一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用

摘要

本发明涉及一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用，属于生物技术领域。与植物耐旱相关的基因命名为NtDSR1，来源于栽培烟草，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。NtDSR1是一种调节烟草耐旱性的新基因，受干旱和高盐诱导高表达。将构建好的过量表达质粒PDT1‑NtDSR1导入植物，获得的NtDSR1过量表达的株系耐旱性比空载体对照株系显著增强，即在干旱条件下NtDSR1基因可提高植物幼苗期及营养生长时期的存活率，显著改善植物的耐旱性，可为烟草耐旱分子育种提供优良的候选基因。

权利要求

1.一种与植物耐旱相关的基因，其特征在于：基因序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述与植物耐旱相关的基因所编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.包含如权利要求1所述的与植物耐旱相关的基因的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将与植物耐旱相关的基因插入到相应表达载体的酶切位点，通过连接酶连接得到重组载体。

5.包含如权利要求1所述的与植物耐旱相关的基因的重组菌。

6.如权利要求5所述的重组菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将与植物耐旱相关的基因导入菌体中获得重组菌。

7.一种转基因细胞系的构建方法，其特征在于：将如权利要求1所述的与植物耐旱相关的基因导入植物细胞中获得转基因细胞系。

8.如权利要求1所述的与植物耐旱相关的基因、如权利要求3所述的重组载体、如权利要求5所述的重组菌在培育耐旱转基因植物方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求1所述的与植物耐旱相关的基因导入目的植物中，得到耐旱转基因植物。

说明书

一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种与植物耐旱相关的基因及其编码蛋白与应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 植物在整个生长发育过程中会遭受到到许多非生物逆境因子的胁迫，如干旱、高盐、低温等。干旱胁迫是各种逆境胁迫中最普遍的因子之一，严重地影响了植物的生长发育和作物的种植分布，造成农作物减产，同时也使生态环境日益恶化。因此，提高作物的抗旱能力对农业生产及生态环境保护具有重要的意义。

[0003] 烟草是一种重要的经济作物，其生长期对水分要求较高，若遭受干旱胁迫会严重影响烟叶产量和品质。近年来我国部分烟区频繁遭受严重干旱，旱灾发生的范围不断扩大，持续时间和遭受的损失增加，对我国烟叶的生产产生了极大的影响。通过兴修水利设施灌溉来解决烟草在生长季节时遭受的干旱问题，虽有不错的效果，但是成本太高，在短期内难以实现全部烟田有配套灌溉，而且该方法在有些烟区不可取。因此，获得具有耐旱性的烟草新品种，对烟草的优质高产具有重要的意义。传统的杂交育种由于受到抗性亲本资源缺乏的限制，获得优良品种的进程缓慢。随着烟草基因组计划的实施，烟草完成了全基因组测序。从烟草中分离出耐旱相关基因并将其应用到耐旱烟草分子育种中，对于保证烟草的品质和产量具有重要的现实意义。

[0004] 目前为止，虽有关于与植物耐旱相关的基因研究的报道，申请公布号为CN107177602A的中国发明专利申请公开了一种与植物耐旱相关的NtDR1基因及其应用，并通过试验证明NtDR1基因可明显增强植株的耐旱性能，但是针对NtDSR1基因在植物耐旱性方面的研究目前未见报道。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种与植物耐旱相关的基因，该基因可以提高植物在干旱条件下的存活率。

[0006] 本发明还提供上述与植物耐旱相关的基因所编码的蛋白质。

[0007] 另外，本发明提供一种含与植物耐旱相关的基因的重组载体及其构建方法。

[0008] 本发明提供一种含与植物耐旱相关的基因的重组菌及其构建方法。

[0009] 此外，本发明提供一种含与植物耐旱相关的基因的转基因细胞系及其构建方法。

[0010] 本发明还提供一种与植物耐旱相关的基因、包含与植物耐旱相关的基因的重组载体、包含与植物耐旱相关的基因的重组菌或包含与植物耐旱相关的基因的转基因细胞系在培育耐旱植株方面的应用。

[0011] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0012] 一种与植物耐旱相关的基因，来源于普通烟草，命名为NtDSR1，基因序列为：

[0013] (1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

[0014] (2)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.1限定的序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

[0015] (3)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列。

[0016] 上述(1)中SEQ ID NO.1为基因NtDSR1的编码区，由2643个碱基组成，编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的NtDSR1蛋白。在编码区中，碱基A占30.76％(813个)，碱基C占16.99％(449个)，碱基G占21％(555个)，碱基T占31.26％(826个)，其中A+T占62.01％(1639个)，C+G占37.99％(1004个)。

[0017] 上述的高严谨条件下与SEQ ID NO.1限定的序列杂交的具体操作步骤如下：

[0018] 将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12h；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

[0019] 上述与植物耐旱相关的基因所编码的蛋白质为如下氨基酸序列之一的蛋白质：

[0020] (1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

[0021] (2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱相关的衍生蛋白质。

[0022] 为了使NtDSR1基因编码的NtDSR1蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0023] 表1标签的序列

[0024]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0025] 一种含上述与植物耐旱相关的基因的重组载体。

[0026] 所述重组载体的构建方法为：将与植物耐旱相关的基因插入到相应表达载体的酶切位点，通过连接酶连接得到重组载体。比如，将上述与植物耐旱相关的基因插入pDT1的SpeI酶切位点，得到重组载体。

[0027] 在构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

[0028] 此外，在构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0029] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定与筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达且可产生抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。

[0030] 一种含上述与植物耐旱相关的基因的重组菌。

[0031] 所述重组菌的构建方法为：将与植物耐旱相关的基因导入菌体中获得重组菌。具体的可以将上述重组载体转入菌体中，筛选得到重组菌。

[0032] 一种含上述与植物耐旱相关的基因的转基因细胞系。

[0033] 所述转基因细胞系的构建方法为：将与植物耐旱相关的基因导入植物细胞中获得转基因细胞系。具体的可以将上述重组菌转入植物细胞中，培育得到转基因细胞系。

[0034] 上述与植物耐旱相关的基因、包含与植物耐旱相关的基因的重组载体、包含与植物耐旱相关的基因的重组菌或包含与植物耐旱相关的基因的转基因细胞系在培育耐旱植株方面的应用。

[0035] 上述与植物耐旱相关的基因在培育耐旱转基因植物方面的应用，步骤为：将与植物耐旱相关的基因导入目的植物中，得到耐旱转基因植物。

[0036] 上述与植物耐旱相关的基因是通过上述的重组载体导入目的植物中。携带有与植物耐旱相关的基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体，利用基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物细胞或组织中。

[0037] 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

[0038] 所述转基因植物的耐旱性高于野生型植物，转基因植物为耐甘露醇或耐干旱转基因植物。

[0039] 本发明的有益效果：

[0040] 本发明提供了一种与植物耐旱相关的新基因NtDSR1，该基因来源于烟草，受干旱和高盐诱导高表达。本发明通过对NtDSR1进行克隆、构建表达载体，导入目的植株中进行表达，证明NtDSR1过量表达株系在苗期及营养生长期的耐旱性比空载体对照株系强，即在干旱条件下NtDSR1基因可提高植物幼苗期及营养生长时期的存活率，显著改善植物的耐旱性，可为烟草耐旱分子育种提供优良的候选基因。

附图说明

[0041] 图1为本发明NtDSR1基因体外扩增电泳结果；

[0042] 图2为本发明NtDSR1基因在不同转基因株系中的表达水平；

[0043] 图3为本发明NtDSR1转基因植物的耐旱性分析；其中，图3A为模拟干旱时，对照和NtDSR1转基因植物表型比较；图3B为模拟干旱时，对照和NtDSR1转基因植物的子叶变绿率；图3C为干旱条件下，对照和NtDSR1转基因植物表型比较；图3D为模拟干旱时，对照和NtDSR1转基因植物的存活率。

具体实施方式

[0044] 下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

[0045] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中的试剂、材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 实施例1

[0048] 本实施例为NtDSR1基因的克隆，包括以下步骤：

[0049] (1)NtDSR1总RNA的提取

[0050] 取在正常生长条件下生长4周的K326烟草叶片，迅速在液氮中研磨成粉末状，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0mL TRIzol(Invitrogen)的1.5mL离心管中，置于-80℃保存备用。

[0051] 采用TRIzol试剂提取法提取总RNA：将在-80℃保存备用的样品取出，室温解冻后，加入200μL氯仿，振荡混匀，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μL异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75％的酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free水，充分溶解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理，即得总RNA。

[0052] (2)反转录反应

[0053] 取2μg总RNA进行反转录，加入0.5μg/μL Oligo(dT)1μL，然后加入去离子水补足到12μL，70℃保温5min后，依次加入5×RT buffer 4μL、20U/μL RNase抑制剂1μL、10mmol/L dNTP 2μL、37℃保温5min后加入200U/μL M-MLV反转录酶1μL，反应终体积为20μL。42℃反应
60min，70℃加热10min终止反应，得到反转录产物cDNA。

[0054] (3)PCR体外扩增

[0055] PCR扩增参考Clontech公司的In-fisuon方法，人工合成一对引物，并在其5’端分别加上15-20bp载体互补序列。上下游引物序列如下，下划线标注区域为载体接头序列：

[0056] NtDSR1P-F：

[0057] 5ˊ-TGACCTCGAGACTAGTATGAATGGTACATTACCTGA-3ˊ；

[0058] NtDSR1P-R：

[0059] 5ˊ-TACCGTCGCACCATACTAGTTCAAATAAGTGATGTAAAAC-3ˊ。

[0060] 以上述cDNA作为模板，以NtDSR1P-F和NtDSR1P-R为引物，采用高保真GXL DNA Polymerase(TAKARA)进行PCR扩增。在灭菌的PCR管中建立反应体系，如下表2所示，单位：μL。

[0061] 表2 PCR扩增反应体系

[0062]

[0063] 反应程序：98℃预变性5min；95℃10s、52℃15s、68℃3min、共35个循环，最后72℃延伸10min，反应结束后，电泳检测PCR结果(如图1中第1、2泳道所示，第3泳道为marker)。

[0064] (4)PCR产物的纯化

[0065] 电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收目的基因片断。

[0066] 测序鉴定，得出SEQ ID NO.1所示序列。

[0067] 实施例2

[0068] 本实施例为重组表达载体的构建，包括以下步骤：

[0069] (1)重组载体构建

[0070] 参照Clontech公司的in-fusion无缝连接说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系，如下表3所示，单位：μL。

[0071] 表3连接反应体系

[0072]

[0073] 50℃连接15min后，放冰上，用于下一步的转化。

[0074] (2)热激法连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

[0075] 无菌条件下取5μL连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2min(2-3min均可)，加无抗生素的LB培养基800μL，37℃摇床温和摇振1h，取200μL培养液涂于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养14h(12-16h均可)。

[0076] (3)表达载体的鉴定

[0077] 挑取培养基中长出的白色菌斑，分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养14h(12-16h均可)，利用碱裂解法小量提取质粒DNA，所得质粒经Bam HI和Hind III双酶切，结果正确的阳性克隆送公司测序，得到pDT1-NtDSR1重组表达载体。

[0078] 上述重组载体的构建过程中，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

[0079] 此外，基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0080] 实施例3

[0081] 本实施例为表达载体转化农杆菌，包括如下步骤：

[0082] 将表达载体pDT1-NtDSR1利用热激法转化农杆菌GV3101(农杆菌GV3101购于天根生化科技有限公司)，抽提质粒并进行酶切鉴定，采用方法与上述表达载体鉴定的步骤相同，结果表示表达载体pDT1-NtDSR1已经成功转化农杆菌。

[0083] 实施例4

[0084] 本实施例为培育耐旱转基因拟南芥，包括如下步骤：

[0085] 采用农杆菌浸染花序法将表达载体整合到拟南芥(Col-0)基因组中，筛选使用除草剂(0.1％)对幼苗进行喷洒，T2代幼苗继续使用除草剂(0.1％)筛选，选取分离比例为3:1的株系在T3代继续筛选，T3代时若幼苗100％可以在除草剂喷施后继续正常生长，则认为该株系为纯合株系。

[0086] 随机选取其中两个纯合株系进行分子检测。采用Trizol试剂提取法(Invitrogen)提取拟南芥总RNA。转基因拟南芥总RNA经反转录得到cDNA；以反转录所得cDNA为模板(反转录步骤与实施例1相同)，利用NtDSR1的特异引物(可扩增基因本身)进行实时定量PCR检测。结果显示，NtDSR1基因在不同转基因株系中均可表达，但表达水平存在差异，如图2所示。

[0087] 以上结果说明，NtDSR1基因已整合到拟南芥基因组中，且在转基因拟南芥中能进行稳定表达。

[0088] 经测序鉴定，得出的氨基酸序列确定为如SEQ ID NO.2所示的序列。

[0089] 试验例

[0090] 本试验例为拟南芥耐旱性的鉴定，包括以下步骤：

[0091] 将上述转pDT1-NtDSR1的拟南芥移至温室培养，自交后，收集转基因拟南芥的种子，同时以转pDT1的拟南芥为空载体对照株系，选取株系4和株系9两个表达水平相对较高的转基因株系用于后续的耐旱性鉴定。

[0092] 将同期收获的转pDT1-NtDSR1转基因拟南芥、转pDT1的拟南芥的种子消毒，种子分别点种到正常的MS培养基或含有300mM甘露醇的MS培养基上。培养皿黑暗放置于4℃，2天后将培养皿取出放到光照培养箱中，常规生长条件培养(光期培养16h，暗期培养8h；培养温度为22℃)，4天后统计萌发率。结果发现，NtDSR1的转基因株系在模拟干旱条件下的萌发率明显高于对照。另外，将上述消毒、纯化后的种子分别点种于含有300mM的甘露醇的MS培养基以及正常MS培养基上，生长条件为常规生长条件(光期培养16h，暗期培养8h；培养温度为22℃)。在高浓度甘露醇条件下，对照和转基因植株均可萌发，但对照大多数形成子叶后泛白死亡，而NtDSR1转基因植株的受抑制程度较弱，表现为子叶变绿率高于对照(如图3中A，B所示)。将转pDT1-NtDSR1的转基因拟南芥、转pDT1的拟南芥萌发后转移到营养土中，常规条件(光期培养16h，暗期培养8h；培养温度为22℃)生长3周后开始断水。断水14天后开始复水，复水一周后拍照。结果如图3所示，转pDT1-NtDSR1的拟南芥(株系4、株系9)在经历先断水后复水之后的成活率明显高于空载体对照株系(如图3中C，D所示)。

[0093] 综上所述：在干旱/模拟干旱胁迫下，转pDT1-NtDSR1的转基因拟南芥的耐受性明显强于与空载体对照株系。