOF) Calc’d for C29H33N5NaO4 [M+Na]+，
538.2430；found，538.2415。

[0076] （4）在50 mL 圆底烧瓶中加入8 mL的N,N-二甲基甲酰胺和2 mL的哌啶搅拌均匀。随后将中间体化合物3（0.5 g, 0.97 mmol）加入反应瓶中，室温搅拌反应1 h。反应结束后，旋蒸除去反应液，用硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇 = 10：1，v/v），得到黄色油状物中间体4（其结构如图1中的化合物4所示）（0.2 g, 产率：70%）。

[0077] 1H NMR (400 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)： 8.25 (s，1H)，7.84 (s，1H)，3.88 (s，2H)，3.42 (s，2H)，3.14 (d，J = 7.1 Hz，1H)，3.11 (m，1H)，3.03 (dd，J = 12.5，6.6 Hz，2H)，
1.97 (t，J = 7.7 Hz，2H)，1.60 (d， J = 8.0 Hz，2H)，1.38 (m，4H)，1.27 (d，J = 5.8 Hz，2H)，1.01 (s，3H)；13C NMR (101 MHz，d6-DMSO)，δ (ppm)：174.99，170.43，81.29，
72.75，54.47，34.71，29.78，28.95，27.73，25.80，22.65，19.29；MS (ESI-TOF) Calc’d for +
C14H24N5NaO2 [M+Na]，316.1749；found，316.1737。

[0078] （5）在20 mL 圆底烧瓶中加入HOBt（4.7 mg, 0.035 mmol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（6.7 mg, 0.035 mmol）和Cypate（18.1 mg, 0.029 mmol）, 室温搅拌活化20 min。随后向反应瓶中加入中间体化合物4（10.3 mg, 0.035 mmol），继续室温搅拌反应8 h。反应结束后，使用半制备型高效液相色谱分离提纯，得到青蓝色的固体粉末中间体5（其结构如图1中的化合物5所示）（15.1 mg, 产率：58%）。

[0079] 1H NMR (400 MHz，CDCl3)，δ (ppm)：11.36 (s，1H)，9.62 (s，1H)，8.99 (s，1H)，8.12 (dd，J = 8.3，4.5 Hz，2H)，7.98 (dd，J = 19.3，8.4 Hz，4H)，7.82 (s，1H)，7.65 (dt，J = 15.5，8.0 Hz，3H)，7.51 (m，2H)，7.42 (d，J = 9.4 Hz，1H)，6.59 (s，1H)，6.31 (s，1H)，5.46 (s，5H)，4.59 (dd，J = 7.5，5.7 Hz，1H)，4.44 (m，2H)，4.00 (d，J = 3.6 Hz，2H)，3.39 (d，J = 5.4 Hz，2H)，3.22 (s，3H)，2.06 (dd，J = 11.4，5.9 Hz，6H)，1.99 (d，J = 3.3 Hz，6H)，1.71 (m，2H)，1.46 (d，J = 9.2 Hz，6H)，1.33 (d，J = 6.6 Hz，4H)，
1.02 (s，2H)，0.92 (s，3H)；HRMS (ESI)：m/z calcd for C55H62N7O5+ [M]+，900.4807；
found，899.9542。

[0080] （6）在5 mL 圆底烧瓶中加入DMSO （1 mL）、中间体化合物5（9 mg, 0.01 mmol）和已经修饰好叠氮分子的叶酸化合物（5.2 mg, 0.01 mmol），搅拌均匀。同时，将抗坏血酸钠（0.2 mg, 10 mmol%）和无水硫酸铜（0.09 mg, 5 mmol%）混合溶于1 mL去离子水中，再将混合液加入到反应烧瓶中，室温搅拌反应8 h。反应结束后，使用半制备型高效液相色谱分离提纯，得到分子探针DACF（青蓝色的固体粉末，12.8 mg, 产率：94%）。

[0081] HRMS (ESI)：m/z calcd for C77H87N18O10+ [M]+，1423.6847；found，1423.1622。

[0082] 实施例2：光交联型近红外分子探针DACF在紫外光照射后的光交联作用

[0083] 如图2所示，将实施例1中制得的光交联型近红外分子探针DACF稀释到细胞培养基中，之后加入到4T1细胞培养皿中共孵育。当探针进入肿瘤细胞后，经紫外光照射，探针所带基团会生成中间体卡宾，随后通过C-H、O-H、N-H 和 S-H插入反应与周围的大分子蛋白等共价键结合，使探针分子与肿瘤细胞内的大分子蛋白等牢固连接，从而延长探针分子在细胞内的滞留时间，改善探针分子的成像和治疗效果，机理参见附图2。

[0084] 实施例3：光交联型近红外分子探针DACF的高效液相色谱纯度表征和高分辨质谱表征

[0085] 将实施例1中制得的光交联型近红外分子探针用溶剂甲醇稀释到浓度为5 μM后，通过高分辨质谱对探针进行分子量确定，并使用高效液相色谱仪对其进行纯度分析。

[0086] 如图3a所示，使用Agilent 1260高效液相色谱仪对样品进行分析，探针DACF的保留时间在8.176分钟，进一步对出峰面积进行积分，计算得到样品中探针浓度高达99%。图3b展示探针DACF的理论m/z：1423.6847，实际得到高分辨质谱谱图中m/z：1423.1622，两者相吻合，即为所要化合物。

[0087] 实施例4：光交联型近红外分子探针DACF的紫外吸收光谱和荧光光谱情况以及探针的毒性情况

[0088] 将实施例1中制得的光交联型近红外分子探针用溶剂稀释到浓度为5 μM后，分别使用紫外-可见吸收光谱仪和稳态/瞬态荧光光谱仪去测量探针的紫外吸收光谱和荧光光谱；通过MTT（噻唑蓝）比色法考察探针对4T1的细胞毒性。

[0089] 如图4a所示，通过紫外吸收光谱发现，探针DACF在650-800 nm的范围内有两个明显吸收峰，其最大吸收峰在785 nm；通过荧光光谱发现，探针DACF在805-900 nm范围内有一个发射峰，其最大发射在830 nm。

[0090] 图4b是分子探针DACF的细胞毒性实验，细胞的存活率与探针浓度存在依赖关系，随着浓度的增加，探针对细胞的毒性是不断增大的。但是，分子探针DACF在浓度为14 μM时，细胞存活率仍有80%以上，这个浓度远远高出临床中所使用的探针浓度。

[0091] 实施例5：照射不同时间的405 nm激光器对4T1细胞的损伤情况

[0092] 细胞毒性实验方法：小鼠乳腺癌细胞（4T1）在6孔板中（密度3×105个/孔）培养，孵育24 h后，经紫外激光（405 nm，功率为1 W/cm2）照射不同的时间（0，1，2，4，8，10 min），然后放入培养箱继续培养4 h，之后弃上清，加入Live-Dead染色液，培养箱培养30 min，染后用莱卡荧光显微镜进行拍照观察。

[0093] 如图5所示，当照射405 nm激光的时间在4分钟以内，相比没有照射激光的对比组，可以明显看到4T1细胞的存活率非常高，基本没有死亡的细胞。然而，当405 nm激光的照射时间在8分钟以上，4T1细胞就会受到较强的损伤，出现了大面积的细胞死亡。因此照射405 nm激光的时间优选1.5分钟。

[0094] 实施例6：光交联型近红外分子探针DACF在4T1细胞内经紫外光照射后探针的滞留情况

[0095] 基于实施例2中记载的方法，将4T1细胞并接种于8孔板的共聚焦小皿中，每孔5×3
10 个细胞，放入培养箱中培养24小时。之后弃培养基，加入相同浓度的含探针细胞培养基（探针浓度1 μM），200 μL，放入培养箱培养12 h，待探针与4T1细胞孵育时间结束，于405 nm激光器（1 W/cm2）照射1.5 min, 同时设置实验对照组，照射结束，加入新鲜的培养基置于培养箱中继续培养8 h、24 h和48 h。后用Hoechst 33342染液染核，用激光共聚焦显微镜观察在405 nm激光器照射后不同时间内4T1细胞中的荧光情况

[0096] 如图6a所示，在起始0 h的时候，在4T1细胞内的红色荧光强度是一样的。在照射完405 nm激光后8 h时，其4T1细胞内的红色荧光明显强于未照射405 nm激光的对照组。并且随着时间的延长，未照射405 nm激光的对照组荧光减弱的非常迅速，在24 h之后，其4T1细胞内几乎观察不到红色荧光信号。对比照射405 nm激光的实验组，在48 h时其4T1细胞内还可以观察到明显的红色荧光。图6b是对应的荧光定量数据，照射405 nm激光的实验组，可以延长探针在细胞内滞留48 h，而未照射405 nm激光的对照组仅仅在细胞内保持了24 h。因此光交联型近红外分子探针DACF能够潜在应用于细胞示踪。

[0097] 实施例7：光交联型性近红外分子探针DACF在小鼠肿瘤部位近红外荧光成像情况[0098] 基于实施例2中记载的方法，取荷有两个瘤的BALB/c/nu雌性裸鼠，以尾静脉注射的方式将探针DACF注入裸鼠体内，给药浓度为45 μM（200 μL/每只）。注射探针半个小时后，使用405 nm激光器（1W/cm2）对老鼠左侧肿瘤激光照射10 min，右侧肿瘤则不照射405 nm激光作为对照组。之后置于小动物IVIS Lumina XRMS活体成像系统中，观察探针在裸鼠的两个肿瘤内分布情况，并通过IVIS活体成像分析软件计算裸鼠的两个肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。

[0099] 如图7a所示，在1 h时，分子探针在老鼠左右两个肿瘤内的荧光信号强度是一致的。之后随着时间的延长，探针在老鼠体内逐渐代谢，在8 h时，右侧未照射405 nm激光的肿瘤部位的荧光信号逐渐减低，并且低于左侧照射405 nm激光的肿瘤部位的荧光信号。在12 h时，右侧未照射405 nm激光的肿瘤部位的荧光信号几乎没有，而左侧照射405 nm激光的肿瘤部位直至24 h，依然具有明显的荧光信号。通过图7b肿瘤部位的荧光信号统计，可以清晰看到，未照射405 nm激光肿瘤部位在12 h时已经没有荧光强度信号，而实验组肿瘤部位荧光信号可以持续24 h。通过体内荧光成像的结果证明了本发明的光交联探针可以在肿瘤部位进行光交联反应，交联在肿瘤内，减少细胞代谢外排，使探针在肿瘤部位长时间滞留，从而延长荧光成像时间。

[0100] 实施例8：光交联型性近红外分子探针DACF在小鼠肿瘤部位光声成像情况

[0101] 取荷有两个瘤的BALB/c/nu雌性裸鼠，以尾静脉注射的方式将探针DACF注入裸鼠体内，给药浓度为45 μM（200 μL/每只）。注射探针半个小时后，使用405 nm激光器（1W/cm2）对老鼠左侧肿瘤激光照射10 min，右侧肿瘤则不照射405 nm激光作为对照组。同时将小动物光声成像系统打开，待光声成像仪水浴池中的水温达37 oC时，放入麻醉好的裸鼠，扫描裸鼠的两个肿瘤部位图像。之后将获得的光声成像数据使用MSOT inSight/inVision分析软件进行重建分析。

[0102] 从图8a中可以看到，在8 h的时候，照射405 nm激光的肿瘤部位展现出很强的光声信号，未照射405 nm激光的肿瘤部位光声信号已经很弱，在12 h时，光声信号已经接近消失。而后照射405 nm激光的肿瘤部位在24 h依然展现出清晰地光声信号。通过图8b肿瘤部位的光声信号统计，也可以观察到，照射405 nm激光的肿瘤部位直到24 h依然具有较强的光声信号，而对照组光声信号值已经趋近于0。结合以上荧光成像和光声成像的结果，可以得出本发明的探针DACF能够在肿瘤部位进行光交联反应，并交联在肿瘤内，减少细胞代谢外排，使探针在肿瘤部位长时间滞留，从而延长光声成像时间。

[0103] 光敏感探针应用于光交联型标记蛋白方面的研究已经取得了令人瞩目的发展。为了克服传统近红外分子探针的缺点，构建一种光交联型近红外分子探针，利用光触发交联反应，提高探针在肿瘤部位的富集量和延长其滞留时间，进而有效的改善肿瘤的成像效果。它具有以下几个优点：首先，光触发条件温和、简单；第二，光交联反应不受肿瘤部位pH等条件的影响；第三，当探针进入肿瘤细胞后，在紫外光的照射下，会迅速转化为卡宾活性中间体，随后通过与C-H、O-H、N-H 和 S-H快速发生插入反应共价键交联于周围的大分子蛋白上，交联反应非常高效。因而使近红外分子探针在生物等领域有进一步应用。