一种罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物及应用

摘要

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种罗非鱼细小病毒LAMP检测引物及应用，发明人从患病罗非鱼成鱼中分离出了一种细小病毒，该病毒为罗非鱼细小病毒（Tilapia parvovirus）TiPV，保藏编号为：CCTCC NO：V201856，对于罗非鱼细小病毒的研究具备开拓性的意义。针对该病毒特异性序列设计引物，可对罗非鱼细小病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

权利要求

1.一种罗非鱼细小病毒(Tilapia parvovirus)TiPV特异性基因，所述的基因为SEQ ID NO.1所示，所述罗非鱼细小病毒(Tilapia parvovirus)TiPV的保藏编号为：CCTCC NO：V20 

1856。

2.基于权利要求1所述的特异性基因设计的引物，所述的引物为：F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTGATCCAGCAATTCCGGAGACA-3'，BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTGTCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

3.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的引物在制备罗非鱼细小病毒检测试剂盒中的应用。

说明书

一种罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物及应用

技术领域

[0001] 本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物及应用。技术背景

[0002] 细小病毒(Parvovirus)是目前为止发现的最小的单股DNA病毒，病毒粒子直径为18～30nm的二十面体，无囊膜，等轴对称。细小病毒在自然界分布极广，可以感染人、脊椎动物及无脊椎动物，并与多种疾病相关。其中人类细小病毒B19(Human parvovirus B19,B19)为人所熟知，能引起幼儿一系列严重的自身免疫性疾病，孕期感染会导致胎儿水肿、流产或先天性感染，对新生儿及幼儿危害较大，引起了世界范围的广泛关注。因此，对细小病毒进行深入研究具有重要意义。此外，细小病毒还能引起家畜多种急性传染病，如犬细小病毒，猪博卡病毒，鹅细小病毒病等。国际病毒分类委员会(International Committee on Taxo nomy of  Viruses,ICTV)于2014年发表了最新的病毒分类报告，将细小病毒科(Pavoviradae)划分为8个属:Amdoparvovirus、Aveparvovirus、Bocaparvovirus、Copiparvovirus、Dependo parvovirus、Erythroparvovirus、Protoparvovirus、Tetraparvovirus。目前划分的细小病毒属中未出现鱼类感染细小病毒的相关报道，本申请专利中新鉴定的罗非鱼细小病毒属于新病毒，造成我国罗非鱼在短时间内大量死亡，对我国罗非鱼的养殖和出口带来巨大的经济损失。

[0003] 本申请人曾在罗非鱼中分离过细小病毒，但该病毒未使得罗非鱼有明显发病症状；而本发明公开的细小病毒可致罗非鱼眼珠、鳃盖、下颌和腹部有明显的出血症状。因此基于本发明提供的病毒及其设计的检测引物更具备实际意义，对监测养殖罗非鱼的健康状况显得尤为重要。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供了一种罗非鱼细小病毒TiPV的特异性基因，所述的基因为SEQ ID NO.1所示，利用该基因与其他病毒的基因差异设计的引物，可用于检测罗非鱼细小病毒TiPV，所述的罗非鱼细小病毒TiPV的保藏编号为CCTCC NO：V201856。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供了基于SEQ ID NO.1所示序列设计的LAMP引物，所述的引物为F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTG-ATCCAGCAATTCCGGAGACA-3'，BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTG-TCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

[0006] 本发明的最后一个目的在于提供了利用包括SEQ ID NO.1所示多核苷酸，或者基于SEQ ID NO.1所示多核苷酸设计的引物在制备成罗非鱼细小病毒检测试剂盒中的应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0008] 一种罗非鱼细小病毒TiPV的特异性基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示，所述的罗非鱼细小病毒TiPV的保藏编号为CCTCC NO：V201856。

[0009] 基于该基因与其他病毒的基因差异设计的引物也属于本发明的保护范围。

[0010] 一种罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物，包括F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTG-ATCCAGCAATTCCGGAGACA-3'，BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTGTCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

[0011] 一种罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物或SEQ ID NO.1所示序列的应用，包括利用上述引物或序列制备成用于检测罗非鱼细小病毒检测试剂盒，或直接用于罗非鱼细小病毒的检测。

[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0013] 1.本发明自患病罗非鱼中分离了具有致病力的细小病毒，对于罗非鱼细小病毒的研究具备开拓性的意义。

[0014] 2.本发明的方法快速简便：本发明所建的LAMP方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。

[0015] 3.本发明的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了LAMP方法扩增的高度特异性。

具体实施方式

[0016] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

[0017] 实施例1：

[0018] 一种罗非鱼细小病毒TiPV，其分离过程如下：

[0019] 1)将携带病毒的罗非鱼脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到罗非鱼肾脏细胞系(TilapiaKidney,TiK)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见TiK细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。

[0020] 培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2

[0021] 2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。

[0022] 3)收集病毒，测序，获得罗非鱼细小病毒TiPV的特异性基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示。

[0023] 罗非鱼细小病毒的形态特征：病毒呈球形，病毒无囊膜，与典型的细小病毒形态相符，该病毒已于2018年9月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：罗非鱼细小病毒(Tilapia parvovirus，TiPV)TiPV，保藏编号：CCTCC NO：V201856，地址：中国武汉武汉大学。

[0024] 实施例2：

[0025] 基于罗非鱼细小病毒TiPV的特异性基因(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒基因的差异设计的引物：

[0026] 一种罗非鱼细小病毒TiPVLAMP检测引物，包括F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTG-ATCCAGCAATTCCGGAGACA-3'，BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTG-TCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

[0027] 实施例3：

[0028] 利用罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物对罗非鱼细小病毒的检测，方法包括：

[0029] 1.罗非鱼组织或感染细胞总DNA的提取：采用Omega(USA)DNA提取试剂盒提取组织DNA。

[0030] 2.LAMP反应扩增：

[0031] 采用25μl反应体系：包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs 1mM，Betaine 0.5M，DTT 4mM，MgCl28mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer。反应管于65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

[0032] F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，

[0033] B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；

[0034] FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTG-ATCCAGCAATTCCGGAGACA-3'，

[0035] BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTG-TCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

[0036] LAMP反应扩增产物分析：

[0037] 1.取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示梯状LAMP特征性条带，结果为阳性；若无任何条带，结果为阴性。

[0038] 2.反应结束后向反应管中加入1000×SYBR Green I 2μL，静置1～5min后观察结果，反应液变绿则为阳性，保持橙色则为阴性。

[0039] 实施例4：

[0040] 罗非鱼细小病毒LAMP检测引物特异性试验

[0041] 利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(TiPV)，待检病毒样品具体为：大鲵虹彩病毒病毒(GSIV)，鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)，锦鲤疱疹病毒(KHV)，鲤鱼浮肿病毒(CEV)及罗非鱼罗湖病毒(TiLV)。

[0042] 表1罗非鱼细小病毒LAMP检测试剂盒特异性试验

[0043] 试验编号 名称 扩增结果1 TiPV +
2 CyHV-2 －
3 KHV －
4 CEV －
5 TiLV －

[0044] 结果如表1所示，仅阳性对照组(TiPV)可检测到梯形特征性条带，其余组均无特征条带，说明罗非鱼细小病毒TiPV LAMP检测引物具备很强的特异性。

[0045] 实施例5：

[0046] 罗非鱼细小病毒LAMP检测引物的灵敏度

[0047] 将浓度为2100ng/μL的TiPVDNA模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用5
本发明提供的引物LAMP的检测限，结果显示，10倍稀释还可检测到目的条带，也就是最低可检测21.00pg/μL的DNA模板。

[0048] 实施例6：

[0049] 罗非鱼细小病毒TiPVLAMP检测引物在制备罗非鱼细小病毒检测试剂盒中的应用：

[0050] 1.罗非鱼组织总DNA的提取：采用Omega(USA)试剂盒提取感染罗非鱼细小病毒TiPV的罗非鱼的脾肾等内脏组织的总DNA，将获得DNA模板-20℃保存备用。

[0051] 2.LAMP反应扩增：

[0052] 采用25μl反应体系：包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs 1mM，Betaine 0.5M，DTT 4mM，MgCl28mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer。反应管于65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

[0053] F3：5'-CAACTAAAGACCCGGTTCC-3'，B3：5'-GCCTTGGTAGCGTAAGTTCA-3'；FIP：5'–GCTATCTCCTCGTTGCTCGGTG-ATCCAGCAATTCCGGAGACA-3',BIP：5'-AGGACGGCCCGGAAGTACTG-TCAAATCCGAGCTGTGTAGC-3'。

[0054] 3.LAMP反应扩增产物分析：

[0055] 1.取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示梯状LAMP特征性条带，结果为阳性；若无任何条带，结果为阴性。

[0056] 2.反应结束后向反应管中加入1000×SYBR Green I 2μL，静置1～5min后观察结果，反应液变绿则为阳性，保持橙色则为阴性。

[0057] 结果显示，阳性对照(罗非鱼细小病毒TiPV)显示梯形特征性条带，阴性对照(水)无明显条带，1-5号感染了罗非鱼细小病毒TiPV的罗非鱼组织样品显示明显的梯形特征性条带，说明样品1-5为罗非鱼细小病毒阳性，与实际情况相符。