氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其用途转让专利
申请号 : CN201710552197.3
文献号 : CN109200060B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 阎锡蕴 , 范克龙 , 高利增 , 奚菊群 , 王培霞 , 范磊 , 段德民
申请人 : 昆山新蕴达生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.N-carbon纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途,其中所述N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得:
1.798 g 三聚氰胺,2.1 mL 的37.0 wt %福尔马林水溶液和15 mL 蒸馏水在三颈烧瓶中混匀,并在80°C条件下搅拌均匀,获得无色透明溶液;然后,向上述溶液中加入0.6 g苯酚,2.1 mL的37.0 wt %福尔马林溶液和15 mL 0.1 mol×L-1 的NaOH溶液,在66°C条件下搅拌0.5 h以获得分子量小于10000 道尔顿的酚醛树脂;然后向反应体系中加入含 0.7 g的嵌段共聚物Pluronic F127 15 mL,以350 rpm 的速度,在66 °C条件下搅拌 2 h 之后,向反应液中加入50 mL 蒸馏水,继续反应;在反应过程中,反应液由无色变成粉色,最终变为深红色;反应24h后,反应终止,有沉淀出现;静止一段时间,沉淀会复溶,然后将17.7 mL获得的反应液转入30 ml高压釜中加热至130 °C反应24 h;最终, 8000转/分 离心5分钟收集产物,水洗几次后,室温干燥;获得的干燥粉末在N2条件下800°C 碳化来去除Pluronic F127模板, 最终获得N-carbon纳米颗粒;其中所述肿瘤选自选自肝细胞癌或肝母细胞瘤。
2.Fe-N-carbon纳米颗粒在制备抗感染药物中的用途,其中所述Fe-N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得:
在250ml圆底烧瓶中加入90ml乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀,再往上述溶液中加入2.0ml氨水,搅拌约10min后,加入4.0ml TEOS搅拌8h,停止反应,高速离心得到白色固体,去离子水、乙醇各洗涤3次,置于60℃烘箱干燥12h,得到SiO2固体,研碎备用;将所得100mg SiO2小球分散在pH=8.5的Tris-HCl缓冲溶液中,加入100mg的多巴胺,反应24h后,离心、洗涤、收集沉淀,烘干后得到PDA@SiO2,备用;将所得的PDA@SiO2分散在20ml的乙醇溶液中,加入100mg FeCl3•6H2O, 反应24h后,离心、洗涤、收集沉淀,烘干后得到Fe3+- PDA@SiO2,备用;
将所得Fe3+- PDA@SiO2小球800℃下煅烧2h后,碱洗8h后,离心洗涤,烘干,即得Fe-N-carbon 纳米颗粒;
其中所述感染选自铜绿假单胞菌感染。
3.N-carbon纳米颗粒用于处理含有机物污水的用途,其中所述N-carbon纳米颗粒利用下述方法制得:
1.798 g 三聚氰胺,2.1 mL的37.0 wt %福尔马林水溶液和15 mL 蒸馏水在三颈烧瓶中混匀,并在80°C条件下搅拌均匀,获得无色透明溶液;然后,向上述溶液中加入0.6 g苯酚,2.1 mL的37.0 wt %福尔马林溶液和15 mL 0.1 mol×L-1 的NaOH溶液,在66°C条件下搅拌0.5 h以获得分子量小于10000 道尔顿的酚醛树脂;然后向反应体系中加入含 0.7 g的嵌段共聚物Pluronic F127 15 mL,以350 rpm 的速度,在66 °C条件下搅拌 2 h 之后,向反应液中加入50 mL 蒸馏水,继续反应;在反应过程中,反应液由无色变成粉色,最终变为深红色;反应24h后,反应终止,有沉淀出现;静止一段时间,沉淀会复溶,然后将17.7 mL获得的反应液转入30 ml高压釜中加热至130 °C反应24 h;最终, 8000转/分 离心5分钟收集产物,水洗几次后,室温干燥;获得的干燥粉末在N2条件下800°C 碳化来去除Pluronic F127模板, 最终获得N-carbon纳米颗粒;其中所述有机物选自苯。
4.如权利要求1或3所述的用途,其中所述N-carbon纳米颗粒的粒径范围为70-140nm。
5.如权利要求1所述的用途,其中所述N-carbon纳米颗粒用靶向性蛋白进一步进行修饰,所述靶向性蛋白是全人H铁蛋白。
说明书 :
氮掺杂纳米碳球的类氧化酶活性及其用途
技术领域
在肿瘤治疗、抗感染治疗和污水处理中的用途。
背景技术
吡啶、吡咯、石墨氮、吡啶氧化物等含氮官能团,不仅可以提高纳米碳材料的表面化学活性,
还可对其电子结构进行调节,从而改变纳米碳球的催化活性、导电性和吸附性能等[1,2]。
传统的氮掺杂纳米材料广泛用于氧还原反应(oxygen reduction reaction,ORR)[3],超级
电容器 [4]以及电化学和生物传感器[5]等领域。但是迄今为止,未有将其应用于生物医学
的报道。
领了纳米酶颗粒研究的热潮,有近百种纳米材料的不同纳米酶颗粒活性被陆续报道[8,9],
并被广泛应用于纳米生物医学技术领域,比如生物传感、生物成像、组织工程、肿瘤的诊断
和治疗等等 [10-12]。
发明内容
癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌或黑色素瘤,更优
选地,所述肿瘤选自肝细胞癌或肝母细胞瘤。
感染选自细菌感染、放线菌感染和真菌感染的一种或多种,优选地,所述感染是细菌感染,
更优选地,所述感染是链球菌、葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染。
和Cu的一种或多种。更优选的,所述金属元素是Fe。
500-1200℃下碳化1-8hr,优选地,温度为600-1000℃,更优选地,700-900℃,更优选地,
750-850℃,优选地,碳化时间为1.5-6hr,更优选地,2-5hr,更优选地,2.5-4hr,更优选,
2.5-3.5hr,最优选地,3hr。
自由基,从而对底物进行氧化反应。并且铁等金属原子的掺杂可以有效提高其类氧化酶催
化活性。本发明人将具有氧化酶活性的N-Carbon应用于肿瘤的体内治疗,发现无需任何其
他药物的添加, N-carbon可显著性的杀伤肿瘤细胞,具有良好的治疗效果。而且,利用 N-
carbon的氧化酶活性,还可以实现抗感染治疗和含有机物废水的处理。因此,本发明不仅首
次证实了氮掺杂纳米碳球具有氧化酶活性,还发现其可以用于治疗肿瘤、抗感染和污水处
理等用途。
附图说明
谱分析表明N掺杂成功。
进行。
理后的肿瘤细胞内羟基自由基检测;(C图) 不同纳米材料对HepG2细胞存活率的影响。
给药的时间点。生存期统计方法为Log-rank (Mantel-Cox)test。
Fe-N-carbon的氧化酶活性表征。结果表明, Fe掺杂,会进一步增强纳米碳球的氧化酶活
性。
定量的对比。
水经N-carbon颗粒处理后的效果图。
具体实施方式
110nm、120nm、130nm、140nm、 150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm,如20-180nm、30-
160nm、 40-150nm、50-150nm、60-150nm、70-150nm、80-140nm、90-140nm、 100-130nm、110-
130nm、115-125nm、20-140nm、30-130nm、40-120nm、 50-110nm、60-100nm、70-90nm,其它形
状的一些颗粒,比如纳米棒,纳米片,纳米花等含氮碳材料亦有模拟氧化酶活性。本发明的
纳米碳球的边界粒径上限为300nm。本发明的纳米碳球的粒度分布相对均一,但粒度分布是
否均一并不实质性影响本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性。本发明所用的纳米碳球可以利
用本领域已知的任何方法制备。
方法,例如,一种常规的方法就是在前驱体中加入含氮物质,如加入三聚氰胺,前驱体中含
氮物质的量直接影响着最终氮掺杂纳米碳球的氮含量,也有用后处理的方法,例如NH3气处
理等。一般需要高温碳化过程,或者高温处理。碳化过程对最终产物的氮含量也有较大影
响,随着碳化温度的升高,碳化时间的延长,都会造成氮含量的降低。本发明所用的氮掺杂
的纳米碳球的氮掺杂比例为0.5-15at%,如0.5-13at%、 0.5-12%、1-11at%、1-9at%、
1.5-8at%、2-7at%、2-6at%、2.5-5at%、 2.5-4.5at%,如0.6at%、0.8at%、1at%、
1.2at%、1.4at%、1.6at%、 1.8at%、2.0at%、2.2at%、2.4at%、2.6at%、2.8at%、
3.0at%、3.5at%、 4.0at%、4.5at%、5.0at%、5.5at%、6.0at%、6.5at%、7.0at%、
7.5at%、 8.0at%、8.5at%、9.0at%、9.5at%、10.0at%、11.0at%、12.0at%、13.0at%、
14.0at%。
领域的任何方法制备,具有高低不同但相似的效果。本发明的氮掺杂纳米碳球的酶活性在
低于7的酸性pH值环境下发挥,例如pH值为1-6.5、2-6、3-5.5、3.5-5、4.0-4.5,例如pH为
2.5、3、3.5、4、 4.5、5.0、5.5或6.0。
种、4种或更多种,优选地,所述掺入的金属元素为Fe。
性”是指具有类似氧化酶活性的一类催化活性的总称。
化酶活性实现。
乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤等
人体实体瘤。
施用给受试者,例如通过静脉注射或者实体肿瘤直接注射的方式施用给受试者。
白。
氮掺杂纳米碳球可以以组合物的形式提供,其包含药学上可接受的载体。例如所述氮掺杂
的纳米碳球可以以溶液、洗剂、乳剂、粉剂、软膏、湿敷剂、汀剂、贴剂、糊剂、凝胶剂、硬膏剂、
胶膜剂等形式提供。
盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;润湿剂如甘油;崩解剂如羧甲基淀粉钠,羟丙纤维素,交联羧甲
基纤维素,琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂如季铵化合物;表面活性剂如十六烷醇,十
二烷基硫酸钠;吸附载体如高龄土和皂粘土;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和
聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素等有机物,如果直接排放,会造成严重污染。
Aldrich Inc.(USA)。
2.1mL福尔马林溶液(37.0wt%)和15 mL NaOH(0.1mol·L-1)溶液,在66℃条件下搅拌0.5小
时(h)以获得低分子量的酚醛树脂(分子量小于10000道尔顿)。然后向反应体系中加入15mL
嵌段共聚物Pluronic F127(0.7g),以350rpm的速度,在66℃条件下搅拌2 h之后,向反应液
中加入50mL蒸馏水,继续反应。在反应过程中,反应液由无色变成粉色,最终变为深红色。反
应24h后,反应终止,有沉淀出现。静止一段时间,沉淀会复溶,然后将17.7mL获得的反应液
转入高压釜(反应釜容积30ml)中加热至130℃反应24h。最终,通过离心(转速8000转 /分,5
分钟)收集产物,水洗几次后,室温干燥。获得的干燥粉末在N2条件下800℃碳化来去除
Pluronic F127模板,最终获得氮掺杂纳米碳球纳米颗粒 (N-carbon nanoparticles,简称
为N-Carbon)。作为对照,不掺杂氮的纳米碳球颗粒(Carbon nanoparticles,简称为
Carbon)同时合成,区别为在上述体系中不加入三聚氰胺。
不掺杂氮的纳米碳球颗粒跟掺杂氮的颗粒无差别。光电子能谱分析(XPS)表面在掺杂氮的
纳米碳球N-carbon中有明显的 N、O存在(图1的C图),而无氮掺杂的没有。这表明纳米碳球
中N掺杂成功。
质性通过扫描投射电子显微镜(STEM) 来表征。如图2的B-D图所示,通过对不同的N-carbon
纳米颗粒的STEM 表征,不同的单个N-carbon纳米颗粒具有同样的元素分布,其中图2的C图
为C的k-edge分布,图2的D图为N的k-edge分布。可见,N-carbon纳米颗粒是一种组成分布均
一的纳米颗粒。N的掺入量的定量数据通过元素分析仪、XPS、能谱等方法进行测定。本实验
中给定条件下的氮掺入量对N-3为3.37at%,N-5为2.85at%。其中at%是指原子数百分含
量。
纳米颗粒的反应液1.0mL(0.1M醋酸钠缓冲液,pH 4.25)中加入10μL TMB(终浓度为
0.416mM)。室温反应10分钟 (min)后,用酶标仪(Bio-Rad)测定反应体系在652nm处的吸收
峰,来测定其酶活性及强弱。实验中用Fe3O4纳米酶及不掺杂氮的纳米碳球Carbon来作为阴
性对照。实验已经证实,Fe3O4纳米酶不具有氧化酶活性。
处理组,是用氧气提前鼓泡处理反应体系40min,使反应溶液氧气饱和,然后再进行氧化酶
反应和测定。紫外全波长吸收利用 Nanodrop2000(Thermo Fisher)测定。
整个反应的进行。本实施例进一步验证了N-carbon 具有氧化酶的活性。
carbon表面的羧基。水洗两遍,最后用1mL的pH=6的醋酸钠缓冲液(50mM)重悬。用10μl的
DMSO 溶解0.5mg的Alexa Flour@488cadaverine(Thermo Fisher Scientific),再将溶解
好的荧光染料加入到重悬好的N-carbon中,4℃、避光偶联过夜。第二天,弃掉上清,加入
50mM pH=7的Tris-HCl缓冲液,室温孵育30min,中和掉未反应的活化羧基位点。然后水洗
三次,洗掉未结合的荧光染料,最后用1ml的PBS重悬N-carbon,并避光保存。
(Sigma-Aldrich)及抗生素青霉素(100U/mL, Sigma-Aldrich)及链霉素(100g/mL,Sigma-
Aldrich),37℃,5%CO2条件下培养。12h以后弃掉细胞培养上清,分别加入1.5ml的0.2mg/
ml N-carbon, 37℃、5%CO2孵育24h以后弃掉培养上清,用PBS洗两遍,用4%PFA室温固定
15min,之后用0.1%的Triton通透3min;结束之后用PBS洗两遍,用5%羊血清37℃封闭
45min;用5%羊血清按1:50配置LAMP-1(Santa Cruz Biotechnology,H4A3),并在玻底培养
皿4℃孵育LAMP-抗体过夜;用 PBS小心洗3次,用5%羊血清按1:200配制羊抗鼠的555二抗
(life,A21202) 37℃孵育45min;用PBS洗3次,用超纯水按1:1000配制DAPI染10min,最后用
PBS洗三次,用激光共聚焦显微镜在488、555nm激发波长下观察 N-carbon的定位
基础。氧化酶活性的发挥需要在酸性环境中,而 N-carbon经肿瘤细胞吸收后,富集在溶酶
体中,可在氧气存在的前提下,产生自由基,对肿瘤细胞进行有效的杀伤。
养基,37℃、5%CO2孵育36h以后弃掉培养上请,用PBS洗两遍,然后1.5ml,20μM的PBS溶解的
H2DCFDA (Sigma,D6883)孵育HepG2。30min以后弃掉细胞培养上清,用PBS洗两遍,最后用
1.5mL的完全培养基重悬,然后用488nm的激发光观察细胞
基本上无明显的信号产生。这些结果表明, N-carbon经肿瘤细胞摄取后,富集在溶酶体中,
通过其氧化酶活性,产生了大量的自由基,因而有希望对肿瘤细胞进行杀伤。
之前超声30s。对照样品用等体积PBS孵育, 37℃、5%CO2细胞培养箱孵育48h以后用CCK-8
细胞增殖毒性检测试剂盒 (东仁化学科技(上海)有限公司CK04-3000T)检测细胞毒性。
独特的氧化酶活性,可富集到肿瘤细胞的溶酶体中,发挥氧化酶活性,产生大量自由基,从
而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
到200mm3时,对移植瘤小鼠进行N-carbon治疗研究。对于治疗窗口期的选择,因为氧化酶活
性的发挥需要氧气的参与,因此,待移植瘤长到200mm3时,肿瘤新生血管大量生成,有充足
的血液供应。此时治疗,氧化酶的活性可以充分发挥。本实施例中,在小鼠肿瘤达到指定尺
寸后的6天内,瘤内注射PBS、Carbon纳米颗粒及N-carbon纳米颗粒(2.5 mg/mL,150L/只),
观察40天,统计生存期、肿瘤生长曲线及体重变化。
test)。PBS跟Carbon处理组荷瘤小鼠的平均生存期为 20、22天,而N-carbon纳米颗粒处理
的荷瘤小鼠,平均生存期可延长至30 天。而体重无明显变化。本实施例证明,N-carbon纳米
颗粒,可以借助其氧化酶活性,对体内的肿瘤进行有效的杀伤。
饰N-carbon(制备方法参见实施例1)对其抑制肿瘤生长的效果。同实施例5,本发明人首先
利用HepG2细胞在Balb/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)上构建了皮下移植瘤
模型,待移植瘤长到200mm3时,瘤内注射N-carbon纳米颗粒及人H铁蛋白修饰的N-carbon
纳米颗粒(HFn-N-carbon)(2.5mg/mL,150L/只),观察32天,统计肿瘤生长曲线。
配体,以及靶向性抗体、蛋白、多肽的修饰后,进一步增强了N-carbon纳米颗粒的抗肿瘤活
性。
乙醇和15ml去离子水搅拌混合均匀,再往上述溶液中加入2.0ml氨水,搅拌约10min后,加入
4.0ml TEOS搅拌8h,停止反应,高速离心得到白色固体,去离子水、乙醇各洗涤3次,置于60
℃烘箱干燥12h,得到SiO2固体,研碎备用。将所得100mg SiO2小球分散在Tris-HCl (pH=
8.5)缓冲溶液中,加入100mg的多巴胺,反应24h后,离心、洗涤、收集沉淀,烘干后得到PDA@
SiO2,备用。将上述所得的PDA@SiO2分散在 20ml的乙醇溶液中,加入100mg FeCl3·6H2O,反
应24h后,离心、洗涤、收集沉淀,烘干后得到Fe3+-PDA@SiO2,备用。将上述所得Fe3+-PDA@SiO2
小球800℃下煅烧2h后,碱洗8h后,离心洗涤,烘干,即得Fe-N-carbon纳米颗粒。
A-C图所示,Carbon单独不具有氧化酶活性,N-carbon具有明显的氧化酶活性。而继续掺杂
Fe的Fe-N-carbon,在同等条件、同等浓度下,具有比N-carbon更强的氧化酶活性。基于此实
施例,本发明人继续向N掺杂的carbon中掺杂其他金属离子(Ni/Ce/Mn/Cu),发现金属掺杂
后,均会进一步增强其酶活性(图9)。这些结果表明,金属掺杂,会进一步增强N-carbon的氧
化酶活性。
的伤口。然后,将铜绿假单胞杆菌菌液(10 cfu/mL)滴到伤口上,保证菌液在伤口部位停留
一段时间(10min)。感染12h后开始开展实验。缓冲液组,向伤口滴加10μl缓冲液
(pH5.0NaAc),然后用绷带将伤口包起; Fe-N-carbon组,首先将Fe-N-carbon颗粒用上述缓
冲液稀释到0.2mg/mL,向伤口滴加10μl Fe-N-carbon颗粒,然后用绷带将伤口包起。给药
后,24h 换一次绷带,在第1、3、5天对伤口进行拍照。
人利用了N-carbon碳球的氧化酶活性,进行了降解工业废水中苯类有机物的可行性探讨。
废水样品中,加入20μg N-carbon纳米颗粒和 10μL 30%H2O2,同样充分搅拌。反应6h后,取
反应产物进行气相色谱-质谱联用分析(GC-MS),同时对反应前后的工业废水样品进行拍
照。
加入H2O2后,在氧化酶的作用下,废水中的有机 苯基本上被降解完毕(图11的A图),同时,废
水的颜色也由深色,变为基 本上无色。因此N-carbon的氧化酶活性可用于含有机污染物的
工业废水处 理。
2014.131: p.49-52.
Chemical Communications,2014.50(67):p.9473-9476.
p. 1625-1629.
Electroanalysis,2012.24(6):p.1424-1430.
6060-93.
p.41-60.
vivo. Biomaterials,2016.101:p.272-284。