一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供的β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶PbNag39的酶学性质优异，对几丁二糖的比酶活为28.3U/mg，水解几丁寡糖的终产物均为N‑乙酰氨基葡萄糖。将该β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质粉末，可高效制备得到N‑乙酰氨基葡萄糖。本发明的β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶具有比酶活高、热稳定性好和水解特性优异的特点，能在较广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用，在几丁质转化中具有重要的应用价值。

权利要求

1.氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质在水解几丁二糖中的应用。

2.制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，为方法A或方法B或方法C；

所述方法A包括如下步骤：采用权利要求1中所述的蛋白质水解几丁二糖，制备β-N-乙酰氨基葡萄糖；所述水解的液体环境为pH 5.5、50 mM乙酸-乙酸钠缓冲液；所述水解的温度为60℃；所述的蛋白质在水解体系中的浓度为1 U/mL；

所述方法B包括如下步骤：采用权利要求1中所述的蛋白质水解几丁寡糖，制备β-N-乙酰氨基葡萄糖；所述几丁寡糖的聚合度为3-5；所述水解的液体环境为pH 5.5、50 mM乙酸-乙酸钠缓冲液；所述水解的温度为60℃；所述的蛋白质在水解体系中的浓度为1 U/mL；

所述方法C包括如下步骤：采用权利要求1中所述的蛋白质和几丁质酶协同水解几丁质制备β-N-乙酰氨基葡萄糖；所述的蛋白质在水解体系中的浓度为1 U/mL；所述几丁质酶在水解体系中的浓度为5 U/mL；所述水解的液体环境为pH 5.5、20 mM的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液；所述水解的温度为55℃；

所述几丁质需经过预处理，所述预处理方法为：（1）取几丁质粉末，与球磨珠按照体积比2：1混合，球磨机转速380 r/min，功率4 kW，球磨4 h后取出放置干燥箱中；（2）将步骤（1）得到的球磨几丁质与天然低共熔溶剂混合，球磨几丁质在溶液中的质量百分含量为3%，110℃反应40 min后取出，在冰上加入过量的蒸馏水，11510 g离心6 min，收集沉淀，加入过量的蒸馏水重悬，超声5 min，以上步骤重复3次，最后将预处理过后的几丁质粉末冻干备用；

所述天然低共熔溶剂的制备方法为：分别以1:2的摩尔比例精确称取一定量的氯化胆碱和乳酸，混合后80℃水浴 2 h直至获得澄清透明液体，放置干燥箱中1-2周。

3.包括权利要求1中所述蛋白质和几丁质酶的组合物在制备产品中的应用，所述产品的功能为催化几丁质转化为N-乙酰氨基葡萄糖。

4.包括权利要求1中所述蛋白质和几丁质酶的组合物在制备N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

说明书

一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码

基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 几丁质是β-N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖，广泛存在于自然界中，其含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹的甲壳、昆虫的外壳以及植物和真菌的细胞壁中(LvY.M.,Laborda P.,Huang K.,et al.Highly efficient and selective biocatalytic production of glucosamine from chitin.Green Chemistry,2017,19:527-535)。几丁质降解酶系按酶切位置和作用方式不同可分为内切几丁质酶(endochitinase，EC 3.2.1.14)、外切几丁质酶(exochitinase，EC 3.2.1.14)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，EC 3.2.1.52)。内切几丁质酶能随机水解几丁质主链中β-1,4-糖苷键，产生低分子量的几丁寡糖，而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶则从几丁寡糖的非还原端逐个切下N-乙酰氨基葡萄糖。

[0003] 根据氨基酸序列的同源性，现有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分属于糖苷水解酶3、20、84和116家族。迄今，绝大多数β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶3、20和84家族，少数属于糖苷水解酶116家族，糖苷水解酶18家族的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶尚未见报道。

[0004] N-乙酰氨基葡萄糖长期以来广泛应用于食品、医药和化妆品等行业(Chen J.K.,Shen C.R.and Liu C.L.N-Acetylglucosamine:Production andApplications.Marine Drugs,2010,8:2493-2516)。传统上，N-乙酰氨基葡萄糖是通过酸水解几丁质产生，产生的大量酸性废弃物会导致严重的环境污染(Patil N.S.and Jadhav J.P.Enzymatic production of N-acetyl-D-glucosamine by solid state fermentation of chitinase by  Penicillium  ochrochloron  MTCC  517  using  agricultural residues.International Biodeterioration&Biodegradation,2014,91:9-17)。因此，N-乙酰氨基葡萄糖的绿色生物生产具有重要的意义和应用价值。近年来，酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖因其高效无污染而被广泛关注。如专利号2015107793579利用几丁质酶与几丁质的亲和吸附可高效生产N-乙酰氨基葡萄糖。Suresh等(Suresh P.V.and  Kumar P.K.A.Enhanced degradation of a-chitin materials prepared from shrimp processing byproduct and production of N-acetyl-D-glucosamine by thermoactive chitinases from soil mesophilic fungi.Biodegradation,2012,23:597-607)利用几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解几丁质粉末生产N-乙酰氨基葡萄糖，得率为23.7％。

[0005] 为了高效的完全转化几丁质为N-乙酰氨基葡萄糖，几丁质往往需要预处理。传统的预处理方法主要包括机械方法(球磨)、化学方法(酸碱等)和生物方法，其中球磨是一种能够显著降低几丁质结晶度从而提高其转化率的预处理方法。近年来一些新型的预处理方法如天然低共熔溶剂(NADESs)由于其具有化学性质稳定、不可燃性、低蒸气压、低毒性和较高的可降解性等优点而被广泛研究。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。

[0007] 本发明提供了一种蛋白质，获自巴伦葛兹类芽孢杆菌，命名为PbNag39，是如下(a1)或(a2)：

[0008] (a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。

[0010] 为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0011] 表1标签的序列

[0012] 标签 残基 序列Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0013] 上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0014] 本发明还保护编码PbNag39的基因。

[0015] 将所述基因命名为PbNag39基因。

[0016] 所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

[0017] (b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

[0018] (b2)序列表中序列2所示的DNA分子；

[0019] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子；

[0020] (b4)来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子。

[0021] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

[0022] 本发明还保护含有PbNag39基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

[0023] 所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2自5’端第1-1038位替代SUMO-pET28a载体的EcoRI和NotI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。

[0024] 本发明还保护所述PbNag39的应用，为如下(c1)-(c5)中至少一种：

[0025] (c1)作为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；

[0026] (c2)制备N-乙酰氨基葡萄糖；

[0027] (c3)水解几丁二糖；

[0028] (c4)水解几丁寡糖；

[0029] (c5)以几丁质为原料制备N-乙酰氨基葡萄糖。

[0030] 本发明还保护一种重组菌，是将PbNag39基因导入宿主菌中得到的。

[0031] 所述PbNag39基因可通过含有PbNag39基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。

[0032] 所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2自5’端第1-1038位替代SUMO-pET28a载体的EcoRI和NotI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。

[0033] 所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21。

[0034] 本发明还保护一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。

[0035] 本发明还保护所述方法制备得到的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。

[0036] 本发明还保护制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，为方法A或方法B或方法C。

[0037] 所述方法A包括如下步骤：采用PbNag39水解几丁二糖，制备β-N-乙酰氨基葡萄糖。所述水解的液体环境为50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.5)。所述水解的温度为60℃。所述PbNag39在水解体系中的浓度为1U/mL。

[0038] 所述方法B包括如下步骤：采用PbNag39水解几丁寡糖，制备β-N-乙酰氨基葡萄糖。所述几丁寡糖的聚合度为3-5。所述水解的液体环境为50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.5)。
所述水解的温度为60℃。所述PbNag39在水解体系中的浓度为1U/mL。

[0039] 所述方法C包括如下步骤：采用PbNag39和几丁质酶协同水解几丁质制备β-N-乙酰氨基葡萄糖。所述水解的液体环境为20mM的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中(pH 5.5)。所述水解的温度为55℃。所述PbNag39在水解体系中的浓度为1U/mL。所述几丁质酶在水解体系中的浓度为5U/mL。所述几丁质需经过预处理，所述预处理方法为球磨和一种天然低共熔溶剂(氯化胆碱/乳酸，1:2)协同预处理。所述预处理方法具体可为：(1)取几丁质粉末(80-120目)，与球磨珠按照体积比2：1混合，球磨机转速380r/min，功率4kW，球磨4h后取出放置干燥箱中；(2)将步骤(1)得到的球磨几丁质与氯化胆碱/乳酸(1:2)天然低共熔溶剂混合，球磨几丁质在溶液中的质量百分含量为3％，110℃反应40min后取出，在冰上加入过量的蒸馏水，11510g离心6min，收集沉淀，加入过量的蒸馏水重悬，超声5min，以上步骤重复3次以除去氯化胆碱/乳酸，最后将预处理过后的几丁质粉末冻干备用。所述氯化胆碱/乳酸(1:2)天然低共熔溶剂的制备方法具体可为：分别以1:2的摩尔比例精确称取一定量的氯化胆碱和乳酸，混合后80℃水浴2h直至获得澄清透明液体，放置干燥箱中1-2周。

[0040] 本发明还保护一种组合物，包括PbNag39和几丁质酶；所述组合物的用途为制备N-乙酰氨基葡萄糖或催化几丁质转化为N-乙酰氨基葡萄糖的生化反应。

[0041] 所述PbNag39和几丁质酶的酶活比为1U:5U。

[0042] 以上任一所述几丁质酶具体可为PbChi70。

[0043] 本发明利用基因工程技术从巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904克隆一个糖苷水解酶18家族的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，并将其在大肠杆菌中异源表达。本发明提供的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶PbNag39的酶学性质优异，其最适pH 5.5，在pH 4.5-8.0保温30min，残余酶活力在80％以上；最适温度75℃，在65℃以下保持稳定。PbNag39对几丁二糖的比酶活为28.3U/mg，水解几丁寡糖的终产物均为N-乙酰氨基葡萄糖。将该β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质粉末，可高效制备得到N-乙酰氨基葡萄糖，其终浓度为25.5mg/mL，转化率为85.0％。本发明的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶具有比酶活高、热稳定性好和水解特性优异的特点，能在较广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用，在几丁质转化中具有重要的应用价值。

附图说明

[0044] 图1为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的纯化电泳图。

[0045] 图2为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最适pH测定曲线图。其中(■)柠檬酸缓冲液(pH 3.5-6.0)、(●)乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)、(▲)柠檬酸磷酸缓冲液(pH 4.0-7.0)、磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、 Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)、 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.0)。

[0046] 图3为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的pH稳定性测定曲线图。其中(■)柠檬酸缓冲液(pH 3.5-6.0)、(●)乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)、(▲)柠檬酸磷酸缓冲液(pH 4.0-7.0)、 磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、 Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)、 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.0)。

[0047] 图4为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最适温度测定曲线图。

[0048] 图5为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的温度稳定性测定曲线图。

[0049] 图6为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解几丁寡糖(聚合度2-5)产物薄层层析图。

[0050] 图7为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质产物TLC及HPLC分析图。其中(●)几丁质酶PbChi70单酶水解几丁质N-乙酰氨基葡萄糖产物HPLC分析，(▲)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶PbNag39单酶水解几丁质产物HPLC分析，(■)PbNag39与PbChi70协同水解几丁质产物HPLC分析。

具体实施方式

[0051] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0052] 下述实施例中β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活测定方法：取0.1mL适当稀释的待测酶液，加入到0.1mL 1％(质量体积比)的几丁二糖底物(制备方法参照文献：Yang S.Q.,Fu X.,Yan Q.J.,et al.Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a  thermophilic  marine  bacterium  Paenibacillus barengoltzii.Food Chemistry,2016,192:1041-1048)溶液中(缓冲液为50mM乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 5.5)，75℃水浴反应10min，采用高效液相色谱(HPLC)法测定所释放的β-N-乙酰氨基葡萄糖量，以β-N-乙酰氨基葡萄糖作为标准品(Sigma，货号：A8625)。HPLC测定条件为：
HPLC-RID检测系统(Agilent 1260 infinity II,Agilent Technologies,USA)BP-800Pb++层析柱(Benson Polymeric,Reno,NE,7.8×300mm,USA)，蒸馏水作为流动相，柱温80℃，流速为0.8mL/min。

[0053] β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的β-N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。

[0054] 比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

[0055] 1个β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活单位的定义：在pH 5.5、75℃条件下，每分钟分解1％(质量体积比)几丁二糖底物释放1μmol的β-N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量，酶活计算公式为：H＝Cx×n/(T×V)/2，其中，H代表酶活力(U/mL)，Cx代表生成β-N-乙酰氨基葡萄糖物质的量(μmol)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V代表加入稀释后的酶液体积(mL)。

[0056] 实施例1、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因的获得

[0057] 对巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)进行大量序列分析和功能验证，从巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904(参考文献：Zhang B.,Liu Y.,Yang H.Y.,et al.,Biochemical properties and application of a novelβ-1,3-1,4-glucanase from Paenibacillus barengoltzii.Food Chemistry,2017,234:68-75.公众可以从中国农业大学获得)中克隆得到一个β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的编码基因，全长1038bp，如序列表的序列2所示。序列表的序列2所示的DNA分子编码序列1所示的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(由345个氨基酸组成，无信号肽，命名为PbNag39)。

[0058] 实施例2、表达β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的工程菌构建

[0059] 1、采用序列表的序列2自5’端第1-1038位替代SUMO-pET28a载体(Novagen,Denmark)的EcoRI和NotI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体SUMO-pET28a-PbNag39(已经测序验证)。

[0060] 2、将步骤1得到的重组表达载体SUMO-pET28a-PbNag39导入大肠杆菌BL21(博迈德基因技术有限公司)，得到重组菌。

[0061] 3、将SUMO-pET28a载体导入大肠杆菌BL21(博迈德基因技术有限公司)，得到转空载体的重组菌。

[0062] 实施例3、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的制备及其酶学性质检测

[0063] 一、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的制备

[0064] 1、将实施例2制备的重组菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm达到0.6-0.8之间，向培养体系中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG在培养体系中的浓度为1mmol/L，30℃、200rpm诱导培养过夜，然后将培养体系11510g离心，收集菌体沉淀，采用20mM乙酸-乙酸钠(pH 5.5)缓冲液重悬后超声破碎(250W，20min)，超声结束后11510g离心10min，收集上清液即为粗酶液。

[0065] 2、取步骤1得到的粗酶液，使用琼脂糖Ni Sepharose亲和柱(GE Healthcare,货号：17-5268-01)纯化重组蛋白，具体步骤如下：

[0066] 用缓冲液A平衡Ni Sepharose亲和柱5-10个柱体积，将粗酶液以0.5mL/min流速上样，分别用缓冲液A和缓冲液B以1mL/min流速洗脱至OD280nm<0.05，以缓冲液C洗脱并收集目的蛋白质(重组菌粗酶液第一次Ni Sepharose亲和层析的纯化产物)，然后加入SUMO蛋白酶(新海基因检测有限公司，货号：C0801)并透析过夜，之后以相同的流速再次上样至缓冲液A平衡过的Ni Sepharose亲和柱，收集流穿液，透析浓缩得到纯化产物(重组蛋白PbNag39)。

[0067] 缓冲液A为含有NaCl(300mM)和咪唑(20mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；

[0068] 缓冲液B为含有NaCl(300mM)和咪唑(50mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；

[0069] 缓冲液C为含有NaCl(300mM)和咪唑(200mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。

[0070] 将上述步骤中的产物进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。图1中，泳道M为分子量标准，泳道1为重组菌粗酶液，泳道2为重组菌粗酶液第一次Ni Sepharose亲和层析的纯化产物，泳道3为重组蛋白PbNag39。

[0071] 图1的结果表明，重组蛋白PbNag39的大小为39kDa，与预期大小一致。

[0072] 3、采用对照菌(实施例2制备的转空载体的重组菌)替代重组菌，按照步骤1和2进行操作，经SDS-PAGE检测未发现目的蛋白。

[0073] 4、分别将步骤1得到的粗酶液、步骤2得到的重组菌粗酶液第一次Ni Sepharose亲和层析的纯化产物(Ni Sepharose 1)和重组蛋白PbNag39(Ni Sepharose 2)作为待测酶液，并以灭活的重组蛋白PbNag39作为对照，检测β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活力。

[0074] 结果如表2所示。

[0075] 表2β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的纯化表

[0076]

[0077] 纯化倍数为各纯化步骤比酶活与粗酶液比酶活的比值；

[0078] 回收率为各纯化步骤总酶活力与粗酶液总酶活力的比值。

[0079] 二、最适pH的测定

[0080] 将步骤一制备的重组蛋白PbNag39作为待测酶液进行酶活测定(将缓冲液替换为如下的缓冲液)，以最高酶活力为100％计算相对酶活。

[0081] 缓冲液I：柠檬酸缓冲液(pH 3.5-6.0)；

[0082] 缓冲液Ⅱ：乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)；

[0083] 缓冲液Ⅲ：柠檬酸磷酸缓冲液(pH 4.0-7.0)；

[0084] 缓冲液Ⅳ：磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)；

[0085] 缓冲液Ⅴ：Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)；

[0086] 缓冲液Ⅵ：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.0)。

[0087] 结果如图2所示。结果表明，重组蛋白PbNag39的最适pH为5.5。

[0088] 三、pH稳定性测定

[0089] 将步骤一制备的重组蛋白PbNag39进行预处理后测定酶活力。

[0090] 预处理方法为：将重组蛋白PbNag39用步骤二中的六种缓冲液进行稀释，置于50℃水浴锅中处理30min，然后将其迅速置于冰水中冷却30min。

[0091] 以未进行处理的重组蛋白PbNag39的酶活力作为100％，计算经过不同pH处理后PbNag39的相对酶活力。

[0092] 结果如图3所示。结果表明，PbNag39具有良好的pH稳定性，在pH4.5-8.0范围内保温30min后仍残留90％以上的酶活力。

[0093] 四、最适温度的测定

[0094] 将步骤一制备的重组蛋白PbNag39作为待测酶液进行酶活测定(将温度替换为40、45、50、55、60、65、70、75、80、85℃)，以最高酶活力为100％计算相对酶活。

[0095] 结果如图4所示。结果表明，PbNag39的最适温度为75℃。

[0096] 五、温度稳定性的测定

[0097] 将步骤一制备的重组蛋白PbNag39进行预处理后测定酶活力。

[0098] 预处理方法为：将重组蛋白PbNag39分别在不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min。

[0099] 以未进行处理的重组蛋白PbNag39的酶活力作为100％，计算经过不同pH处理后PbNag39的相对酶活力。

[0100] 结果如图5所示。结果表明，PbNag39在65℃以下具有良好的稳定性。

[0101] 六、水解几丁寡糖(聚合度2-5)

[0102] 待测底物：几丁二糖(制备方法参照文献：Yang S.Q.,Fu X.,Yan  Q.J.,et al.Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacterium Paenibacillus barengoltzii.Food Chemistry,2016,192:1041-1048)、几丁三糖(Megazyme,Ireland，货号：O-CHI3)、几丁四糖(Megazyme,Ireland，货号：O-CHI4)和几丁五糖(Megazyme,Ireland，货号：O-CHI5)。

[0103] 1、将待测底物溶于50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，底物在缓冲液中的质量百分含量为1％。

[0104] 2、向步骤1的体系中加入步骤一制备的重组蛋白PbNag39(在体系中的浓度为1U/mL)，置于60℃下水解1h，间隔取样，所有样品与沸水浴中灭活10min。将所有样品进行薄层层析色谱分析。

[0105] 薄层层析色谱分析参数设置：上样量1μL，展层剂为正丁醇：甲醇：氨水：水(5：4：2：1)，显色剂为甲醇：硫酸(95：5)。

[0106] 结果如图6所示。图6中，G1-G5分别为N-乙酰氨基葡萄糖、几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖。结果表明，PbNag39水解几丁寡糖主要产生N-乙酰氨基葡萄糖。

[0107] 实施例4、利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质制备β-N-乙酰氨基葡萄糖

[0108] 一、氯化胆碱/乳酸(1:2)天然低共熔溶剂的制备

[0109] 分别以1:2的摩尔比例精确称取一定量的氯化胆碱和乳酸，混合置于250mL圆底烧瓶，于旋转蒸发仪中80℃水浴2h直至获得澄清透明液体，放置干燥箱中1-2周备用。

[0110] 二、几丁质的预处理

[0111] 1、取几丁质粉末(80-120目)(莱州海力生物科技有限公司)，与球磨珠(秦皇岛太极环纳米制品有限公司)按照体积比2：1混合，球磨机转速380r/min，功率4kW，球磨4h后取出放置干燥箱中备用。

[0112] 2、将步骤1得到的球磨几丁质与步骤一制备的氯化胆碱/乳酸(1:2)天然低共熔溶剂混合，球磨几丁质在溶液中的质量百分含量为3％，110℃反应40min后取出，在冰上加入过量的蒸馏水，11510g离心6min，收集沉淀，加入过量的蒸馏水重悬，超声5min。以上步骤重复3次以除去氯化胆碱/乳酸。最后将预处理过后的几丁质粉末冻干备用。

[0113] 三、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质制备β-N-乙酰氨基葡萄糖

[0114] 1、将步骤二得到的几丁质粉末溶于20mM的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中(pH 5.5)，几丁质粉末在溶液中的质量百分含量为3％。

[0115] 2、向步骤1的溶液中分别加入不同的待测物，55℃下酶解36h，间隔取样，所有样品与沸水浴中灭活10min。

[0116] 3、将所有样品进行薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析。

[0117] 待测物A：重组蛋白PbNag39；重组蛋白PbNag39在步骤1的溶液中的浓度为1U/mL。

[0118] 待测物B：重组蛋白PbNag39和PbChi70(参考文献：Yang S.Q.,Fu X.,Yan Q.J.,et al.Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacterium Paenibacillus barengoltzii.Food Chemistry,2016,192:1041-1048.公众可以从中国农业大学获得)；重组蛋白PbNag39在步骤1的溶液中的浓度为1U/mL；PbChi70在步骤1的溶液中的浓度为5U/mL。

[0119] 待测物C：PbChi70；PbChi70在步骤1的溶液中的浓度为5U/mL。

[0120] 薄层层析色谱分析参数设置：上样量1μL，展层剂为正丁醇：甲醇：氨水：水(5：4：2：1)，显色剂为甲醇：硫酸(95：5)。

[0121] HPLC测定条件为：HPLC-RID检测系统(Agilent 1260 infinity II,Agilent Technologies,USA)BP-800Pb++层析柱(Benson Polymeric,Reno,NE,7.8×300mm,USA)，蒸馏水作为流动相，柱温80℃，流速为0.8mL/min。

[0122] 几丁质转化率(％)＝N-乙酰氨基葡萄糖的质量(g)/几丁质的质量(g)×100％[0123] 结果如图7所示。图7中，G1-G5分别为N-乙酰氨基葡萄糖、几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖。结果显示，PbNag39无法水解预处理后的几丁质，PbChi70水解预处理后的几丁质主要产生几丁二糖，但是当PbNag39协同PbChi70水解预处理后的几丁质时，可以有效的将几丁质转化为N-乙酰氨基葡萄糖，其N-乙酰氨基葡萄糖终浓度为25.5mg/mL，转化率为85.0％。