一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用，该方法是由骆驼鲜奶为原料，在温度4℃离心除奶油，采用传统的等电点法沉淀、透析袋、浓缩、冷冻干燥得到总酪蛋白，用胰蛋白酶水解，利用冷冻干燥精制而成抗氧化多肽，再通过超滤膜、凝胶柱子和高效液相分离纯化，得到具有比较强的抗氧化活性的三种骆驼奶抗氧化多肽。其氨基酸一级解构通过高分辨质谱与液质连用色谱技术相结合确定为三个多肽：RLDGQGRPRVWLGR(1665.94Da)，TPDNIDIWLGGIAEPQVKR(2122.13Da)和VAYSDDGENWTEYRDQGAVEGK(2489.09 Da)。该多肽具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然蛋白质、18种氨基酸，更适合作为老年人和婴幼儿的理想乳品。

权利要求

1.一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：a、将骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

b、将步骤a上清液用1mol/L的HCL溶液调pH 4.0‑4.5，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的HCl调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，所述透析使用的透析袋规格是1000Da；

e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，其中电泳分离胶为体积

15%的丙烯酰胺；

f、将步骤e中得到的酪蛋白，加入蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为 1 mol/L 的 NaOH 调节溶液 pH 值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无明显颗粒且pH 值无明显变化时，加质量比为1.0%的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为1 mol/L的 NaOH维持酪蛋白水解液 pH值至 8.0并缓慢搅拌酶解 4 h，并于温度100℃沸水浴中灭酶10 min，自然冷却至室温；

g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

h、将步骤g中的溶液在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；

i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa 和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1% 的三氟乙酸；

k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70%乙腈0‑40 min，流速为2.5 mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。

2.根据权利要求1所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备保健品的用途。

3.根据权利要求1所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备食品中的用途。

4.根据权利要求1所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备食品添加剂中的用途。

说明书

一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 经过近20年的发展，2016年我国的乳制品产量为2782.5万吨，2017年上半年1466.3万吨，乳制品工业成为关系国计民生的重要产业。但是与此同时，产品结构不合理、
同质化现象严重、企业利润下滑等也成为行业继续前行的障碍。

[0003] 骆驼在全世界许多国家的人们生活中扮演着重要的角色，特别是在那些干旱地区。除了骑乘、驮运、拉车、犁地等功能外，骆驼还能提供乳和肉，在人们的经济生活和食品
来源方面做出贡献。据联合国粮食与农业组织统计，现在全世界约有骆驼1900万峰，其中大
约有1500万峰产于非洲，400万峰产于亚洲。另据估计，其中单峰驼约1700万峰，主要作为乳
用；双峰驼约200万峰，主要供役用和绒用。中国、蒙古等双峰驼的泌乳期是14‑16个月，母驼
平均日产奶量为5kg左右，个别个体高达20kg，通常有2kg被人所用，其余为幼驼所食。骆驼
奶不仅营养丰富，而且具有很好的保健功能。通过对国内外大量文献资料比对，全面综述了
骆驼奶在营养和保健方面的功能，以期为骆驼奶的推广和深加工提供一些理论依据。

[0004] 骆驼奶在阿拉伯地区被称为“沙漠白金”，其口味微甜，比牛奶的营养价值更高，是当地的常见饮品。驼奶所含的维生素C和铁分别是牛奶的3倍和10倍，不饱含脂肪酸、蛋白
质、镁、钙等含量也高于牛奶，1L驼奶含52单位胰岛素，远高于牛奶的0.016单位，驼奶富含
牛奶所缺少的具有杀菌和强化人体免疫力的乳铁传递蛋白的溶解酵素，而脂肪含量则低于
牛奶。因此，驼奶具有强身健体、提高人体免疫力、抗癌、治疗糖尿病等功效。哈萨克人民长
期以来就用驼奶治疗肺结核病。2009年新疆医科大学第二附属医院经临床研究发现，在不
接受正规治疗的情况下，部分乙肝患者饮用了一段时间骆驼奶后实现了乙肝转阴。骆驼奶
具有滋阴壮阳的功效，俄罗斯、哈萨克斯坦、印度等国医生更是将骆驼奶作为帮助病人康复
的处方药，饮用骆驼奶有助于水肿、黄疸、脾脏疾病、肺结核、小船、贫血和痔疮等患者的康
复。非洲一些国家的艾滋病患者被建议服用骆驼奶，索马里人坚信骆驼奶有治病功效。以色
列和德国的比较生理学研究表明，骆驼奶具有明显的抗糖尿病特征。引用骆驼奶可帮助I型
糖尿病患者大幅度减少胰岛素注射量。

[0005] 从国内看，骆驼奶原来是农牧民自挤自饮和在家招待客人的饮品，极少对外销售，骆驼奶产量常年保持在4万t左右，仅占世界总产量的0.74％。但是今年牛奶业问题频发，而
骆驼奶因其独特的成分和功效成为一种新的高端饮品，引用骆驼奶正成为一种新时尚。国
内市场上的骆驼奶主要产自新疆，消费人群主要是哈萨克群众、康复人士、老人、医务工作
者和教师等。目前，北京、上海、福建、浙江、江苏、河北、黑龙江、重庆、香港、台湾、等地开始
销售骆驼奶，并且有了一定的知名度。骆驼奶身价不菲，一瓶180g的业态驼奶售价48元，一
罐300g的骆驼奶粉售价588元，但销售依然很好，供不应求，骆驼奶在内地城市销售空间已
经初步打开，前景光明。

[0006] 骆驼奶是骆驼用其生命来演绎的营养物质，纯天然、绿色。骆驼奶除了具有高营养价值以外，还可以辅助治疗糖尿病，同时还可以补铁，属于天然的多功能乳品。最新研究表
明，每天摄入约500毫升的骆驼奶，可以有效降低血液中葡萄糖水平，减少人体对于胰岛素
的需求量。相关人士指出，骆驼奶含有类胰岛素因子，可以辅助降糖，可用于糖尿病的治疗。

发明内容

[0007] 本发明目的在于，提供一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用，该方法是由骆驼鲜奶为原料，在温度4℃离心除奶油，采用传统的等电点法沉淀、透析袋、浓缩、冷冻干
燥得到总酪蛋白，用胰蛋白酶水解，利用冷冻干燥精制而成抗氧化多肽，再通过超滤膜、凝
胶柱子和高效液相分离纯化，得到具有比较强的抗氧化活性的三种骆驼奶抗氧化多肽。其
氨基酸一级解构通过高分辨质谱与液质连用色谱技术相结合确定为三个多肽：
RLDGQGRPRVWLGR(1665.94Da),TPDNIDIWLGGIAEPQVKR(2122.13Da)和
VAYSDDGENWTEYRDQGAVEGK(2489.09Da)。该多肽具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含
人体易消化和吸收的纯天然蛋白质、18种氨基酸(含人体必须但自身不能合成的全部8种氨
基酸)、铁、维生素B和维生素C等营养元素，更适合作为老年人和婴幼儿的理想乳品。

[0008] 本发明所述的一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法，按下列步骤进行：

[0009] a、将骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

[0010] b、将步骤a上清液用1mol/L的HCl溶液调pH 4.0‑4.5，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

[0011] c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的HCl调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

[0012] d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，所述透析使用的透析袋规格是1000Da；

[0013] e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，其中电泳分离胶为体积15％的丙烯酰胺；

[0014] f、将步骤e中得到的酪蛋白，加入蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无明显颗
粒且pH值无明显变化时，加质量比为1.0％的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为1mol/L的
NaOH维持酪蛋白水解液pH值至8.0并缓慢搅拌酶解4h，并于温度100℃沸水浴中灭酶10min，
自然冷却至室温；

[0015] g、按体积比1:3将步骤f中的总多肽中加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

[0016] h、将步骤g中的溶液在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；

[0017] i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

[0018] j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1％的三氟乙
酸；

[0019] k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70％乙腈0‑40min，流速为2.5mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。

[0020] 所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备保健品的用途。

[0021] 所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备食品中的用途。

[0022] 所述方法获得的骆驼奶抗氧化多肽在制备食品添加剂中的用途。

[0023] 本发明所述的一种骆驼奶抗氧化多肽的制备方法及其应用，通过该方法得到的骆驼奶抗氧化多肽分子量因氨基酸序列不同而有较大差异。骆驼奶酪蛋白含量高，可提高婴
幼儿免疫力和抗病力，可满足婴幼儿生长发育的营养需要。骆驼奶的核苷酸比牛奶、人奶含
量都高，对婴幼儿大脑发育增强智力十分有益。骆驼奶酪蛋白因其均衡的氨基酸组成、生物
利用率高和抗营养因子低而被作为蛋白的重要来源，也是获得生物活性肽的很好资源。该
方法以骆驼鲜奶为原料，经脱脂，采用传统的等电点法沉淀提取总酪蛋白，然后通过胰蛋白
酶水解而得到的总多肽，最终经超滤膜、凝胶色谱法、高效液相色谱法分离纯化得到三种不
同分子量和不同氨基酸序列的骆驼奶抗氧化多肽。然后将各部分多肽溶液进行真空干燥，
测不同分子量多肽的产率，使用5800MALDI‑TOF/TOF(AB SCIEX)质谱仪对蛋白质酶解产物
进行MS/MS质谱分析，然后进行数据库软件匹配，获得蛋白质的定性信息。将部位Ⅰb通过高
效液相色谱得到的三个抗氧化多肽的氨基酸序列和分子量分别为：RLDGQGRPRVWLGR
(1665.94Da),TPDNIDIWLGGIAEPQVKR(2122.13Da)和VAYSDDGENWTEYRDQGAVEGK
(2489.09Da)。适当的蛋白酶水解时，其活性被释放出来，不仅易于消化吸收，而且还具有多
种调节人体代谢及生理功能的作用，是开发功能性食品和筛选药物的天然资源宝库。酪蛋
白生物特性方面研究甚多，逐渐研发出多种活性肽，水解后的肽段更容易被人体吸收，还减
少婴幼儿过敏反应。它可安全食用，营养价值高，较强的生理保健功能。对于促进新疆特色
畜牧产业化发展的进程、优化产业结构、降低企业生产成本、增加企业经济效益及防止环境
污染、节能减排方面都具有积极意义。

[0024] 通过本发明所述方法获得的抗氧化多肽具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然优质蛋白质、氨基酸种类齐全、18种氨基酸(含人体必须但自
身不能合成的全部8种氨基酸)、铁、维生素B和维生素C等营养元素，更适合于老年人和婴幼
儿。在日常的肌肤保养品中，加入该抗氧化多肽的效果，会使肌肤的保养更向上提升。一般
来说，防止肌肤松弛、老化，进而达到抗氧化的成效。

[0025] 该抗氧化多肽的特点是保留骆驼奶原有的营养价值的同时，解析了骆驼奶的具有生物活性的功效成分，有助于骆驼奶资源的科学食用，以及更好地促进我区骆驼奶产业健
康、有序和可持续发展。骆驼奶多肽还有助消化、降血糖、降血压,甚至防癌抗癌等功效。为
该产品成为预防和辅助治疗糖尿病的功能性保健产品提供科学依据，同时也为骆驼奶及相
关产品的推广应用提供技术支持，为促进骆驼养殖业和骆驼奶产业的经济发展奠定基础。
随着人们对骆驼奶认识的深入,骆驼奶多肽的市场需求量必将越来越大。

附图说明

[0026] 图1为本发明驼奶酪蛋白和驼奶酪蛋白胰蛋白酶水解物15％SDS‑PAGE考马斯亮蓝电泳图：其中M为标准分子量蛋白；BCM为驼奶酪蛋白；TF为驼奶酪蛋白胰蛋白酶水解物；

[0027] 图2为本发明胰蛋白酶水解物凝胶色谱图；

[0028] 图3为本发明三个多肽高效液相色谱图；

[0029] 图4为本发明Ⅰb‑1多肽高效液相纯度分析色谱图；

[0030] 图5为本发明Ⅰb‑2多肽高效液相纯度分析色谱图；

[0031] 图6为本发明Ⅰb‑3多肽高效液相纯度分析色谱图；

[0032] 图7为本发明的质联用(LC/MS)图谱，其中A为Ⅰb‑1多肽；B为Ⅰb‑2多肽；C为Ⅰb‑3多肽。

具体实施方式

[0033] 实施例1

[0034] a、将100ml骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

[0035] b、将步骤a上清液用浓度为1mol/l的HCL溶液调pH值为4.0，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

[0036] c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃,转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的NaOH调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

[0037] d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，透析袋规格1000Da，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，多肽含量、抗氧化活性，见表2；

[0038] e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，得到3.2g总酪蛋白，计算得率(mg/ml)，见表1，其中电泳分离胶为体积15％的丙烯酰胺；

[0039] f、将步骤e中得到的酪蛋白10g，加200ml蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无
明显颗粒且pH值无明显变化时，加质量比为1.0％的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为
1mol/L的NaOH维持酪蛋白水解液pH值至8.0并缓慢搅拌酶解4h，并于温度100℃沸水浴中灭
酶10min，自然冷却至室温；

[0040] g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

[0041] h、将步骤g中的溶液在转速为10000r/min，温度4℃,离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到总多肽；

[0042] i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

[0043] j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1％的三氟乙
酸；

[0044] k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70％乙腈0‑40min，流速为2.5mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽(图3)。

[0045] 表1不同的pH值对酪蛋白得率和蛋白含量影响

[0046]

[0047] 表2骆驼奶酪蛋白胰蛋白酶水解物的抗氧化活性分析

[0048]

[0049] 实施例2

[0050] a、将100ml骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

[0051] b、将步骤a上清液用1mol/l的HCl溶液调pH值为4.3，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

[0052] c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的NaOH调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

[0053] d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，透析袋规格1000Da，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，多肽含量、抗氧化活性，见表2；

[0054] e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，得到4.1g总酪蛋白，计算得率(mg/ml)见表1，其中电泳分离胶为体积15％丙烯酰胺；

[0055] f、将步骤e中得到的酪蛋白10g，加200ml蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无
明显颗粒且pH值无明显变化时，加质量比为1.0％的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为
1mol/L的NaOH维持酪蛋白水解液pH值至8.0并缓慢搅拌酶解4h，并于温度100℃沸水浴中灭
酶10min，自然冷却至室温；

[0056] g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

[0057] h、将步骤g中的溶液在转速为10000r/min，温度4℃,离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；

[0058] i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

[0059] j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1％的三氟乙
酸；

[0060] k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70％乙腈0‑40min，流速为2.5mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。

[0061] 实施例3

[0062] a、将100ml骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

[0063] b、将步骤a上清液用1mol/l的HCl溶液调pH值为4.5，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

[0064] c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的NaOH调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

[0065] d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，透析袋规格1000Da，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，多肽含量、抗氧化活性，见表2；

[0066] e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，得到2.9g总酪蛋白，计算得率(mg/ml)见表1，其中电泳分离胶为体积15％丙烯酰胺；

[0067] f、将步骤e中得到的酪蛋白10g，加200ml蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无
明显颗粒且pH值无明显变化时，加质量比为1.0％的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为
1mol/L的NaOH维持酪蛋白水解液pH值至8.0并缓慢搅拌酶解4h，并于温度100℃沸水浴中灭
酶10min，自然冷却至室温；

[0068] g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

[0069] h、将步骤g中的溶液在转速为10000r/min，温度4℃,离心20min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；

[0070] i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

[0071] j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1％的三氟乙
酸；

[0072] k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70％乙腈0‑40min，流速为2.5mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。

[0073] 实施例4

[0074] a、将100ml骆驼鲜奶在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min，重复2次，除奶油，合并上清液；

[0075] b、将步骤a上清液用1mol/l的HCl溶液调pH值为4.3，在温度4℃冰箱放12个小时，使骆驼奶酪蛋白沉淀；

[0076] c、将步骤b中的沉淀部位在温度4℃，转速为10000r/min，离心20min后，将沉淀物加入蒸馏水溶解，并用1mol/l的NaOH调pH值为7.0，再用磁力搅拌器搅拌完全溶解；

[0077] d、将步骤c中的溶液用蒸馏水透析48h脱盐，透析袋规格1000Da，将已脱盐的酪蛋白浓缩，经冷冻干燥机温度‑80℃，压力9.8Pa，冻干24h，得到3.8g水解多肽，多肽提取率为
3.8g/10g＝38％，计算水解度为17.6％，多肽含量、抗氧化活性，见表2；

[0078] e、将步骤d中的酪蛋白通过电泳测抗氧化活性，测蛋白含量，得到2.9g总酪蛋白，计算得率(mg/ml)见表1，其中电泳分离胶为体积15％丙烯酰胺；

[0079] f、将步骤e中得到的酪蛋白10g，加200ml蒸馏水使蛋白溶解，调节溶液质量浓度为50g/L，再用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至8.0，于温度37℃水浴锅中溶解，当溶液无
明显颗粒且pH值无明显变化时，加质量比为1.0％的胰蛋白酶，于恒温水浴锅中用浓度为
1mol/L的NaOH维持酪蛋白水解液pH值至8.0并缓慢搅拌酶解4h，并于温度100℃沸水浴中灭
酶10min，自然冷却至室温；

[0080] g、按体积比1:3将步骤f中得到的水解液加入乙醇，在温度4℃冰箱放12个小时，使大分子蛋白沉淀；

[0081] h、将步骤g中的乙醇水溶液在温度4℃,转速为10000r/min，离心10min，除分子量大的蛋白质，用旋转蒸发器浓缩，冻干，得到分子量小的总多肽；

[0082] i、将步骤h中的总多肽通过3000Da的超滤膜分离，得到分子量小于3000Da的标记为Ⅰ和分子量大于3000Da的标记为Ⅱ；

[0083] j、将步骤i中得到的分子量小于3000Da的部位Ⅰ通过凝胶柱子分离，得到Ⅰa和Ⅰb两个部位，比较该两个部位的抗氧化活性，其中凝胶柱使用的缓冲溶液为体积0.1％的三氟乙
酸；

[0084] k、将步骤j中得到的部位Ⅰb再次通过梯度为25‑70％乙腈0‑40min，流速为2.5mL/min的高效液相色谱分离得到Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个骆驼奶抗氧化多肽。

[0085] 实施例5

[0086] 将得到的Ⅰb‑1，Ⅰb‑2，Ⅰb‑3三个抗氧化多肽通过高分辨质谱与液质连用色谱技术相结合确定分子量和氨基酸序列：RLDGQGRPRVWLGR(1665.94Da),TPDNIDIWLGGIAEPQVKR
(2122.13Da)和VAYSDDGENWTEYRDQGAVEGK(2489.09Da)(图4‑图7)。