一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法转让专利
申请号 : CN201811398324.X
文献号 : CN109220811B
文献日 : 2021-10-12
发明人 : 刘保财 , 陈菁瑛 , 黄颖桢 , 赵云青 , 张武君
申请人 : 福建省农业科学院农业生物资源研究所
摘要 :
权利要求 :
1.一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法,其特征在于:所述的方法包括以下依序进行的步骤:
(1)外植体的准备阶段
于每年11月至次年的3月采集野生的且无开裂的石仙桃蒴果;
(2)无菌处理阶段
将步骤(1)所准备的石仙桃蒴果,用无菌水冲洗干净;
然后转移到灭菌后的超净工作台上,用71‑74%的酒精棉擦拭蒴果表面,再用无菌水冲洗干净,之后转入到无菌瓶内,用0.1‑1.6%的升汞灭菌8‑18分钟,最后用无菌水冲洗干净;
(3)初代萌动阶段
接着切开步骤(2)中灭菌好的蒴果并取出种子,将种子撒播在初代萌动培养基上,培养
20‑30天,培养环境如下:pH为5.6‑5.9,温度为24±2℃,黑暗条件下,置于摇床上,转速30‑
50转/分钟;
所述的初代萌动培养基由以下物质组成:硝酸铵1400‑1500 mg/L + 硝酸钾1710‑1810 mg/L + 氯化钙550‑700 mg/L + 硫酸镁400‑450 mg/L + 磷酸二氢钾200‑250 mg/L + 硼酸6.0‑6.5 mg/L + 乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5 mg/L +硫酸锰22.0‑23.0 mg/L + 硫酸锌9.0‑10.0 mg/L + 硫酸铁27.0‑28.0 mg/L + 肌醇90‑100 mg/L + 椰子汁30‑60 g/L + 花宝2号0.1‑0.3g/L + 蛋白胨0.7‑0.9g/L +蔗糖 12‑17g/L + 琼脂3‑5g/L;
(4)原球茎培养及增殖阶段
将经步骤(3)初代萌动阶段的种子,接种到原球茎培养及增殖培养基中培养45‑55天,培养环境如下:pH为5.8‑6.0,温度为24±2℃,置于摇床上,转速50‑70转/分钟,光照强度
500‑1500Lx,光照周期为10‑14 h/d;
所述的原球茎培养及增殖培养基由以下物质组成:硝酸铵1400‑1500 mg/L+硝酸钾
1710‑1810 mg/L+氯化钙550‑700 mg/L+硫酸镁400‑450 mg/L+磷酸二氢钾200‑250 mg/L+硼酸6.0‑6.5 mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5 mg/L+硫酸锰22.0‑23.0 mg/L+硫酸锌
9.0‑10.0 mg/L+硫酸铁27.0‑28.0 mg/L+肌醇90‑100 mg/L + 6‑BA 1.2‑1.8 mg/L + NAA
0.1‑0.4 mg/L + 2,4‑D 0.2‑0.5 mg/L +花宝2号0.6‑0.9g/L + 椰子汁80‑100 g/L + 酵母提取物6‑9g/L + 水解酪蛋白4‑8 g/L + 蔗糖12‑17g/L。
2.根据权利要求1所述的一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法,其特征在于:所述的初代萌动培养基中的椰子汁的浓度为45 g/L ,花宝2号的浓度为0.2g/L,蛋白胨的浓度为0.8g/L,蔗糖的浓度为14 g/L,琼脂的浓度为4 g/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法,其特征在于:所述的原球茎培养及增殖培养基中6‑BA 的浓度为1.6 mg/L,NAA 的浓度为0.3 mg/L ,2,4‑D的浓度为 0.4 mg/L,花宝2号的浓度为0.7g/L,椰子汁的浓度为90 g/L,酵母提取物的浓度为
7 g/L ,水解酪蛋白的浓度为6 g/L,蔗糖的浓度为14 g/L。
说明书 :
一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法
技术领域
技术背景
花、果组成(林来官,张永田等.福建植物志[M].福州:福建科学技术出版社,1994,第六卷:
636‑637)。在我国,石仙桃分布于福建、广东、广西和云南等省,在福建省,石仙桃主要分布
于福州、平和、长乐、南靖等地区。石仙桃生于林中或林缘树上、岩壁上或岩石上,海拔通常
在1500m以下,少数可达2500m(陈心启,吉占和,郎楷永等.中国植物志[M].北京:科学出版
社,1999,18:388‑399)。
上海科学出版社,2006),民间常用来治疗高血压、头晕和各种原因引起的头疼等。用其制成
的“头痛定糖浆”临床上用于治疗神经功能性头痛、脑震荡后遗症,已应用多年,治疗效果良
好(中华人民共和国药典委员会.中药成方制剂(第九册).北京:北京化学工业出版社,
1994:67)。
24(2):119‑121;王光辉,郭晓宇,王乃利等.云南石仙桃氯仿萃取物活性部位对入肝癌细胞
HepG2的周期抑制作用.沈阳药科大学学报,2006,23(4):240‑243;刘建新,周青,连其深.石
仙桃的镇痛作用的研究.赣南医学院学报,2002,22(2):105‑107)。同时现在对其化学成分
做了不同方法的提取和分离,得到天麻苷元、原儿茶醛、胡萝卜苷等化学成分(舒文海.石仙
桃的局麻作用研究.中国药学杂志,1989,24(5):304;林丽聪,张怡评,吴春敏等.石仙桃叶
化学成分研究.时珍国医国药,2009,20(4):922‑923;李兵,郭环娟,容羡贤.石仙桃质量标
准研究.中国药业,2010,19(6):19‑20;林丽聪,吴春敏,陈海滨等.RP—HPLC法测定石仙桃
中天麻素和天麻苷元.中草药.2008,39(2):283‑285)。
非常有限,长期掠夺式采挖野生资源,已导致野生资源锐减并逐渐匮乏,不少原产地石仙桃
资源呈现稀缺甚至濒危趋势。
发明内容
干净;
分钟;本初代萌动培养基为半固体培养基,放置于摇床上,防止种子长期浸泡在水中,因缺
氧而不会发芽,同时缓慢摇动,改变着种子萌动后细胞向地性,更有利于原球茎的形成;
度500‑1500Lx,光照周期为10‑14h/d。本原球茎培养及增殖培养基为液体培养基,放置于摇
床上,防止萌动的胚长期浸泡在水中,因缺氧而直接死亡,同时缓慢摇动,改变着胚萌动后
细胞向地性,更有利于原球茎的形成。
+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L+硫酸锌9.0‑
10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+椰子汁30‑60g/L+花宝2号0.1‑0.3g/L+
蛋白胨0.7‑0.9g/L+蔗糖12‑17g/L+琼脂3‑5g/L。
200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L
+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+6‑BA 1.2‑1.8mg/L+NAA
0.1‑0.4mg/L+2,4‑D 0.2‑0.5mg/L+花宝2号0.6‑0.9g/L+椰子汁80‑100g/L+酵母提取物6‑
9g/L+水解酪蛋白4‑8g/L+蔗糖12‑17g/L。
母提取物的浓度为7g/L,水解酪蛋白的浓度为6g/L,蔗糖的浓度为14g/L。
具体实施方式
1.5%)的升汞灭菌8‑18分钟(预选12分钟),最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3‑5次);
500Lx,光照周期为14h/d。
按照上面所述的过程生长。
慢。
1.5%)的升汞灭菌8‑18分钟(预选12分钟),最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3‑5次);
1500Lx,光照周期为10h/d。
1.5%)的升汞灭菌8‑18分钟(预选12分钟),最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3‑5次);
1000Lx,光照周期为12h/d。
200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L
+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+椰子汁45g/L+花宝2号
0.2g/L+蛋白胨0.8g/L+蔗糖14g/L+琼脂4g/L。
200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L
+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+椰子汁30g/L+花宝2号
0.1g/L+蛋白胨0.7g/L+蔗糖12g/L+琼脂3g/L。
200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L
+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+椰子汁60g/L+花宝2号
0.3g/L+蛋白胨0.9g/L+蔗糖17g/L+琼脂5g/L。
氢钾200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑
23.0mg/L+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+6‑BA 1.6mg/L+
NAA 0.3mg/L+2,4‑D0.4mg/L+花宝2号0.7g/L+椰子汁90g/L+酵母提取物7g/L+水解酪蛋白
6g/L+蔗糖1.4%。本实施例的增殖率高达6.33,原球茎生长快。
氢钾200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑
23.0mg/L+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+6‑BA 1.2mg/L+
NAA 0.1mg/L+2,4‑D0.2mg/L+花宝2号0.6g/L+椰子汁80g/L+酵母提取物6g/L+水解酪蛋白
4g/L+蔗糖12g/L。
氢钾200‑250mg/L+硼酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑
23.0mg/L+硫酸锌9.0‑10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L+1.8mg/L 6‑BA+
0.4mg/L NAA+0.5mg/L2,4‑D+0.9g/L花宝2号+100g/L椰子汁+9g/L酵母提取物+8g/L水解酪
蛋白+17g/L蔗糖。
酸6.0‑6.5mg/L+乙二胺四乙酸二钠37.0‑37.5mg/L+硫酸锰22.0‑23.0mg/L+硫酸锌9.0‑
10.0mg/L+硫酸铁27.0‑28.0mg/L+肌醇90‑100mg/L为基本培养基。
子汁+0.2g/L花宝2号+0.8g/L蛋白胨+14g/L蔗糖+4g/L琼脂;添加物三为60g/L椰子汁+
0.3g/L花宝2号+0.9g/L蛋白胨+17g/L蔗糖+5g/L琼脂。以基本培养基+45g/L椰子汁+0.2g/L
花宝2号+0.8g/L蛋白胨+14g/L蔗糖+4g/L琼脂为佳,萌动率高,可达88%,生长整齐。
+0.1‑0.3g/L花宝2号+0.7‑0.9g/L蛋白胨+1.2‑1.7%蔗糖+0.3‑0.5%琼脂,结果表明,以上
述基本培养基+30‑60g/L椰子汁+0.1‑0.3g/L花宝2号+0.7‑0.9g/L蛋白胨+1.2‑1.7%蔗糖+
0.3‑0.5%琼脂萌动率最高,可达85.33%以上,其次为MS萌动率为80.67%,而B5组合的萌
动率仅为63%,表明此基本培养基适宜于石仙桃种子萌动。与常用的MS、B5等种类的培养基
相比,此基本培养基配方简单,并且由常见的成分定量改为一定的称量区间,在上限与下限
范围内的量,对萌动率没有影响,但增加了配方的操作性,使其易于称量和操作。
根据植物种子的萌发特性,选择了黑暗、500Lx、1500Lx、2500Lx,结果表明500Lx‑1500Lx更
有利于原球茎形成,黑暗条件下,原球茎易于黄化,而2500Lx条件下,生长速度较慢。
蛋白+1.2‑1.7%蔗糖,其中6‑BA是6‑苄氨基腺嘌呤;NAA是a‑萘乙酸;2,4‑D为2,4‑二氯苯氧
乙酸。其中以基本培养基+1.6mg/L 6‑BA+0.3mg/L NAA+0.4mg/L 2,4‑D+0.7g/L花宝2号+
90g/L椰子汁+7g/L酵母提取物+6g/L水解酪蛋白+1.4%蔗糖为佳,繁殖系数高达6.33,原球
茎生长快。
酵母提取物+4‑8g/L水解酪蛋白+1.2‑1.7%蔗糖,结果表明,以上述基本培养基+1.2‑
1.8mg/L 6‑BA+0.1‑0.4mg/L NAA+0.2‑0.5mg/L 2,4‑D+0.6‑0.9g/L花宝2号+80‑100g/L椰
子汁+6‑9g/L酵母提取物+4‑8g/L水解酪蛋白+1.2‑1.7%蔗糖,琼脂增殖系数最高,可达
6.33,其次为MS增殖系数为3.33,而B5组合的增殖系数仅为2.0。