一种胶原蛋白提取方法

摘要

本发明公开一种胶原蛋白提取方法，包括：①牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；②步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；③步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；④将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；⑤调节胶原粗提液pH，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；⑥加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。

权利要求

1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，牛跟腱用纯化水解冻，去血水和表面异物，用手术剪去表面筋膜，用山梨酸钾溶液超声波清洗，滤水；通过一组预处理溶液Ⅰ搅拌处理后，用山梨酸钾溶液搅拌清洗，滤干；

步骤二，将步骤一处理完的牛跟腱用纯化水浸泡，用手术剪去脂肪膜；通过一组预处理溶液Ⅱ浸泡处理后，用纯化水搅拌清洗，滤干；

步骤三，将步骤二处理完的牛跟腱冷冻后进行切片，并用注射用水搅拌清洗，通过一组前处理溶液浸泡处理后，用注射用水搅拌清洗，滤干；

步骤四，将步骤三处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清为胶原粗提液；

步骤五，将胶原粗提液的pH调至6.5-8.0，加入中性盐并搅拌形成盐析液，并在层析冰柜中放置12-24h，离心盐析液获得胶原蛋白沉淀；

步骤六，重复步骤五三次，通过磷酸盐缓冲液溶解胶原蛋白沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白；

所述步骤一的预处理溶液Ⅰ搅拌处理过程为：

牛跟腱依次在乙醇溶液中搅拌2-8min，次氯酸钠与EDTA-Na2的混合溶液中搅拌2-

10min，TritionX-114溶液中搅拌10-30min；

步骤一中：

所述山梨酸钾溶液的浓度为0.1-2%，乙醇溶液的浓度为75%，混合溶液为0.05-0.35%的次氯酸钠与0.05-0.2%的EDTA-Na2混合液，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

山梨酸钾清洗时间为1-10min；

所述步骤二的预处理溶液Ⅱ浸泡处理过程为：

步骤一处理的牛跟腱依次在乙醇溶液中浸泡2-8min，次氯酸钠溶液中浸泡2-10min，TritionX-114溶液中浸泡10-30min；

步骤二中：

所述乙醇溶液的浓度为75%，次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35%，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

所述纯化水搅拌清洗时间为1-10min；

所述步骤三的前处理溶液浸泡处理过程为：

步骤二处理的牛跟腱依次在次氯酸钠溶液浸泡2-8min，磷酸三丁酯与Triton X-100混合溶液浸泡2-8min，次氯酸钠溶液浸泡2-8min，氢氧化钠溶液浸泡1-3min，TritonX-114溶液浸泡10-30min，碳酸钠溶液浸泡1-3h；TritionX-114溶液的浓度为0.1-2%；

步骤三中，

所述次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35%，碳酸钠溶液的浓度为0.05-0.2%，混合溶液为

0.2-0.5%的磷酸三丁酯与0.1-2%的Triton X-100混合液，氢氧化钠溶液的浓度为0.1-

0.4%；

所述步骤四中的酶解过程为：

a. 酶解罐内通过0.1-2g胃蛋白酶与1-2L酸性溶液充分溶解后制得酶解液，酸性溶液可以是乙酸、柠檬酸，或酒石酸、亚酒石酸中的一种或两种，浓度为0.1-2mol/L；

b. 步骤三处理的牛跟腱50-200g放入酶解罐内，完全浸没在酶解液中；

c. 控制酶解液的pH在2.0-3.0，控制温度在2-8℃；

d. 控制酶解时间为36-48h；

所述步骤五中盐析液中中性盐浓度为0.5-1mol/L。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤五中胶原粗提液的pH通过5-20%的氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸氢钠中的一种或几种完成调节；

所述中性盐为氯化钠、氯化钾中的一种或两种；

所述离心盐析液的离心转速为5000-10000rpm/min，离心时间为25-40min。

3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其特征在于，步骤六中：所述磷酸盐缓冲液的pH为6.9-7.4。

说明书

一种胶原蛋白提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质加工领域，具体涉及一种胶原蛋白提取方法，原料可以为鱼皮、牛腱、鼠尾腱等富含I型胶原蛋白的动物组织。

背景技术

[0002] 胶原蛋白是一种结构相似且最丰富的动物蛋白质，约占全部蛋白质含量的30％以上。其具有很强的伸张能力，是韧带，眼睛角膜(结晶形式)等器官的主要成分，也是细胞外基质的主要组成成分，在医疗领域具有十分重要的作用；并且胶原蛋白还具有使皮肤保持弹性的功效，其一旦老化，则会使皮肤出现皱纹，所以在化妆品领域也具有十分重要的作用。

[0003] 到目前为止，已发现21种结构相似的胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白含量最多，占总胶原蛋白含量的90％，也是当今临床医学用途最广的胶原蛋白。

[0004] 胶原蛋白含量最丰富的组织有皮肤、骨骼、筋腱以及韧带，尤为筋腱胶原蛋白含量最高，所以目前的胶原蛋白提取一般都是通过牛跟腱为原料进行的提取，其提取体系有：酸法、碱法、酸-酶结合法，如申请号为201710196069X的专利公开的一种提取Ⅰ型胶原蛋白的方法(酸性酶法)，申请号为2017102236756的专利公开的一种牛跟腱胶原蛋白的提取方法等。

发明内容

[0005] 本发明主要解决的技术问题是提供一种胶原蛋白提取方法，以牛跟腱为原料，采用酸-酶-盐相结合的方法，可得到特定浓度范围的胶原蛋白，且在局部百级环境下，无需通过过滤除菌工艺即可获得无菌且内毒素水平较低的胶原蛋白。提取的I型医药级胶原蛋白具有生物可降解性、组织可吸收性、生物相容性、弱抗原性，且杂蛋白含量低，亲水性强，抗张强度高。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：步骤一，牛跟腱用纯化水解冻，去血水和表面异物，用手术剪去表面筋膜，用山梨酸钾溶液超声波清洗，滤水；通过一组预处理溶液Ⅰ搅拌处理后，用山梨酸钾溶液搅拌清洗，滤干；步骤二，将步骤一处理完的牛跟腱用纯化水浸泡，用手术剪去脂肪膜；通过一组预处理溶液Ⅱ浸泡处理后，用纯化水搅拌清洗，滤干；步骤三，将步骤二处理完的牛跟腱冷冻后进行切片，并用注射用水搅拌清洗，通过一组前处理溶液浸泡处理后，用注射用水搅拌清洗，滤干；步骤四，将步骤三处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清为胶原粗提液；步骤五，将胶原粗提液的pH调至6.5-8.0，加入中性盐并搅拌形成盐析液，并在层析冰柜中放置12-24h，离心盐析液获得胶原蛋白沉淀；步骤六，重复步骤五三次，通过磷酸盐缓冲液溶解胶原蛋白沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。

[0007] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的改进，步骤一的预处理溶液Ⅰ搅拌处理过程为：牛跟腱依次在乙醇溶液中搅拌2-8min，次氯酸钠与EDTA-Na2的混合溶液中搅拌2-10min，TritionX-114溶液中搅拌10-30min。

[0008] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，所述山梨酸钾溶液的浓度为0.1-0.5％，乙醇溶液的浓度为75％，混合溶液为0.05-0.35％的次氯酸钠与0.05-0.2％的EDTA-Na2混合液，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2％。

[0009] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤一中山梨酸钾清洗时间为1-10min。

[0010] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤二预处理溶液Ⅱ浸泡处理过程为：步骤一处理的牛跟腱依次在乙醇溶液中浸泡2-8min，次氯酸钠溶液中浸泡2-10min，TritionX-114溶液中浸泡10-30min。

[0011] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤二中：所述乙醇溶液的浓度为75％，次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35％，TritionX-114溶液的浓度为0.1-2％。

[0012] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤二中纯化水清洗时间为1-10min。

[0013] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤三的前处理溶液浸泡处理过程为：步骤二处理的牛跟腱依次在次氯酸钠溶液浸泡2-8min，磷酸三丁酯与Triton X-100混合溶液浸泡2-8min，次氯酸钠溶液浸泡2-8min，氢氧化钠溶液浸泡1-3min，TritonX-
114溶液浸泡10-30min，碳酸钠溶液浸泡1-3h。

[0014] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤三中：所述次氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.35％，碳酸钠溶液的浓度为0.05-0.2％，混合溶液为0.2-0.5％的磷酸三丁酯与0.1-2％的Triton X-100混合液，氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.4％。

[0015] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤四中酶解过程为：a.酶解罐内通过0.1-2g胃蛋白酶与1-2L酸性溶液充分溶解后获得酶解液，酸性溶液可以是乙酸、柠檬酸，或酒石酸、亚酒石酸中的一种或两种，浓度为0.1-2mol/L；b.步骤三处理的牛跟腱50-200g放入酶解罐内，完全浸没在酶解液中；c.控制酶解液的pH在2.0-3.0，控制温度在2-8℃。d.控制酶解时间为36-48h。

[0016] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤五中胶原粗提液的pH可通过5-20％的氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸氢钠中的一种或几种完成调节；中性盐为氯化钠、氯化钾中的一种或两种，盐析液中中性盐浓度为0.5-1mol/L。盐析液离心转速为5000-10000rpm/min，离心时间为25-40min。

[0017] 根据本发明所述的胶原蛋白提取方法的进一步改进，步骤五重复三次后，步骤六磷酸盐缓冲液pH为6.9-7.4，获得的胶原蛋白浓度为10-75mg/ml。

[0018] 本发明的有益效果是：本发明提供的一种胶原蛋白提取方法，以牛跟腱为原料，采用酸-酶-盐相结合的方法，可得到特定浓度范围的胶原蛋白，且在局部百级环境下，无需通过过滤除菌工艺即可获得无菌且内毒素较低的胶原蛋白。提取的I型医药级胶原蛋白具有生物可降解性、组织可吸收性、生物相容性、弱抗原性，且杂蛋白含量低，亲水性强，抗张强度高。

[0019] 说明书附图

[0020] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0021] 图1是本发明进行电泳测试方法所得电泳图。

具体实施方式

[0022] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0023] 实施例1、

[0024] (1)第一次预处理：

[0025] 将牛跟腱用纯化水解冻，洗去血水和表面异物，用手术剪将表面的筋膜去除，通过0.5％的山梨酸钾溶液超声清洗5min，滤去水分后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱搅拌
5min，然后在0.05％的次氯酸钠和0.1％的EDTA-Na2混合溶液中对牛跟腱搅拌5min，最后在
0.1％的TritionX-114溶液中对牛跟腱搅拌20min，之后，用0.5％的山梨酸钾溶液搅拌清洗
5min，并滤干。

[0026] (2)第二次预处理：

[0027] 将第一次预处理后的牛跟腱用纯化水浸泡5min，用手术剪去除脂肪膜后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱浸泡5min，其次在0.05％次氯酸钠溶液中对牛跟腱浸泡5min，最后在0.1％TritionX-114溶液中对牛跟腱浸泡20min，之后，用纯化水搅拌清洗，并滤干。

[0028] (3)切片，前处理：

[0029] 将第二次预处理的牛跟腱冷冻后切片100g，用注射用水搅拌清洗后，首先在0.1％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，其次在0.3％磷酸三丁酯与0.1％TritonX-100混合溶液中对牛跟腱切片浸泡5min，然后在0.05％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，然后在0.1％氢氧化钠溶液中对牛跟腱切片浸泡1min，然后在0.1％TritonX-114溶液中对牛跟腱切片浸泡20min，最后在0.1％碳酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡2h，之后，用注射用水搅拌清洗，并滤干。

[0030] (4)酶解：

[0031] 准备0.5g胃蛋白酶，放入1.5L浓度为0.5mol/L的乙酸溶液中充分溶解，获得酶解液；在酶解罐中加入前处理的牛跟腱，并加入酶解液，完全覆盖牛跟腱，酶解36h-48h，酶解过程中控制溶液的pH在2.0-3.0，温度控制在2-8℃，最后离心上清液为粗胶原蛋白溶液，离心沉淀弃去。

[0032] (5)盐析：

[0033] 向酶解离心制备的粗胶原蛋白溶液中加入20％的氢氧化钠，调节溶液的pH值至7.0-8.0，并加入氯化钠(或氯化钾)粉末，直至形成氯化钠(或氯化钾)浓度为0.5mol/L的盐析液；随后，将其在层析冰柜中2-8℃放置12h-24h。

[0034] (6)装罐：

[0035] 重复盐析三次，离心弃去上清液，保留沉淀(沉淀即胶原蛋白)，测得胶原蛋白浓度如35mg/ml，可作为植入性胶原，装罐。取pH为6.9-7.4的磷酸盐缓冲液对沉淀(胶原蛋白)进行溶解，获得特定浓度的胶原蛋白。

[0036] 实施例2、

[0037] (1)第一次预处理：

[0038] 将牛跟腱用纯化水解冻，洗去血水和表面异物，用手术剪将表面的筋膜去除，通过0.5％的山梨酸钾溶液超声清洗5min，滤去水分后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱搅拌
5min，然后在0.1％的次氯酸钠和0.1％的EDTA-Na2混合溶液中对牛跟腱搅拌5min，最后在
0.5％的TritionX-114溶液中对牛跟腱搅拌20min，之后，用0.5％的山梨酸钾溶液搅拌清洗
5min，并滤干。

[0039] (2)第二次预处理：

[0040] 将第一次预处理后的牛跟腱用纯化水浸泡5min，用手术剪去除脂肪膜后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱浸泡5min，其次在0.1％次氯酸钠溶液中对牛跟腱浸泡5min，最后在1.0％TritionX-114溶液中对牛跟腱浸泡20min，之后，用纯化水搅拌清洗，并滤干。

[0041] (3)切片，前处理：

[0042] 将第二次预处理的牛跟腱冷冻后切片100g，用注射用水搅拌清洗后，首先在0.1％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，其次在0.3％磷酸三丁酯与1.0％TritonX-100混合溶液中对牛跟腱切片浸泡5min，然后在0.1％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，然后在0.1％氢氧化钠溶液中对牛跟腱切片浸泡1min，然后在1.0％TritonX-114溶液中对牛跟腱切片浸泡20min，最后在0.1％碳酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡2h，之后，用注射用水搅拌清洗，并滤干。

[0043] (4)酶解：

[0044] 准备0.5g胃蛋白酶，放入1.5L浓度为0.5mol/L的乙酸溶液中充分溶解，获得酶解液；在酶解罐中加入前处理的牛跟腱，并加入酶解液，完全覆盖牛跟腱，酶解36h-48h，酶解过程中控制溶液的pH在2.0-3.0，温度控制在2-8℃，最后离心上清液为粗胶原蛋白溶液，离心沉淀弃去。

[0045] (5)盐析：

[0046] 向酶解离心制备的粗胶原蛋白溶液中加入20％的氢氧化钠，调节溶液的pH值至7.0-8.0，并加入氯化钠(或氯化钾)粉末，直至形成氯化钠(或氯化钾)浓度为0.5mol/L的盐析液；随后，将其在层析冰柜中2-8℃放置12h-24h。

[0047] (6)装罐：

[0048] 重复盐析三次，离心弃去上清液，保留沉淀(沉淀即胶原蛋白)，测得胶原蛋白浓度如35mg/ml，可作为植入性胶原，装罐。取pH为6.9-7.4的磷酸盐缓冲液对沉淀(胶原蛋白)进行溶解，获得特定浓度的胶原蛋白。

[0049] 实施例3、

[0050] (1)第一次预处理：

[0051] 将牛跟腱用纯化水解冻，洗去血水和表面异物，用手术剪将表面的筋膜去除，通过0.5％的山梨酸钾溶液超声清洗5min，滤去水分后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱搅拌
5min，然后在0.35％的次氯酸钠和0.1％的EDTA-Na2混合溶液中对牛跟腱搅拌5min，最后在
2％的TritionX-114溶液中对牛跟腱搅拌20min，之后，用0.5％的山梨酸钾溶液搅拌清洗
5min，并滤干。

[0052] (2)第二次预处理：

[0053] 将第一次预处理后的牛跟腱用纯化水浸泡5min，用手术剪去除脂肪膜后，首先在75％的乙醇溶液中对牛跟腱浸泡5min，其次在0.35％次氯酸钠溶液中对牛跟腱浸泡5min，最后在2％TritionX-114溶液中对牛跟腱浸泡20min，之后，用纯化水搅拌清洗，并滤干。

[0054] (3)切片，前处理：

[0055] 将第二次预处理的牛跟腱冷冻后切片100g，用注射用水搅拌清洗后，首先在0.1％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，其次在0.3％磷酸三丁酯与2％TritonX-100混合溶液中对牛跟腱切片浸泡5min，然后在0.35％次氯酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡3min，然后在0.1％氢氧化钠溶液中对牛跟腱切片浸泡1min，然后在2％TritonX-114溶液中对牛跟腱切片浸泡20min，最后在0.1％碳酸钠溶液中对牛跟腱切片浸泡2h，之后，用注射用水搅拌清洗，并滤干。

[0056] (4)酶解：

[0057] 准备0.5g胃蛋白酶，放入1.5L浓度为0.5mol/L的乙酸溶液中充分溶解，获得酶解液；在酶解罐中加入前处理的牛跟腱，并加入酶解液，完全覆盖牛跟腱，酶解36h-48h，酶解过程中控制溶液的pH在2.0-3.0，温度控制在2-8℃，最后离心上清液为粗胶原蛋白溶液，离心沉淀弃去。

[0058] (5)盐析：

[0059] 向酶解离心制备的粗胶原蛋白溶液中加入20％的氢氧化钠，调节溶液的pH值至7.0-8.0，并加入氯化钠(或氯化钾)粉末，直至形成氯化钠(或氯化钾)浓度为0.5mol/L的盐析液；随后，将其在层析冰柜中2-8℃放置12h-24h。

[0060] (6)装罐：

[0061] 重复盐析三次，离心弃去上清液，保留沉淀(沉淀即胶原蛋白)，测得胶原蛋白浓度如35mg/ml，可作为植入性胶原，装罐。取pH为6.9-7.4的磷酸盐缓冲液对沉淀(胶原蛋白)进行溶解，获得特定浓度的胶原蛋白。

[0062] 针对上文所述的实施例1、实施例2以及实施例3：

[0063] 通过动态显色法测试对比处理前后菌落数和内毒素实验数据如下(表一)：

[0064]

[0065]

[0066] 表一

[0067] 通过电泳测试方法测试得到电泳图(如图1所示)。

[0068] 所述图1中，1为本发明方法提取的胶原蛋白，2为胶原蛋白对照品，3为胶原酶处理后胶原蛋白溶液，4为超纯水阴性对照，5为100ng牛血清蛋白，6为75ng牛血清蛋白，7为50ng牛血清蛋白，8为25ng牛血清蛋白。

[0069] 通过图1可知，本发明提取的胶原蛋白与标准品一样，保持了原有活性基团，经胶原酶处理后检测杂蛋白含量基本为零，并且不同牛血清蛋白染色结果表明电泳图染色有效。

[0070] 综上所述，本发明的胶原蛋白提取方法提取的胶原蛋白纯度高，保持了其天然活性，且在局部百级环境下可控制胶原蛋白的无菌和内毒素水平，在医药及化妆品等领域具有重要的应用价值。

[0071] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。