用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物

摘要

本发明公开了用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物。本发明提供了下述P1‑P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；P4、D5；P1‑P4中，所述D5是编码氨基酸序列是序列2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是序列4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是序列6的蛋白质的基因。本发明不仅为低温和/或常温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因。本发明将进一步促进茄子不同果实发育时期低温抗性基因的研究。

权利要求

1.下述P1‑P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；

P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；

P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；

P4、D5；

P1‑ P4中，所述D5是编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质的基因；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述D5为编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；所述D4为编码序列是SEQ ID No.3的DNA分子；所述D1为编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子。

3.用于茄子基因表达分析的试剂，所述试剂为下述R1‑R4中的任一种：R1、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对、名称为W4的检测权利要求1或2中所述的D4表达水平的引物对和名称为W1的检测权利要求1或2中所述的D1表达水平的引物对组成；

R2、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对和名称为W1的检测权利要求1或2中所述的D1表达水平的引物对组成；

R3、由名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对和名称为W4的检测权利要求1或2中所述的D4表达水平的引物对组成；

R4、名称为W5的检测权利要求1或2中所述的D5表达水平的引物对；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析；

所述W5为由D5‑F和D5‑R组成的D5特异引物对，所述D5‑F是SEQ ID No.7所示的单链DNA，所述D5‑R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；

所述W4为由D4‑F和D4‑R组成的D4特异引物对，所述D4‑F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，所述D4‑R是SEQ ID No.10所示的单链DNA；

所述W1为由D1‑F和D1‑R组成的D1特异引物对，所述D1‑F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，所述D1‑R是SEQ ID No.12所示的单链DNA。

4.含有权利要求3所述的试剂的用于茄子基因表达分析的试剂盒；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

5.权利要求3所述的试剂在茄子基因表达分析中的应用；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

6.权利要求4所述的试剂盒在茄子基因表达分析中的应用；

所述茄子基因表达分析为低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

说明书

用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学领域中用于茄子基因表达分析的内参基因及其相关引物。

背景技术

[0002] 茄子(Solanum melongena L.)是世界上最受欢迎的蔬菜作物之一。与大多数喜温蔬菜一样，茄子在低温条件下不容易坐果，从而严重影响了茄子的产量和品质(Nothmann 
J,Koller D.Effects of growth regulators on fruit and seed development in 
eggplant(Solanum melongena L.).J Hort Sci.1975；50:23‑7)。为了避免低温造成的重
大损失，生产中常常采用栽培耐低温茄子品种的方法。然而，目前茄子中与低温抗性相关的
主效基因尚未被挖掘，茄子低温抗性的分子机制也有待进一步的研究。

[0003] 在进行功能基因筛选及相关分子机理研究时，基因转录表达量检测是一种重要手段。目前，诸如DNA微阵列技术，Northern印记分析法，核糖核酸酶保护法和实时荧光定量
PCR等都被广泛地应用于基因表达水平的研究中。在这些技术中，荧光定量PCR技术凭借高
灵敏度，高准确性，高特异性，高通量和低成本等优势成为当前最常用的基因表达水平检测
工具 (Wo ng  ML ,Me dra no  J F .R ea l‑t ime  P CR  fo r  m RN A 
quantitation.BioTechniques.2005；39:75‑85)。然而，在进行荧光定量PCR试验时，为了避
免定量结果出现偏差，选择合适的内参基因用于标准化目的基因的表达定量是十分必要
的。内参基因，也被称作看家基因，一般认为内参基因能够在不同发育阶段，不同组织类型
和不同试验条件中均稳定表达。

[0004] 由于内参基因能够在不同试验条件中稳定表达，因此在确保荧光定量PCR结果的准确性方面具有重要作用。已报道的常用作内参基因的有actin，glyceraldehyde 3‑
phosphate dehydrogenase(GAPDH)，TUB，ubiquitin(UBQ)和18S ribosomal RNA(18S)
(Bustin SA.Quantification of mRNA using real‑time reverse transcription PCR
(RT‑PCR):trends and problems.J Mol Endocrinol.2002；29:23–39)。然而，许多研究均
表明，这些内参基因在不同的植物材料，不同的植物组织和试验处理中有明显的表达水平
的差异(Li J,Han J,Hu Y,Yang J.Selection of reference genes for quantitative 
real‑time PCR during flower development in tree peony(Paeonia suffruticosa 
Andr.).Front Plant Sci.2016；7:516；Qi S,Yang L,Wen X,Hong Y,Song X,Zhang M,et 
al.Reference gene selection for RT‑qPCR analysis of flower development in 
chrysanthemum morifolium and chrysanthemum lavandulifolium.Front Plant 
Sci.2016；7:287；Sinha P,Saxena RK,Singh VK,Krishnamurthy L,Varshney 
RK.Selection and validation of housekeeping genes as reference for gene 
expression studies in Pigeonpea(Cajanus cajan)under heat and salt stress 
conditions.Front Plant Sci.2015；6:1071；Li W,Qian YQ,Han L,Liu JX,Sun 
ZY.Identification of suitable reference genes in buffalo grass for accurate 
transcript normalization under various abiotic stress conditions.Gene.2014；
547:55–62)。因此，在进行基因表达研究前，选择和评价不同试验条件中合适可靠的内参基
因是十分重要的。目前有关茄子内参基因筛选的报道包括在高温胁迫下茄子中表达最稳定
的两个内参基因SmEf1α和SmTRX(庞强强,李植良,罗少波,陈日远,金庆敏,黎振兴,李德明,
孙保娟,孙光闻.高温胁迫下茄子qRT‑PCR内参基因筛选及稳定性分析[J].园艺学报,2017,
44(03):475‑486)；此外，Kanakachari等分析茄子不同果实发育时期内参基因稳定性的结
果显示，geNorm认为SAND和TBP是最稳定的内参基因组合，而NormFinder则认为Expressed
是最佳的内参基因(Kanakachari M,Solanke AU,Prabhakaran N,Ahmad I,Dhandapani G,
Jayabalan N,et al.Evaluation of suitable reference genes for normalization of 
qPCR gene expression studies in brinjal(Solanum melongena L.)During fruit 
developmental stages.Applied Biochemistry&Biotechnology.2016；178:433‑50)。迄今
为止，还没有适用于茄子低温条件下不同果实发育时期内参基因的相关报道。因此，筛选及
评价低温条件下茄子不同果实发育时期的内参基因将有助于提高茄子低温抗性基因选择
的准确性，并为茄子耐低温分子机制的研究打下基础。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供低温和/或常温条件下，茄子基因表达分析中的稳定性高的内参基因。

[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供了下述P1‑P4中任一种作为茄子基因表达分析中的内参基因的应用：

[0007] P1、由D1、D4和D5这三个基因组成的成套基因；

[0008] P2、由D1和D5这两个基因组成的成套基因；

[0009] P3、由D4和D5这两个基因组成的成套基因；

[0010] P4、D5；

[0011] P1‑P4中，所述D5是编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的基因，所述D4是编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的基因；所述D1是编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的
蛋白质的基因。

[0012] 上述应用中，所述D5可为编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；所述D4可为编码序列是SEQ ID No.3的DNA分子；所述D1可为编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子。

[0013] 上述应用中，所述茄子基因表达分析可为分析茄子基因转录水平。

[0014] 为了解决以上技术问题，本发明提供了用于茄子基因表达分析的试剂。

[0015] 本发明所提供的用于茄子基因表达分析的试剂为下述R1‑R4中的任一种：

[0016] R1、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质、名称为W4的检测权利要求1或2所述的D4表达水平的物质和名称为W1的检测权利要求1或2所述的D1表达水
平的物质组成；

[0017] R2、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质和名称为W1的检测权利要求1或2所述的D1表达水平的物质组成；

[0018] R3、由名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质和名称为W4的检测权利要求1或2所述的D4表达水平的物质组成；

[0019] R4、名称为W5的检测权利要求1或2所述的D5表达水平的物质。

[0020] 上述试剂中，所述W5可为PCR扩增所述D5全长或其片段的引物，所述W4可为PCR扩增所述D4全长或其片段的引物，所述W1可为PCR扩增所述D1全长或其片段的引物。

[0021] 上述试剂中，所述PCR可为荧光定量PCR和普通定量PCR。

[0022] 上述试剂中，所述W5可为由D5‑F和D5‑R组成的D5特异引物对，所述D5‑F是SEQ ID No.7所示的单链DNA，所述D5‑R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；

[0023] 所述W4可为由D4‑F和D4‑R组成的D4特异引物对，所述D4‑F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，所述D4‑R是SEQ ID No.10所示的单链DNA；

[0024] 所述W1可为由D1‑F和D1‑R组成的D1特异引物对，所述D1‑F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，所述D1‑R是SEQ ID No.12所示的单链DNA。

[0025] 含有上述试剂的用于茄子基因表达分析的试剂盒也属于本发明的保护范围。

[0026] 上述用于茄子基因表达分析的试剂盒除含有所述试剂外，还可含有进行PCR(如荧光定量PCR)所需的其它试剂。

[0027] 上述试剂或试剂盒在茄子基因表达分析中的应用也属于本发明的保护范围。

[0028] 上文中，所述茄子基因表达分析可为茄子果实中基因表达分析，如低温条件下和/或常温条件下茄子果实中基因表达分析。

[0029] 上文中，所述低温条件可为日最低温度为7‑17℃。所述常温条件可为日最低气温为17‑28℃。

[0030] 上述试剂或试剂盒中，各种引物对均可独立包装，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。

[0031] 本发明基于基因表达水平的FPKM值从茄子果实(子房)的转录组测序数据(数据未公开)筛选出了18个候选内参基因，并评价了它们在低温和常温条件下茄子果实发育过程
中的表达稳定性。选择了三种常用的内参筛选工具(geNorm、BestKeeper和RefFinder)进行
相关分析，结果表明，D5(Sme2.5 08608.1 g00002.1)在低温和常温条件下不同果实发育时
期的生物学样本中表达稳定性最佳，其次是D1(Sme2.5_01136.1_g00003.1)和D4(Sme2.5_
00276.1_g00016.1)。并将筛选出的内参基因D5、D4和D1与先前报道的在茄子果实发育过程
中稳定性最好的3个内参基因(SAND、TBP和Expressed)以及在高温条件下稳定性好的2个内
参基因(SmEf1α和SmTRX)进行比较分析，结果表明无论在低温样本、常温样本还是在所有样
本中D1、D4和D5的稳定性优于SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因
(表5)。由此可见，本发明筛选得到的三个内参基因是稳定可靠的。说明D1，D4和D5这三个基
因均可作为低温条件和/或常温条件下的果实中基因表达分析的内参基因。D1，D4和D5这三
个基因均可单独作为内参基因使用，为了提高荧光定量PCR的准确性，可将D1，D4和D5这三
个基因组合起来作为成套内参基因使用。本发明不仅为低温条件下茄子不同果实发育时期
的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因，也为常温条件下茄子不同果实发育
时期的基因表达水平的标准化定量提供了可靠的内参基因。本发明将进一步促进茄子不同
果实发育时期低温抗性基因的研究。

附图说明

[0032] 图1为18个候选内参基因引物PCR的产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道M为marker 50bp；泳道D1‑D18为表1的基因编号为D1‑D18的候选内参基因对应的PCR扩增产物，
50bp～200bp为maker的部分条带大小。

[0033] 图2为18个候选内参基因的熔解曲线。横坐标为温度，纵坐标为荧光值，D1‑D18为表1的基因编号为D1‑D18的18个候选内参基因。

[0034] 图3为18个候选内参基因和五个已报道的内参基因在所有生物学样本中的Cq均值。图中，横坐标为候选内参基因，D1‑D18为表1的基因编号为D1‑D18的18个候选内参基因，
A1为SAND，A2为Expressed，A3为SmEf1α，A4为SmTRX，A5为TBP；纵坐标为cq值。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 实施例1、低温条件下和常温条件下茄子不同果实发育时期的基因表达分析中内参基因的确立

[0038] 1试验材料

[0039] 茄子单性结实品系D‑10和茄子非单性结实品系03‑2(李艳玮，刘富中，陈钰辉，张映，张伟伟，连勇.温度对茄子单性结实子房(果实)发育过程中内源激素含量的影响.中国
蔬菜2013(22)：32‑38)是中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的品系，公众可从中国农业
科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不
可作为其它用途使用。

[0040] D‑10为茄子耐低温自交系，在低温条件下果实能够正常膨大形成无籽果实(在开花和坐果期间日最低温度为7℃‑17℃，日平均最低温度12.6℃时表现单性结实，果实内无
种子，果实正常膨大)，在常温条件下则形成有籽果实。03‑2为不耐低温自交系，在低温条件
(最低温度为7℃‑17℃，日平均最低温度12.6℃)下形成僵果或落花落果，而在常温条件下
则能形成正常的有籽果实。两份材料从2月‑6月份种于中国农业科学院蔬菜花卉研究所位
于北京的试验田。

[0041] 2月中旬将两份材料的种子播于温室中，温度维持18‑30℃，相对湿度为50％，在自然光照条件下生长。4月中下旬(门茄已现花蕾，但还没开花)定植于中国农业科学院蔬菜花
卉研究所位于北京的试验露地。从4月中下旬到5月初，日最低温度在7‑17℃，该温度条件
(简称T1)下D‑10果实正常膨大形成无籽果实，03‑2形成小僵果或落花落果；6月到7月初日
最低气温为17‑28℃，该温度条件(简称T2)下两份材料果实均正常发育形成有籽果实。在T1
和T2这两个温度条件下对两份材料进行取样工作，取样部位为开花当天，开花后2d，4d，
10d，15d和20d的子房或果实。每个时期取三个生物学重复的样品，将取回的样品用锡箔纸
包好后放入液氮速冻，置于‑80℃冰箱中保存备用。将在T1温度条件取的样本称为低温样
本、将在T2温度条件取的样本称为常温样本，将低温样本和常温样本组成的群体称为所有
样本。

[0042] 2试验方法及结果

[0043] 2.1总RNA提取和cDNA第一链合成

[0044] 使用Quick RNA Isolation Kit试剂盒(华越洋，北京，中国)提取所有样本的总RNA，详细提取方法参照试剂盒中的说明书。用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整
性，确保RNA无降解。并用BioSpec‑nano紫外可见微量分光光度计检测RNA的浓度，RNA样品
OD260/OD280的值应在1.9‑2.2之间，OD260/OD230的值应不小于2.0，只有符合上述条件的
RNA样品方可用于合成cDNA。

[0045] 所提取的RNA样品在1％琼脂糖凝胶电泳中的检测结果显示，样品为清晰的两条带，且28S和18S的比例接近2:1,无拖带现象，表明所提取的RNA可用于质量合格，可用于后
续cDNA第一链的合成。

[0046] cDNA第一链的合成用5×All‑In‑One Master Mix试剂盒(应用生物材料公司abm,温哥华,加拿大)，详细合成方法同样参照试剂盒附带的说明书。所有的RNA和cDNA样品均设
置三个生物学重复。将用于反转录的RNA统一定量，反转录成cDNA后将cDNA原液稀释10倍后
置于‑20℃冰箱中保存。

[0047] 2.2候选内参基因的来源及引物设计

[0048] 2016年本申请发明人所在的课题组获得了60份茄子生物学样本的转录组测序数据，并从8万8千多个基因中选出了18个在所有生物学样本中FPKM(expected number of 
fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs 
sequenced)值大小合适且变异系数小的基因作为候选的内参基因。用这18个候选内参基因
的CDS序列设计用于荧光定量PCR的引物。引物设计采用DNASTAR软件包中的PrimerSelect
工具，具体参数设置如下：Tm值大于55℃，引物长度18‑25bp，产物长度100‑200bp。候选内参
基因及引物的详细信息见表1。

[0049] 表1候选内参基因及引物信息

[0050]

[0051]

[0052] 注：基因序列号为Eggplant Genome DataBase中的ID。

[0053] 2.3实时荧光定量PCR扩增

[0054] 实验所需的引物由北京华大基因公司合成。

[0055] 荧光定量PCR试验在罗氏的 480荧光定量分析仪上进行，使用的是罗氏公司的 480 SYBR Green I Master kit荧光定量PCR试剂盒。具体的反应条
件如下：

[0056] (1)总反应体积为10μl，包括2μl cDNA模板(50ng/μl)，引物分别为0.25μl(0.5μM)，5μl SYBR Green I Master Mix和2.5μl的无核酸水；

[0057] (2)反应程序为：95℃预变性10min，40个循环的扩增(95℃10s，56℃20s，单捕获模式下72℃30s)，95℃熔解5s，65℃1min，97℃持续捕获模式，最后40℃冷却10s。

[0058] 所有的样本的反应均包括三个生物学重复和三个机械重复。用标准曲线和熔解曲线分析候选内参引物的扩增效率和特异性。

[0059] 2.4、标准曲线的绘制

[0060] (1)将反转录得到的cDNA溶液稀释10倍；

[0061] (2)以该稀释液为起始液分别按5倍或10倍梯度稀释法进行稀释(1/5,1/25,1/125,1/625或者1/10,1/100,1/1000,1/10000)；

[0062] (3)用上述体系和反应程序执行三个平行的荧光定量PCR反应；

[0063] (4)计算三个平行的Cq均值，绘制不同模板浓度下标准曲线，获得曲线方程，扩增效率和相关系数。

[0064] 2.5候选内参基因引物的可靠性分析

[0065] 用3％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测18对候选内参基因引物的特异性，结果显示目标条带均为单一条带，且与预期的产物大小相符(图1)。而且荧光定量熔解曲线分析也表明
它们的PCR产物为单一的峰(图2)，说明无非特异性的引物二聚体形成。综上表明，18对候选
内参的引物序列是特异且有效的。

[0066] 标准曲线分析结果显示这些引物的扩增效率从81.05％(D3)‑99.90％(D11)不等，符合荧光定量PCR对引物扩增效率的要求。18个基因的引物标准曲线的相关系数从0.9607
(D2)‑0.9998(D6，D13)不等(表2)，表明模板梯度稀释浓度在合理的范围内，标准曲线的线
性相关系较好。因此这些引物是可靠的。

[0067] 表2茄子耐低温相关基因表达定量的内参基因引物参数

[0068] 基因编号 标准曲线方程 R2 E(％)D1 y＝‑2.4577x+18.457 0.9994 96.20
D2 y＝‑3.1046x+20.786 0.9607 94.75
D3 y＝‑4.7732x+23.806 0.9980 81.05
D4 y＝‑2.4817x+17.931 0.9977 96.40
D5 y＝‑2.488x+17.459 0.9979 98.50
D6 y＝‑2.7623x+20.467 0.9998 89.35
D7 y＝‑3.4699x+19.406 0.9994 97.55
D8 y＝‑3.4799x+16.931 0.9931 92.10
D9 y＝‑2.9437x+23.142 0.9995 86.70
D10 y＝‑3.2972x+15.593 0.9951 99.55
D11 y＝‑3.3664x+14.257 0.9981 99.90
D12 y＝‑3.4274x+19.049 0.9997 98.00
D13 y＝‑3.4174x+18.919 0.9998 98.30
D14 y＝‑2.6307x+20.680 0.9964 95.25
D15 y＝‑2.501x+18.042 0.9982 96.90
D16 y＝‑2.602x+20.889 0.9985 95.50
D17 y＝‑2.4903x+18.655 0.9900 96.60
D18 y＝‑4.6168x+21.538 0.9780 89.40

[0069] 2.6候选内参基因的表达稳定性分析

[0070] 为了评价18个候选内参基因在不同果实发育时期和不同温度条件下生物学样本中的表达稳定性，用两个内参基因筛选软件(geNorm和BestKeeper)以及一个线上综合性评
价工具(RefFinder,http://150.216.56.64/referencegene.php？type＝reference)对18
个候选内参基因进行分析和稳定性排序。这些工具的原理和着重点各不相同，因此相同基
因的表达稳定性结果可能会有差异(Yim AK,Wong JW,Ku YS,Qin H,Chan TF,Lam 
HM.Using RNA‑Seq data to evaluate reference genes suitable for gene 
expression studies in soybean.PLOS ONE.2015；10:e0136343:e136343)。最终综合分析
判断不同条件下的最适内参基因。

[0071] 2.6.1候选基因的转录表达丰度

[0072] 在荧光定量表达分析中，基因的转录表达量的高低可以通过基因的Cq值来反应。Cq值越大，表达水平越低。所有生物学样本的平均Cq值从14.33‑22.77不等，而且D5和D18在
这些样品中分别有最高和最低的表达水平(图3)。

[0073] 2.6.2 geNorm分析结果

[0074] 在进行geNorm分析时，候选内参基因的稳定性主要由稳定性值(M)决定。默认为M值小于1.5的基因是稳定表达的基因，M值越小基因表达的稳定性越高(Vandesompele J,De 
Preter K,Pattyn F,Poppe B,Van Roy N,De Paepe A,et al.Accurate normalization 
of real‑time quantitative RT‑PCR data by geometric averaging of multiple 
internal control genes.Genome Biol.2002；3:RESEARCH0034.Pubmed:12184808)。表3是
自动分析模式下geNorm计算得到的平均稳定值。

[0075] 由表3可知，低温，常温和所有样本条件下候选内参基因的稳定性均值分别介于0.39‑1.10,0.41‑0.96和0.46‑1.04之间，稳定性均值均小于1.5。在所有样本和低温样本
中，D1和D2是最稳定的两个内参基因，相对应的M值分别为0.46和0.39。而在常温条件下D4
和D5是最稳定的内参基因，相应的M为0.41。另外，D18在所有样本数据组中均是最不稳定的
内参基因，相应的M值分别为1.10，0.96和1.04。根据geNorm的分析结果，综合考虑三种样品
情况D5、D4、D1和D2是表现最稳定的内参基因。

[0076] 表3候选内参基因稳定性均值M及稳定性排序

[0077]

[0078] geNorm可以根据候选基因标准化因子的配对变异值(Vn/Vn+1)来确定所需最适内参基因的数目。默认值为Vn/n+1＝0.15。若Vn/n+1<0.15说明以n个基因作为内参基因组合
已经足够稳定，不需要引入第n+1条基因。如表4所示，低温样本与所有样本的成对变异值
V2/3均小于0.15，说明在这两个样本集中只需要两个内参基因；而常温样本的成对变异值
V2/3大于0.15且V3/4小于0.15，说明在该样本集中三个内参基因才能准确用于基因的表达研
究。

[0079] 表4候选内参基因的成对变异值

[0080]

[0081]

[0082] 2.6.3 BestKeeper分析结果

[0083] BestKeeper可用于分析候选内参基因的表达稳定性，该软件通过计算标准差(SD)和变异系数(CV)来评价候选内参基因在特定生物学样本中的表达稳定性，标准差(SD)和变
异系数(CV)越小基因表达越稳定，候选基因的SD值大于1将被过滤，本试验中18个候选内参
基因在所有生物学样本的平均Cq值从14.33‑22.77，所有Cq值处于同一个数量级，因此根据
SD值判断候选内参基因的稳定性，标准差(SD)越小基因表达越稳定。由BestKeeper计算得
到的SD如表5所示。根据SD值按从小到大排序，在低温条件下排在前三位的有D5、D1和D4；在
常温条件下排在前三位的有D10、D5和D8；在所有样品中前三位的有D5、D1和D10。由此可见，
在低温条件和所有样品中D5是最稳定的内参基因，在常温条件下D10是最稳定的内参基因，
D5稳定性也很好，排在第二位。BestKeeper分析表明，综合三种样品情况D5是稳定性最好的
基因。

[0084] 2.6.4 RefFinder分析结果

[0085] geNorm和BestKeeper对这18个候选内参基因的稳定性排序结果存在差异(表3，表5)。为了对这些基因的稳定性进行综合评价，用RefFinder计算得到的M2值对这些基因进行
排序。结果表明，在低温、常温和所有样本三个集中D5都表达最稳定，D4和D1是排名第二或
第三的内参基因，D5、D1和D4这3个基因在各样品集稳定排名中稳居前3位，是18个候选内参
基因中在低温、常温和所有样本中都表现最稳定的3个基因。且根据geNorm结果其M值小于
1.5，根据BestKeeper结果其SD小于1，这3个基因都是较好的可用的内参基因。

[0086] 虽然也有研究报道使用一个内参基因作为参照分析的基因的转录表达水平(Deng X,Zhou S,Hu W,Feng J,Zhang F,Chen L,Huang C,Luo Q,He Y,Yang G,et al(2013)；
Ectopic expression of wheat TaCIPK14,encoding a calcineurin B‑like protein‑
interacting protein kinase,confers  salinity and cold tolerance in 
tobacco.Physiol Plant,149(3):367–377；Yang T,Peng H,Whitaker BD,Jurick WM
(2013).Differential expression of calcium/calmodulin‑regulated SlSRs in 
response to abiotic and biotic stresses in tomato fruit.Physiol Plant,148(3):
1320445–455；张婷，武喆，张开京，徐建，娄群峰，李季，陈劲枫.2016；黄瓜单性结实候选基
因预测与表达分析.核农学报，30(2):224‑230)，但是使用多个内参基因结果的更准确和可
靠(Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，Poppe B，Van Roy N，De Paepe A，Speleman 
F.2002；Accurate normalization of real‑time quantitative RT‑PCR data by 
geometric averaging of multiple internal control genes.Genome Biology，3(7):
research0034.0031‑research0034.0011；Artico S,Nardeli SM,Brilhante O,Grossi‑
de‑Sa MF,Alves‑Ferreira M(2010).Identification and evaluation of new 
reference genes in Gossypium hirsutum for accurate normalization of real‑time 
quantitative RT‑PCR data.BMC Plant Biol,10:49；王瑛，陈亚娟，丁莉萍，魏建华，王宏
芝.2016.毛白杨不同组织器官稳定表达看家基因的筛选.植物生理学报，(08):1312‑
1320)。本试验根据geNorm软件计算的候选基因的配对变异值(Vn/Vn+1)(表3)可知，在低温
和全部样品条件下(V2/V3＜0.15)因此使用2个内参基因就满足标准定量的要求，因此从D5、
D4和D1中任意选择2个基因进行组合就可以作为内参基因进行表达定量，可组成的组合有
D5+D4、D5+D1和D4+D1。在常温条件下(V3/V4＜0.15)，因此使用3个内参基因可满足标准定量
的要求，在常温条件下D5+D4+D1是进行表达分析的最好的内参基因组合。

[0087] 表5 BestKeeper和RefFinder对18个候选内参基因的稳定性排序

[0088]

[0089] 注：括号外面为稳定性从高到低的基因排序，括号里面的数值分别为括号外基因对应的SD值(BestKeeper)和综合排名值(RefFinder)。

[0090] 2.7内参基因稳定性比较

[0091] 为了进一步确认本实验筛选出的内参基因D5、D1和D4的稳定性，选取了五个已报道的内参基因—SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX与本发明的内参基因D5、D1和D4按照
步骤2.1、2.3‑2.6的方法进行试验。其中，D5、D1和D4的引物如表7所示，D5的引物由D5‑F和
D5‑R组成，D5‑F是SEQ ID No.7所示的单链DNA，D5‑R是SEQ ID No.8所示的单链DNA；D4的引
物由D4‑F和D4‑R组成，D4‑F是SEQ ID No.9所示的单链DNA，D4‑R是SEQ ID No.10所示的单
链DNA；D1的引物由D1‑F和D1‑R组成，D1‑F是SEQ ID No.11所示的单链DNA，D1‑R是SEQ ID 
No.12所示的单链DNA。

[0092] 根据先前的报道，SAND、TBP和Expressed在茄子不同果实发育过程中表达最稳定(Kanakachari M,Solanke AU,Prabhakaran N,Ahmad I,Dhandapani G,Jayabalan N,et 
al.Evaluation of suitable reference genes for normalization of qPCR gene 
expression studies in brinjal(Solanum melongena L.)During fruit developmental 
stages.Applied Biochemistry&Biotechnology.2016；178:433‑50)。这里直接用文章提供
的这三个基因的引物序列。

[0093] SmEf1α和SmTRX是高温胁迫下茄子中表达最稳定的两个内参基因(庞强强,李植良,罗少波,陈日远,金庆敏,黎振兴,李德明,孙保娟,孙光闻.高温胁迫下茄子qRT‑PCR内参
基因筛选及稳定性分析[J].园艺学报,2017,44(03):475‑486)；这里直接用文章提供的这
两个基因的引物序列。

[0094] 在本试验中SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因在步骤2.6.1的所有生物学样本中的表达情况如图3所示，其平均数cq值为16.78‑22.58，明显高于
D1，D4和D5这三个基因的平均cq值，表明SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照
内参基因表达丰度低于D1，D4和D5这三个内参基因。

[0095] 同样用geNorm、Bestkeeper和Refinder这三种分析方法比较SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因与本发明筛选的三个内参基因D5、D1和D4
稳定性。结果表明无论在低温样本、常温样本还是在所有样本中D1、D4和D5的稳定性优于
SAND、TBP、Expressed、SmEf1α和SmTRX这五个对照内参基因(表6)。由此可见，本发明筛选得
到的三个内参基因是稳定可靠的。说明D1，D4和D5这三个基因均可作为低温条件和/或常温
条件下的果实中基因表达分析的内参基因。D1，D4和D5这三个基因均可单独作为内参基因
使用，为了提高荧光定量PCR的准确性，可将D1，D4和D5这三个基因组合起来作为成套内参
基因使用。

[0096] 表6、选出的8个内参基因的稳定性比较

[0097]

[0098]

[0099] 表7本发明的内参基因的引物序列

[0100]

[0101] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申
请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。