氮掺杂纳米碳球的类超氧化物歧化酶活性及其用途

摘要

本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类超氧化物歧化酶活性及其用途。具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类超氧化物歧化酶活性及其在缺血性脑卒中的用途。

权利要求

1.Fe-N-carbon纳米颗粒在制备基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病的药物中的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒由下述方法制得：在250ml圆底烧瓶中加入90ml乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀，再加入2.0ml氨水，搅拌约10min后，加入4.0ml TEOS搅拌

8h，停止反应，高速离心得到白色固体，去离子水、乙醇各洗涤3次，置于60℃烘箱干燥12h，得到SiO2固体，研碎备用；将所得100mg SiO2小球分散在Tris-HCl，pH=8.5的缓冲溶液中，加入100mg的多巴胺，反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到PDA@SiO2，备用；将上述所得的PDA@SiO2分散在20ml的乙醇溶液中，加入100mg FeCl3•6H2O, 反应24h后，离心、洗涤、

3+ 3+

收集沉淀，烘干后得到Fe - PDA@SiO2，备用；将上述所得Fe - PDA@SiO2小球800℃下煅烧

2h后，碱洗8h后，离心洗涤，烘干，即得Fe-N-carbon 纳米颗粒；

其中所述基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病是缺血性脑卒中。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述Fe-N-carbon纳米颗粒的粒径范围为70-140nm。

3.如权利要求1或2所述的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，所述靶向性蛋白为抗体。

4.如权利要求1或2所述的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，所述靶向性蛋白为配体。

5.如权利要求1或2所述的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，所述靶向性蛋白为多肽。

6.如权利要求1或2所述的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，所述靶向性蛋白为核酸适配体。

7.如权利要求1-2任一项所述的用途，所述Fe-N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰，其中所述靶向性蛋白是全人H铁蛋白。

说明书

氮掺杂纳米碳球的类超氧化物歧化酶活性及其用途

技术领域

[0001] 本申请属于纳米生物医学和纳米技术的交叉领域。特别地，本申请涉及纳米材料的医学应用。更具体而言，本申请涉及氮掺杂纳米碳球的类超氧化物歧化酶活性及其在缺
血性脑卒中的用途。

背景技术

[0002] 氮掺杂纳米碳材料(N-doped carbon nanomaterials)的研究已经成为国际碳材料领域的热点之一。氮原子比碳原子多一个价电子，氮掺杂进入碳的六元环结构后可形成
吡啶、吡咯、石墨氮、吡啶氧化物等含氮官能团，不仅可以提高纳米碳材料的表面化学活性，
还可对其电子结构进行调节，从而改变纳米碳球的催化活性、导电性和吸附性能等[1,2]。
传统的氮掺杂纳米材料广泛用于氧还原反应(oxygen reduction reaction，ORR)[3]，超级
电容器 [4]以及电化学和生物传感器[5]等领域。但是迄今为止，未有将其应用于生物医学
的报道。

[0003] 在2007年，本发明人在国际上首次发现无机Fe3O4纳米颗粒等本身就具有内在的生物酶活性[6]，并将这种具有内在酶活性的纳米材料称为纳米酶[7]。发现纳米酶的报道引
领了纳米酶颗粒研究的热潮，有近百种纳米材料的不同纳米酶颗粒活性被陆续报道[8,9]，
并被广泛应用于纳米生物医学技术领域，比如生物传感、生物成像、组织工程、肿瘤的诊断
和治疗等等 [10-12]。

[0004] 截至目前，未有氮掺杂纳米碳材料或氮掺杂纳米碳球是否具有类超氧化物歧化酶活性的报道。

发明内容

[0005] 本发明的第一方面涉及氮掺杂纳米碳球用作超氧化物歧化酶的用途。

[0006] 在一些实施方案中，所述用途是体外用途或体内用途。在一些实施方案中，所述用途是治疗和/或诊断用途。在一些实施方案中，所述用途是非治疗和/或非诊断用途。

[0007] 本发明的第二方面涉及氮掺杂纳米碳球在制备用于预防和/或治疗受试者中可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病的药物中的用途。

[0008] 本发明的第三方面涉及利用氮掺杂纳米碳球预防和/或治疗可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病的方法，其包括向受试者施用所述氮掺杂的纳米碳球。

[0009] 本发明的第四方面涉及氮掺杂纳米碳球，其用于预防和/或治疗受试者中可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病。

[0010] 在一些实施方案中，所述可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病选自缺血性脑卒中、缺血性心梗、阿尔兹海默症、帕金森症、白内障、痛风、结肠炎、类风湿性关
节炎或硬皮病。不受限于任何理论，任何因自由基产生的疾病都可以利用本发明的氮掺杂
纳米碳球的超氧化物歧化酶活性进行预防和/或治疗。

[0011] 在一些实施方案中，所述可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病是缺血性脑卒中。

[0012] 在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球的粒径范围为20-200nm之间，优选地，粒径范围为50-150nm，更优选地，粒径范围为70-140nm。

[0013] 在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球进一步掺入金属元素，优选地，所述金属元素选自Fe、Co、Ni、Cu、Ce和Mn的一种或多种，更优选地，所述金属元素选自是Fe、Ni、Ce、Mn
和Cu的一种或多种。

[0014] 在一些实施方案中，所述金属元素是Fe。

[0015] 在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球用靶向性蛋白进一步进行修饰，优选地，所述靶向性蛋白选自对于疾病有特异性的抗体、配体、多肽、小分子或核酸适配体，优选地，
所述靶向性蛋白选自抗体、配体或全人H铁蛋白。

[0016] 在一些实施方案中，所述靶向性蛋白是全人H铁蛋白。

[0017] 在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：

[0018] 1)在形成碳前驱体的过程中引入含氮物质；

[0019] 2)进行碳化。

[0020] 在一些实施方案中，所述氮掺杂纳米碳球利用下述方法制得：

[0021] 1)在形成碳前驱体的过程中引入三聚氰胺，其中碳前驱体为苯酚，且三聚氰胺与苯酚的质量比为1:5～5:1，优选地，1:3～3:1，更优选地，1:2～2:1，最优选地，1:1；2)在
500-1200℃下碳化1-8hr，优选地，温度为600-1000℃，更优选地，700-900℃，更优选地，
750-850℃，优选地，碳化时间为1.5-6hr，更优选地，2-5hr，更优选地，2.5-4hr，更优选，
2.5-3.5hr，最优选地，3hr。

[0022] 换言之，在本发明中，申请人首次发现，氮掺杂纳米碳球(N-carbon) 具有天然的超氧化物歧化酶(SOD)活性，其超氧化物歧化酶活性与天然超氧化物歧化酶类似，可以把有
害的超氧自由基转化为过氧化氢，在生物体内清除自由基。已知由氧自由基引发的疾病多
达数十种。因此，氮掺杂的纳米碳球的超氧化物歧化酶活性可以像天然的超氧化物歧化酶
一样，对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成
的对细胞伤害，实现对多种疾病的预防和/或治疗效果。如预防和治疗大脑局部出血、溃疡、
消除炎症、心率失常、浮肿、中毒、风湿、类风湿、风湿性关节炎、放射性损伤、药物中毒，预防
和治疗特异性脑损伤、非特异性脑损伤而引起的脑功能识别障碍等。本申请的实验结果还
表明，铁等金属原子的掺杂可以有效提高其类超氧化物歧化酶催化活性。利用氮掺杂碳球
的超氧化物歧化酶活性可以实现对多种疾病的预防和/或治疗，如缺血性脑卒中。

附图说明

[0023] 图1Carbon(A图)、N-carbon(B图)的透射电子显微镜(TEM)表征及对两种材料的光电子能谱分析(C图)。TME电镜结果表明，N掺杂不会影响纳米碳球的形貌及尺寸，光电子能
谱分析表明N掺杂成功。

[0024] 图2 N-carbon的高分辨率投射电子显微镜(A图)及扫描投射电子显微镜(B-D图)表征。

[0025] 图3 N-Carbon的超氧化物歧化酶活性表征。

[0026] 图4Fe掺杂后，Fe-N-carbon具有更强的酶活性。A图和B图为对 Fe-N-carbon的光电子能谱分析。结果表明，在纳米碳球中，成功掺入了Fe。 C图为对Carbon、N-carbon及Fe-
N-carbon的超氧化物歧化酶活性表征。结果表明，Fe掺杂，会进一步增强纳米碳球的酶活
性。

[0027] 图5不同金属掺杂后，对N-carbon颗粒酶活性的影响。其中，将碳球与传统的磁颗粒Fe3O4，以及未掺杂N的碳球N0,N-carbon(N3)以及掺杂 N比例高的碳球N-HCNs进行了定量
的对比。

[0028] 图6对Fe-N-carbon纳米颗粒，N-carbon纳米颗粒及不掺杂N的carbon (N0)进行SOD酶活性的测定。

[0029] 图7Fe-N-carbon纳米颗粒对缺血性脑卒中的治疗效果。A，为不掺杂 N的carbon(N0)治疗组；B为Fe-N-carbon纳米颗粒治疗组。图中脑切片为TTC(氯化三苯基四氮唑)染色
的结果。若染色为白色，则表明组织已经坏死，若染色为红色，则表明组织是具有活力的。

具体实施方式

[0030] 定义

[0031] 如本文所用，术语“纳米碳球”是指尺度是纳米尺度，形貌是球形的碳颗粒，其组成为C、N、O，粒径在20-200nm之间，如20nm、30nm、40nm、 50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、
110nm、120nm、130nm、140nm、 150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm，如20-180nm、30-
160nm、 40-150nm、50-150nm、60-150nm、70-150nm、80-140nm、90-140nm、 100-130nm、110-
130nm、115-125nm、20-140nm、30-130nm、40-120nm、 50-110nm、60-100nm、70-90nm，其它形
状的一些颗粒，比如纳米棒，纳米片，纳米花等含氮碳材料亦有模拟氧化酶活性。本发明的
纳米碳球的边界粒径上限为300nm。本发明的纳米碳球的粒度分布相对均一，但粒度分布是
否均一并不实质性影响本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性。本发明所用的纳米碳球可以利
用本领域已知的任何方法制备。

[0032] 如本文所用，术语“氮掺杂的纳米碳球”是指在碳骨架中掺杂有氮(N) 原子的纳米碳球，具体讲就是在石墨化结构中掺入了N原子。本领域知晓如何将N原子掺入纳米碳球的
方法，例如，一种常规的方法就是在前驱体中加入含氮物质，如加入三聚氰胺，前驱体中含
氮物质的量直接影响着最终氮掺杂纳米碳球的氮含量，也有用后处理的方法，例如NH3气处
理等。一般需要高温碳化过程，或者高温处理。碳化过程对最终产物的氮含量也有较大影
响，随着碳化温度的升高，碳化时间的延长，都会造成氮含量的降低。本发明所用的氮掺杂
的纳米碳球的氮掺杂比例为0.5-15at％，如0.5-13at％、 0.5-12％、1-11at％、1-9at％、
1.5-8at％、2-7at％、2-6at％、2.5-5at％、 2.5-4.5at％，如0.6at％、0.8at％、1at％、
1.2at％、1.4at％、1.6at％、 1.8at％、2.0at％、2.2at％、2.4at％、2.6at％、2.8at％、
3.0at％、3.5at％、 4.0at％、4.5at％、5.0at％、5.5at％、6.0at％、6.5at％、7.0at％、
7.5at％、 8.0at％、8.5at％、9.0at％、9.5at％、10.0at％、11.0at％、12.0at％、13.0at％、 
14.0at％。

[0033] 本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性与粒径大小相关，粒径越小，催化效能越高，其催化效率跟比表面积、氮含量等诸多条件也有关。含氮的、比表面积大的含氮碳球可以用本
领域的任何方法制备，具有高低不同但相似的效果。本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性在
低于7的酸性pH值环境下发挥，例如pH值为1-6.5、2-6、3-5.5、3.5-5、4.0-4.5，例如pH为
2.5、3、3.5、4、 4.5、5.0、5.5或6.0。

[0034] 如本文所用，术语“继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球”是指继续掺杂其它金属元素的氮掺杂的纳米碳球，例如掺入Fe、Co、Ni、Cu、 Ce、Mn中的一种或多种，如2种、3
种、4种或更多种，优选地，所述掺入的金属元素为Fe。

[0035] 如本文所用，术语“超氧化物歧化酶”(superoxide dismutase，缩写SOD) 是指一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、
植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。“类超氧化物歧化酶活
性”是指具有类似于SOD酶活性的一类催化作用的总称。

[0036] 如本文所用，氮掺杂纳米碳球用作超氧化物歧化酶的用途是指，本申请的氮掺杂纳米碳球具有超氧化物歧化酶活性，可以与天然的超氧化物歧化酶，如Cu.Zn-SOD、Mn-SOD
或Fe-SOD，一样发挥作用，起到超氧化物歧化酶的作用。相应地，天然超氧化物歧化酶所能
起到的作用，本发明的氮掺杂纳米碳球也都能起到。

[0037] 如本文所用，术语“可以基于超氧化物歧化酶活性预防和/或治疗的疾病”是指基于超氧化物歧化酶催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢，从而消除自由基的
活性，对因自由基的损害而产生的疾病进行预防和/ 或治疗。在一些实施方案中，本发明的
氮掺杂纳米碳球可以以粉末剂、悬浊液或者溶液的形式提供，其例如含药学上可接受的载
体。本发明的氮掺杂纳米碳球可以通过适宜的方式施用给受试者，例如通过静脉注射或者
病灶部位直接注射的方式施用给受试者。

[0038] 所述受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。

[0039] 如本文所用，药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸
盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲
基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十
二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和
聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

[0040] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

[0041] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本实施例中的化学试剂，除非特别指明，均购自于Sigma-
Aldrich Inc.(USA)。

[0042] 实施例1.氮掺杂纳米碳球(简称为N-Carbon)的制备及表征

[0043] 1.798g三聚氰胺，2.1mL福尔马林水溶液(37.0wt％)和15mL蒸馏水在三颈烧瓶中混匀，并在80℃条件下搅拌均匀，获得无色透明溶液。然后，向上述溶液中加入0.6g苯酚，
2.1mL福尔马林溶液(37.0wt％)和15 mL NaOH(0.1mol·L-1)溶液，在66℃条件下搅拌0.5小
时(h)以获得低分子量的酚醛树脂(分子量小于10000道尔顿)。然后向反应体系中加入15mL 
嵌段共聚物Pluronic F127(0.7g)，以350rpm的速度，在66℃条件下搅拌2 h之后，向反应液
中加入50mL蒸馏水，继续反应。在反应过程中，反应液由无色变成粉色，最终变为深红色。反
应24h后，反应终止，有沉淀出现。静止一段时间，沉淀会复溶，然后将17.7mL获得的反应液
转入高压釜(反应釜容积30ml)中加热至130℃反应24h。最终，通过离心(转速8000转 /分，5
分钟)收集产物，水洗几次后，室温干燥。获得的干燥粉末在N2条件下800℃碳化来去除
Pluronic F127模板,最终获得氮掺杂纳米碳球纳米颗粒 (N-carbon nanoparticles，简称
为N-Carbon)。作为对照，不掺杂氮的纳米碳球颗粒(Carbon nanoparticles，简称为
Carbon)同时合成，区别为在上述体系中不加入三聚氰胺。

[0044] Carbon、N-carbon纳米颗粒的形貌利用透射电子显微镜(Tecnai 12,Philip, 荷兰)表征。结果如图1的A图、B图所示，获得的Carbon及N-carbon纳米颗粒的尺寸均为100nm。
不掺杂氮的纳米碳球颗粒跟掺杂氮的颗粒无差别。光电子能谱分析(XPS)表面在掺杂氮的
纳米碳球N-carbon中有明显的 N、O存在(图1的C图)，而无氮掺杂的没有。这表明纳米碳球
中N掺杂成功。

[0045] N-carbon纳米颗粒的形貌进一步通过高分辨率投射电子显微镜 (HRTEM)成像表征。如图2的A图所示，可见均一的100nm左右的颗粒。 N-carbon不同纳米颗粒的均一性和同
质性通过扫描投射电子显微镜(STEM) 来表征。如图2的B-D图所示，通过对不同的N-carbon
纳米颗粒的STEM 表征，不同的单个N-carbon纳米颗粒具有同样的元素分布，其中图2的C图
为C的k-edge分布，图2的D图为N的k-edge分布。可见，N-carbon纳米颗粒是一种组成分布均
一的纳米颗粒。N的掺入量的定量数据通过元素分析仪、XPS、能谱等方法进行测定。本实验
中给定条件下的氮掺入量对N-3为 3.37at％，N-5为2.85at％。其中at％是指原子数百分含
量。

[0046] 实施例2N-carbon具有超氧化物歧化酶活性

[0047] N-carbon超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：N-carbon和不掺杂N的 carbon颗粒(N0)的SOD酶活性测定使用SOD Assay Kit–WST试剂盒(同仁化学研究所(Dojindo))测定。
按照说明书操作后，得到的结果如图3所示，N-carbon颗粒在极低的浓度下，即具有非常强
的SOD酶活性。但是不掺杂N的碳球(N0)没有任何SOD酶活性。

[0048] 实施例3.在氮掺杂的基础上，继续掺杂其他金属元素，可增强Carbon 颗粒的类超氧化物歧化酶活性。

[0049] 本实施例中，本发明人在N掺杂的基础上继续掺杂铁，来证实金属元素的掺杂是否可进一步增强Carbon材料的类氧化酶活性。具体步骤如下：在 250ml圆底烧瓶中加入90ml
乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀，再往上述溶液中加入2.0ml氨水，搅拌约10min后，加入
4.0ml TEOS搅拌8h，停止反应，高速离心得到白色固体，去离子水、乙醇各洗涤3次，置于60
℃烘箱干燥12h，得到SiO2固体，研碎备用。将所得100mg SiO2小球分散在Tris-HCl (pH＝
8.5)缓冲溶液中，加入100mg的多巴胺，反应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到PDA@
SiO2，备用。将上述所得的PDA@SiO2分散在 20ml的乙醇溶液中，加入100mg FeCl3·6H2O,反
3+ 3+
应24h后，离心、洗涤、收集沉淀，烘干后得到Fe -PDA@SiO2，备用。将上述所得Fe -PDA@SiO2
小球800℃下煅烧2h后，碱洗8h后，离心洗涤，烘干，即得Fe-N-carbon纳米颗粒。

[0050] Fe-N掺杂的纳米碳球的酶活性通过测定其超氧化物歧化酶活性来进行验证，反应体系同实施例2，反应体系中加入Carbon、N-carbon及Fe-N-carbon，浓度均为7.5μg/mL。结
果如图4的A-C图所示，Carbon单独不具有超氧化物歧化酶活性，N-carbon具有明显的超氧
化物歧化酶活性。而继续掺杂Fe 的Fe-N-carbon，在同等条件、同等浓度下，具有比N-
carbon更强的超氧化物歧化酶活性。基于此实施例，本发明人继续向N掺杂的carbon中掺杂
其他金属离子(Ni/Ce/Mn/Cu)，发现金属掺杂后，均会进一步增强其酶活性(图 5)。这些结
果表明，金属掺杂，会进一步增强N-carbon的超氧化物歧化酶活性。

[0051] 实施例4.基于氮掺杂碳球的超氧化物歧化酶活性，用于体内缺血性脑卒中的治疗

[0052] 本实施例中，用到的氮掺杂碳球为Fe-N-carbon颗粒。基于其超氧化物歧化酶活性，发明人将其应用于体内缺血性脑卒中的治疗，具体实施例如下：

[0053] 发明人利用大鼠脑缺血再灌注损伤模型(缺血性脑卒中)来评估 Fe-N-carbon颗粒对脑损伤的保护作用。本实施例中，采用不掺杂N的N0作为阴性对照。具体实施例如下：大
鼠(SD品系，购自维通利华)麻醉后，于颈部正中做切口，露出CCA(颈总动脉)以及颈动脉分
叉部。将ECA(颈外动脉)及ICA(颈内动脉)的颅外分支分离、结扎、切断。结扎ECA及 CCA。在
CCA结扎靠头端剪0.2mm小口，尼龙缝合线从CCA开口处插入ICA，进入长度大约16mm，到达大
脑下动脉环MCA(是大脑中动脉) 起始部，阻断来自ICA和大脑后动脉(PCA)的血液。1h后，撤
掉尼龙缝合线，进行再灌注。此时，注射等量的N0及Fe-N-carbon(2mg/mL,200L)颗粒， 24h
后，处死大鼠，取脑组织切片，并进行TTC(氯化三苯基四氮唑)染色。

[0054] 结果如图6所示，Fe-N-carbon超强的SOD酶活性，可以显著性的改善脑部缺血造成的脑组织坏死的面积(图7的B图)，而不具有SOD酶活性的 N0，则出现了大面积的脑坏死现
象(图7的A图)。由此可见，氮掺杂的碳球可以用于缺血性脑卒中的体内治疗。

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