一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法转让专利
申请号 : CN201811050158.4
文献号 : CN109239252B
文献日 : 2020-07-03
发明人 : 徐红岩 , 闫凤 , 周敏 , 姜婷
申请人 : 吉尔生化(上海)有限公司
摘要 :
本发明涉及到一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，主要解决这类多肽在反相高效液相色谱中峰行异常的问题，本发明技术方案其检测条件如下：色谱柱：AllsepTM阴离子色谱柱流动相：A相：NaHCO3(0.1mol/L)水溶液，pH值为8.3，B相：甲醇+邻苯二甲酸（0.1mol/L）的混合溶液，用三乙醇胺调节pH值为6.3；AllsepTM阴离子色谱柱0到20分钟，A相：B相由80:20到40:60；流速：0.7ml/min，波长：214nm，样品溶解方法：70%体积A相溶液+30%体积B相溶液。本发明对于色谱柱的选择，流动相试剂的选取以及样品的溶解方法方面，均做了详细的实验对比，最终为这类多肽在反相高效液相色谱分析中，能够轻松简便的得到对称性单峰，免去这类多肽因为消旋问题而无法进行反相高效液相分析定性的问题。
权利要求 :
1.一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，其特征是:包括如下步骤：
1）配比A相溶液：NaHCO3水溶液；NaHCO3水溶液浓度为：0.1mol/L；
2）配比B相溶液：甲醇+邻苯二甲酸的混合溶液；其中邻苯二甲酸浓度为0.1mol/L；
3）称取连续多个脯氨酸多肽，用70%体积A相溶液+30%体积B相溶液充分溶解完全，再用滤膜过滤，取滤液待用；
4）利用反相高效液相色谱法，对滤液进行检测，其检测条件是：色谱柱：AllsepTM阴离子色谱柱，
流动相：A相：NaHCO3水溶液，B相：甲醇+邻苯二甲酸的混合溶液，洗脱条件：时间min A B
0 80% 20%
20.00 60% 40%
25.00 80% 20%流速：0.7ml/min
波长：214nm。
2.根据权利要求1所述的一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，其特征是：所述NaHCO3水溶液pH值为8.3。
3.根据权利要求1所述的一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，其特征是：所述甲醇+邻苯二甲酸的混合溶液用三乙醇胺调节pH值为6.3。
4.根据权利要求1所述的一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，其特征是：所述的AllsepTM阴离子色谱柱的尺寸4.6×150mm，粒径：7μ m，孔径300 Å 。
说明书 :
一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，特别涉及一种特定色谱柱与非常规配比的流动相组合来检测该类多肽的方法。
背景技术
[0002] 脯氨酸(Proline，缩写为Pro 或P)，α-亚氨基酸，中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃时100g水中可溶162 g左右。与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物。一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形成4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关。植物体在干旱、高温、低温、盐渍等多种逆境下，常常有脯氨酸的明显积累。我们知道脯氨酸有三种形式DL-脯氨酸，L-脯氨酸、D-脯氨酸，通常所说的脯氨酸就是L-脯氨酸，天然存在的一种氨基酸，常温下本品为柱状晶体。加热下到215-220℃ 迅速分解，能溶于热水和乙醇，微具甜味，有吸湿性，在强酸或者碱性溶液中易发生消旋化。
[0003] 脯氨酸在植物，生物体内或者医药行业应用方面都很广泛，它的存在可以提高植物的抗寒性；在生物体内，脯氨酸又可起到对细胞质渗透平衡的调节作用；其次含有脯氨酸等的氨基酸类药是复方氨基酸大输液原料之一，用于营养不良、蛋白质缺乏症、严重胃肠道疾病，烫伤及外科手术后的蛋白质补充，无明显毒副作用。
[0004] 在常规的多肽研究当中，序列中涉及到含有脯氨酸的多肽有很多。一般含有少数的不连续的脯氨酸类多肽，在反相高效液相中的检测没有任何的影响，都会形成很好的对称性单峰。但是对于连续多个脯氨酸缩合反应形成的多肽，在反相高效液相中总是出现双峰（也就是我们常说的羊角峰），但是两峰都为正确的目标峰，研究发现主要是因为连续多个脯氨酸的多肽在酸性条件下极易发生消旋化，造成在常规的酸性体系反相高效液相分析条件下无法成对称性单峰。为了解决这一方面的技术问题，本发明针对连续多个脯氨酸多肽易发生消旋化的问题，提出来了使用特定的分析色谱柱AllsepTM阴离子色谱柱，加上两相流动相的选择均为弱碱性的混合配比，使这类多肽可以在反相高效液相色谱分析中得到很好的对称性单峰，以便确定这类产品的最终检测纯度。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱法检测连续多个脯氨酸多肽的方法，主要解决现有检测方法中连续多个脯氨酸多肽总是出现双峰（羊角峰）的问题，以致无法定性判断这类多肽最终检测纯度的技术问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 一种针对连续多个脯氨酸多肽的检测方法，包括如下步骤：
[0008] 1) 配比流动相A相：NaHCO3(0.1mol/L)水溶液，pH值为8.3；
[0009] 2）配比流动相B相：甲醇+邻苯二甲酸（0.1mol/L）的混合溶液，用三乙醇胺调节pH值为6.3；
[0010] 3）称取连续多个脯氨酸多肽，用混合溶液（70%体积A相溶液+30%体积B相溶液）超声溶解至完全，用滤膜过滤，取滤液待用；
[0011] 4）利用反相高效液相色谱法，对滤液进行检测，其检测条件是：
[0012] 色谱柱：AllsepTM阴离子色谱柱
[0013] 流动相：A相：H2O+NaHCO3(0.1mol/L)的混合溶液，pH值为8.3，B相：甲醇+邻苯二甲酸（0.1mol/L）的混合溶液，用三乙醇胺调节pH值为6.3；
[0014] 时间（min） A B
[0015] 0 80% 20%
[0016] 20.00 60% 40%
[0017] 30.00 80% 20%
[0018] 上述%是质量百分浓度，流速：0.7ml/min，波长：214nm。
[0019] 更为优选的方案是：所用色谱柱尺寸为：4.6×150mm（I.D），粒径：7um，孔径300A。
[0020] 本发明的有益效果是：解决了现有利用反相高效液相检测含有连续多个脯氨酸多肽方法的局限性。含有连续多个脯氨酸多肽在强酸性条件下极易发生消旋造成峰行异常，而本发明利用流动相两项均为弱碱性离子对试剂和AllsepTM阴离子色谱柱相结合的检测方法，不仅能解决含有连续多个脯氨酸多肽色谱峰形异常的缺点，而且也能准确的判断出这类多肽的实际纯度。此方法的建立为利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的含有连续多个脯氨酸多肽进行纯度的检测提供了更方便可靠的检测途径。
附图说明
[0021] 图1为普通硅胶填料色谱柱在TFA体系下的检测图。
[0022] 图2为普通硅胶填料色谱柱在两弱碱性离子对试剂的混合流动相体系下的检测图。
[0023] 图3为AllsepTM阴离子色谱柱在TFA体系下的检测图。
[0024] 图4为本发明AllsepTM阴离子色谱柱在两弱碱性离子对试剂的混合流动相体系下的检测图。
具体实施方式
[0025] （以多肽序列PPPPPPPPPPPP简称PP-12为例）
[0026] 实施例1
[0027] 1.样品处理：称取0.2mg的PP-12多肽，用0.3ml的超纯水超声溶解至完全，用0.45um的滤膜过滤，取滤液待用。
[0028] 2.色谱条件选择：
[0029] 1）仪器的选择：日本岛津液相色谱仪（型号：LC-20A，高压双泵，紫外检测器），岛津N2000工作站；
[0030] 2)色谱柱的选择：普通硅胶填料色谱柱C18，5um，120A，4.6×150mm（I.D）；
[0031] 3)流动相的选择：流动相：A相：质量百分浓度为0.1%TFA的水溶液，B相：质量百分浓度为0.1%TFA的乙腈溶液；
[0032] 4）检测梯度的选择：
[0033] 时间（min） A B
[0034] 0 85% 15%
[0035] 20.00 60% 40%
[0036] 30.00 85% 15%
[0037] 5）其他检测条件的选择：流速0.7ml/min，检测波长214nm。
[0038] 3.色谱分析：将过滤后的滤液取20ul进行线性梯度液相分析，得PP-12的色谱图（图1）。
[0039] 实施例2
[0040] 1.配比A相混合溶液：量取200ml超纯水，称取1.68gNaHCO3于200ml超纯水溶液中，充分搅拌溶解混合均匀，氦气脱气10min。
[0041] 2.配比B相混合溶液：量取200ml超甲醇，称取3.32g邻苯二甲酸于200ml甲醇溶液中，充分搅拌溶解混合均匀，再用浓度为98.5%的三乙醇胺调节pH值至6.3，氦气脱气5min。
[0042] 3.样品处理：称取0.2mg的PP-12多肽，用0.3ml的混合溶液（70%体积A相溶液+30%体积B相溶液）超声溶解至完全，用0.45um的滤膜过滤，取滤液待用。
[0043] 4.色谱条件选择：
[0044] 1）仪器的选择：日本岛津液相色谱仪（型号：LC-20A，高压双泵，紫外检测器），岛津N2000工作站。
[0045] 2)色谱柱的选择：普通硅胶填料色谱柱C4（C8），5um，300A，4.6×150mm（I.D）。
[0046] 3）检测梯度的选择：
[0047] 时间（min） A B
[0048] 0 88% 12%
[0049] 20.00 55% 45%
[0050] 30.00 88% 12%
[0051] 4）其他检测条件的选择：流速0.7ml/min，检测波长214nm。
[0052] 5.色谱分析：将过滤后的滤液取20ul进行线性梯度液相分析，得PP-12的色谱图（图2）。
[0053] 实施例3
[0054] 1.样品处理：称取0.2mg的PP-12多肽，用0.3ml的超纯水超声溶解至完全，用0.45um的滤膜过滤，取滤液待用。
[0055] 2.色谱条件选择：
[0056] 1）仪器的选择：日本岛津液相色谱仪（型号：LC-20A，高压双泵，紫外检测器），岛津N2000工作站。
[0057] 2)色谱柱的选择：AllsepTM阴离子色谱柱，7um，300A，4.6×150mm（I.D）。
[0058] 3)流动相的选择：流动相：A相：质量百分浓度为0.1%TFA的水溶液，B相：质量百分浓度为0.1%TFA的乙腈溶液。
[0059] 4）检测梯度的选择：
[0060] 时间（min） A B
[0061] 0 80% 20%
[0062] 20.00 55% 45%
[0063] 30.00 80% 20%
[0064] 5）其他检测条件的选择：流速0.7ml/min，检测波长214nm。
[0065] 3.色谱分析：将过滤后的滤液取20ul进行线性梯度液相分析，得PP-12的色谱图（图3）。
[0066] 实施例4
[0067] 1.配比A相混合溶液：量取200ml超纯水，称取1.68gNaHCO3于200ml超纯水溶液中，充分搅拌溶解混合均匀，氦气脱气10min。
[0068] 2.配比B相混合溶液：量取200ml超甲醇，称取3.32g邻苯二甲酸于200ml甲醇溶液中，充分搅拌溶解混合均匀，再用浓度为98.5%的三乙醇胺调节pH值至6.3，氦气脱气5min。3.样品处理：称取0.2mg的PP-12多肽，用0.3ml的混合溶液（70%体积A相溶液+30%体积B相溶液）超声溶解至完全，用0.45um的滤膜过滤，取滤液待用。
[0069] 4.色谱条件选择：
[0070] 1）仪器的选择：日本岛津液相色谱仪（型号：LC-20A，高压双泵，紫外检测器），岛津N2000工作站。
[0071] 2)色谱柱的选择：AllsepTM阴离子色谱柱，7um，300A，4.6×150mm（I.D）。
[0072] 3）检测梯度的选择：
[0073] 时间（min） A B
[0074] 0 80% 20%
[0075] 20.00 60% 40%
[0076] 30.00 80% 20%
[0077] 4）其他检测条件的选择：流速0.7ml/min，检测波长214nm。
[0078] 5.色谱分析：将过滤后的滤液取20ul进行线性梯度液相分析，得PP-12的色谱图（图4）。