固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法

摘要

本发明公开了一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D‑赤藓酮糖的方法，该方法包括以下步骤：扩增EDH、EuK、LDH、PPK、AP基因，连接质粒并转入细胞，诱导蛋白表达后将细胞破碎离心分离纯化后得到5种酶，将酶固定化；取相应的酶解底物，加入固定化混合酶，反应生成D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸，纯化后得到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸钠；将该底物与固定化磷酸水解酶AP反应，最终制得D‑赤藓酮糖。本发明方法利用丁醇糖氧化酶和羟基丙酮激酶的连续反应，实现了廉价的赤藻糖醇到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸的一次性完全转化，进而可以很方便地利用磷酸水解酶脱磷酸生成D‑赤藓酮糖。反应不会生成类似结构的产物，纯度和收率都得到了保证。

权利要求

1.一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）PCR扩增赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶、ATP再生酶、磷酸水解酶基因片段，然后连接到质粒上；再将质粒转入细胞中；

（2）将转入了质粒的细胞置于37oC、含100μM氨苄青霉素的LB液体培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达4小时以上，收集细胞；

（3）将步骤（2）收集的细胞破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵至终浓度为30-50% W/V，直至有蛋白固体析出；离心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶、ATP再生酶、磷酸水解酶液体酶；

（4）将赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶与ATP再生酶的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌24小时以上，酶固定在环氧树脂上，过滤出环氧树脂，用清水和缓冲液洗涤，最后在4oC干燥；磷酸水解酶依同样的步骤单独固定；

步骤（4）所述的缓冲液为100mM pH值6.5 - 9.0的磷酸钾溶液；

（5）在缓冲液中加入赤藻糖醇、丙酮酸钠、多聚磷酸、三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、氯化镁和氯化钾，调节pH 值到8.0，加入赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶与ATP再生酶的固定化混合酶，在25-40oC 轻微搅拌反应4小时以上，生成D-赤藓酮糖-4-磷酸；所述的缓冲液是pH值8.0的Tris.HCl溶液；

过滤反应液回收环氧树脂及其固定化酶，在滤液中加入草酸钡和两倍滤液体积的乙醇，用于沉淀D-赤藓酮糖-4-磷酸及磷酸腺苷；离心收集沉淀，溶解在pH值小于7的Tris缓冲液中，加入无水硫酸钠析出不溶性硫酸钡；过滤除去不溶性钡盐，并将滤液pH值上调到7.0，上样阴离子交换树脂柱，并以梯度碳酸氢氨水溶液洗脱，碳酸氢氨浓度从0逐渐升至1.0M，未含磷酸基团的有机杂质最先从交换柱中洗脱出来，之后，含单磷酸基团的D-赤藓酮糖-4-磷酸逐渐被洗脱出来，而含多个磷酸基团的ADP/ATP最后洗脱出；收集到的D-赤藓酮糖-4-磷酸最后经G25尺寸排阻柱除盐得到纯化的D-赤藓酮糖-4-磷酸钠；

（6）将D-赤藓酮糖-4-磷酸钠、氯化镁溶解在pH值7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入固定化磷酸水解酶，在25-40oC轻微搅拌反应2小时以上，然后过滤分离环氧树脂及其固定化酶；

滤液经过阴离子交换树酯柱层析，含磷酸化合物吸附在树脂上而D-赤藓酮糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脱盐得到纯化的D-赤藓酮糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的PCR扩增，是以大肠杆菌（Escherichia coli）、包皮垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis）或苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti ）的染色体为模板。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的质粒为pET23a。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的细胞为大肠杆菌BL21菌株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的终浓度为0.4-0.5 mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，是以梯度NaCl水溶液做洗脱液，浓度从0 逐渐提升到1.0 M。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述的纯化混合酶中，赤藻糖醇氧化酶、赤藓酮糖激酶、乳酸脱氢酶与ATP再生酶的活性单位比是1:2-3:1:2-3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）、（5）和（6）所述的G25尺寸排阻柱除盐，是以去离子水做洗脱液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述的Tris缓冲液，pH值为1.0。

说明书

固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及D-赤藓酮糖的制备方法，具体涉及一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法。

背景技术

[0002] D-赤藓酮糖(D-erythrulose)是一种四碳酮糖，分子式为C4H8O4，分子量为120，是存在于红浆果(常见于木莓)里一种呈黄色到红色的糖，由于该糖能与表皮死细胞膜表面蛋白氨基酸作用生成褐色色泽(brownish tint)，因而被广泛应用作安全、无毒的皮肤染料。

[0003] D-赤藓酮糖常与二羟基丙酮(Dihydroxyacetone)混合应用于皮肤着色，产品通常以DHA/E调和染色标注(如：Tanfastic、Veneto等产品)。赤藓酮糖色调与二羟基丙酮略有区别，能使皮肤颜色更红、更热情。然而其昂贵的价格一直严重制约其进一步推广应用(参考价格表)，因而开发一种方便的、能大量制备赤藓酮糖的方法以降低其成本变得非常重要。

[0004] 各种相关化合物价格表：

[0005]化合物名 CAS number 公司 价格($)
D-苏糖(D-threose) 95-43-2 Carbosynth 350/克
L-苏糖(L-threose) 95-44-3 Carbosynth 1000/克
D-赤藓糖(D-erythrose) 583-50-6 Carbosynth 55/克
L-赤藓糖(L-erythrose) 533-49-3 Carbosynth 420/克
赤藻糖醇(meso-erythritol) 149-32-6 Carbosynth 95/公斤
D-苏糖醇(D-threitol) 2418-52-2 Carbosynth 450/克
L-苏糖醇(L-threitol) 2319-57-5 Carbosynth 200/克
L-赤藓酮糖(L-erythrulose) 533-50-6 Carbosynth 1200/公斤
D-赤藓酮糖(D-erythrulose) 496-55-9 Carbosynth 2600/克

[0006] D-赤藓酮糖常规制备方法有分离法和化学合成法。由于自然界中D-赤藓酮糖产量非常低且该化合物极性大、水溶性高，分离纯化非常麻烦，所以无法放大生产。

[0007] 化学制备法主要包括以下两种方案，一是利用其便宜醇糖(赤藻糖醇)非选择性氧化、异构化然后进行分离纯化；但由于有多种类似化合物(如苏糖、赤藓糖以及L-赤藓酮糖)生成，收率及分离纯化效率都很低。另外一种是利用廉价的五糖/六糖(如核糖、葡萄糖等)进行逐级降解、纯化，其效率及纯度也很差。

发明内容

[0008] 为了克服化学方法制备D-赤藓酮糖的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0010] 一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法，包括以下步骤：

[0011] (1)PCR扩增EDH(赤藻糖醇氧化酶)、EuK(赤藓酮糖激酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、PPK(ATP再生酶)、AP(磷酸水解酶)基因片段，然后连接到质粒上；再将质粒转入细胞中；

[0012] 所述的PCR扩增，是以大肠杆菌(Escherichia  coli)、包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)或苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)的染色体为模板；

[0013] 所述的PCR扩增，所用的引物如SEQ.ID.NO.1-NO.10所示；

[0014] 所述的质粒优选pET23a，该质粒表达的酶活性较高；

[0015] 所述的细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株；

[0016] (2)将转入了质粒的细胞置于37℃、含100μM氨苄青霉素的LB液体培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后(OD 0.5-0.6)，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达4小时以上，收集细胞；

[0017] 所述IPTG的终浓度优选0.4-0.5mM；

[0018] (3)将步骤(2)收集的细胞破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵至终浓度为30-50％(W/V)，直至有蛋白固体析出；再次离心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，得到纯化的EDH、EuK、LDH、PPK、AP液体酶；

[0019] 所述的DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，是以梯度NaCl水溶液做洗脱液，浓度从0逐渐提升到1.0M；

[0020] (4)将EDH、EuK、LDH与PPK的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌24小时以上，酶固定在环氧树脂上，过滤出环氧树脂，用清水和缓冲液洗涤，最后在4℃干燥；AP依同样的步骤单独固定；

[0021] 步骤(4)中，每1000U纯化混合酶优选加入200克环氧树脂；

[0022] 所述的缓冲液优选100mM pH值6.5-9.0的磷酸钾溶液；

[0023] 所述的纯化混合酶中，EDH、EuK、LDH与PPK的活性单位比是1:(2-3):1:(2-3)；

[0024] 所述的环氧树脂优选LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司生产)；

[0025] (5)在缓冲液中加入赤藻糖醇、丙酮酸钠、多聚磷酸、三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、氯化镁和氯化钾，调节pH值到8.0，加入EDH、EuK、LDH与PPK的固定化混合酶，在25-40℃轻微搅拌反应4小时以上，生成D-赤藓酮糖-4-磷酸；氯化镁和氯化钾是EuK与ATP反应，PPK与多聚磷酸反应需要的，它们能结合活化ATP与多聚磷酸。

[0026] 过滤反应液回收环氧树脂及其固定化酶，在滤液中加入草酸钡和两倍滤液体积的乙醇，用于沉淀D-赤藓酮糖-4-磷酸及磷酸腺苷(ADP、ATP)；离心收集沉淀，溶解在pH值小于7的Tris缓冲液中，加入无水硫酸钠析出不溶性硫酸钡；过滤除去不溶性钡盐，并将滤液pH值上调到7.0，上样阴离子交换树脂柱，并以梯度碳酸氢氨水溶液洗脱，碳酸氢氨浓度从0逐渐升至1.0M，未含磷酸基团的有机杂质最先从交换柱中洗脱出来，之后，含单磷酸基团的D-赤藓酮糖-4-磷酸逐渐被洗脱出来，而含多个磷酸基团的ADP/ATP最后洗脱出；收集到的D-赤藓酮糖-4-磷酸最后经G25尺寸排阻柱除盐得到纯化的D-赤藓酮糖-4-磷酸钠；

[0027] 步骤(2)和(5)所述的G25尺寸排阻柱除盐，是以去离子水做洗脱液；

[0028] 所述的Tris缓冲液，pH值优选1.0；

[0029] 在该步骤中，在pH值为7.0时，含磷酸的有机钡盐不溶解，D-赤藓酮糖-4-磷酸钡也不溶解，此时的沉淀就是产物的钡盐及ATP/ADP的钡盐。但是该钡盐在酸性条件下可溶解，将D-赤藓酮糖-4-磷酸钡在酸性下溶解，然后加入当量的Na2SO4，会生成酸性下不溶的BaSO4，通过该方法可以有效将钡盐替换成钠盐。

[0030] (6)将D-赤藓酮糖-4-磷酸钠、氯化镁溶解在pH值7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入固定化磷酸水解酶AP，在25-40℃轻微搅拌反应2小时以上，然后过滤分离环氧树脂及其固定化酶；滤液经过阴离子交换树酯柱层析，含磷酸化合物吸附在树脂上而D-赤藓酮糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脱盐得到纯化的D-赤藓酮糖；

[0031] 步骤(5)和(6)所述的阴离子交换树脂优选D201阴离子交换树脂。

[0032] 在本发明中，丁醇糖氧化酶(EDH,EC 1.1.1.-)能利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)将赤藻糖醇选择性氧化成D-赤藓酮糖，但该反应是趋向于糖醇原料的可逆反应，只有很少量的(<10％)的酮糖产物生成。而羟基丙酮激酶(EuK,EC 2.7.1.209)则可以利用三磷酸腺苷(ATP)将D-赤藓酮糖完全磷酸化成D-赤藓酮糖-4-磷酸。结合利用以上两种酶在同一体系的催化就能实现廉价赤藻糖醇到D-赤藓酮糖-4-磷酸的一次性完全转化，进而可以很方便地利用磷酸水解酶(AP,EC 3.6.1.66)脱磷酸生成D-赤藓酮糖。

[0033] 由于该连续转化涉及价格昂贵的辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与三磷酸腺苷(ATP)，因此乳酸脱氢酶(LDH,EC 1.1.1.28)与丙酮酸，ATP再生酶(PPK,EC 2.7.4.1)与多聚磷酸分别被应用在该反应体系里实时循环再生两种辅酶，大大降低辅酶用量。

[0034] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0035] 1、本发明方法利用丁醇糖氧化酶和羟基丙酮激酶的连续反应，实现了廉价的赤藻糖醇到D-赤藓酮糖-4-磷酸的一次性完全转化，进而可以很方便地利用磷酸水解酶脱磷酸生成D-赤藓酮糖。反应不会生成类似结构的产物，纯度和收率都得到了保证。

[0036] 2、本发明方法还将乳酸脱氢酶与丙酮酸、ATP再生酶与多聚磷酸应用在反应体系中，实时循环再生两种辅酶(NAD+和ATP)，大大降低辅酶用量，节约了成本。

[0037] 3、本发明将用到的酶进行固定化，显著提高酶稳定性、规模化工业可操作性以及整个生产的绿色指数，提高了酶的回收利用率。

附图说明

[0038] 图1是EDH、Euk、LDH、AP、PPK基因片段电泳图。

[0039] 图2是EDH、Euk、LDH、AP、PPK纯化蛋白电泳图。

[0040] 图3是D-赤藓酮糖-4-磷酸在600M瓦里安D2O溶液中的1H-NMR谱图。

[0041] 图4是D-赤藓酮糖-4-磷酸在600M瓦里安D2O溶液中的13C-NMR谱图。

[0042] 图5是D-赤藓酮糖-4-磷酸在600M瓦里安D2O溶液中的质谱图。

[0043] 图6是D-赤藓酮糖在600M瓦里安D2O溶液中的1H-NMR谱图。

[0044] 图7是D-赤藓酮糖在600M瓦里安D2O溶液中的13C-NMR谱图。

具体实施方式

[0045] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0046] 实施例

[0047] 一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法，包括以下步骤：

[0048] (1)发酵生产赤藻糖醇氧化酶(EDH)、赤藓酮糖激酶(EuK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)：

[0049] 以提取的大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)菌株(购于通用生物)gDNA、ATCC购买的包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700084)与苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti Strain 1021)染色体为模板，上述引物PCR扩增出EDH、EuK、LDH、PPK以及AP基因片段(见图1)，然后通过相应酶切、酶连接到pET23a质粒上(购于生物风)。

[0050] 基因的序列扩增引物：

[0051] EDH正向引物:5’-gtcgaaaggtatttcatatgtccaatcaag-3’(SEQ.ID.NO.1)；

[0052] EDH反向引物:5’-ctcggctcatcacagaagctttcgctatgc-3’(SEQ.ID.NO.2)；

[0053] EuK正向引物:5’-gaaggacggacatatgacgtacctcctgaac-3’(SEQ.ID.NO.3)；

[0054] EuK反向引物:5’-gtcggtcgggcctcgagccgggtgaggtgc-3’(SEQ.ID.NO.4)；

[0055] LDH正向引物:5’-catcactggagaaagtcatatgaaactcg-3’(SEQ.ID.NO.5)；

[0056] LDH反向引物:5’-gaatgcaggggagcctcgagattaaaccag-3’(SEQ.ID.NO.6)；

[0057] PPK正向引物:5’-gagcgggaggaagcatatggcactcgacg-3’(SEQ.ID.NO.7)；

[0058] PPK反向引物:5’-ctgatcgtcagctcgagggaatcacctgag-3’(SEQ.ID.NO.8)；

[0059] AP正向引物:5’-catggagaaaatcatatgaaacaaagcac-3’(SEQ.ID.NO.9)；

[0060] AP反向引物:5’-aattcactgccgggctcgagtttatttcagc-3’(SEQ.ID.NO.10)；

[0061] 通过测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株(通用生物)，在37℃、4ml含100μM氨苄青霉素的LB培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后(OD 0.5-0.6)加入
0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达4小时，最后收集破碎细胞、高速离心，上清液利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达(见图
2)。

[0062] 正确的种子培养基也可以逐级接入到5L培养发酵罐里生长至对数期后用0.5mM IPTG诱导表达6小时，收集湿细胞50g。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

[0063] (2)酶的纯化及固定：

[0064] 上述收集的含赤藻糖醇氧化酶(EDH)、赤藓酮糖激酶(EuK)、ATP再生酶(PPK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及磷酸水解酶(AP)的细胞通过高压破碎、高速离心上清液逐量加入硫酸铵固体直至析出(30-50％W/V硫酸铵溶液)。

[0065] 该酶固体通过离心收集后缓慢溶解到25mM pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化EDH、EuK、LDH、PPK、AP液体酶。

[0066] 所述的G25尺寸排阻柱除盐，是以去离子水做洗脱液；

[0067] 所述的DEAE Seplite FF阴离子交换柱分离，是以梯度NaCl水溶液做洗脱液，浓度从0逐渐提升到1.0M；

[0068] 酶EDH、EuK、LDH与PPK利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照活性单位1:2:1:2及以下方法进行一次性混合固定化：1000U纯化混合酶溶解在1L 100mM pH值8.0的磷酸钾溶液中，随后加入200克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌24小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及100mM pH值8.0磷酸缓冲液各洗涤两次后低温干燥待用。固定化混合酶(EDH、EuK、LDH、PPK)分别具有对应液体酶的20-60％的活性。

[0069] 磷酸水解酶则利用上述同样的方法进行单独固定化，其固定化AP酶具有液体酶的80％的活性。

[0070] (3)利用混合固定化酶(EDH、EuK、LDH、PPK)以及赤藻糖醇为原料制备D-赤藓酮糖-4-磷酸：

[0071] 在1L 25mM pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入9.2克赤藻糖醇(75mM)，8.8克丙酮酸钠(80mM)、2.2克三磷酸腺苷二钠盐ATP(4mM)、0.69克烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐(1mM)、10.3克多聚磷酸(Sigma,25聚,100mM单磷酸)、2.8克氯化镁(30mM)、1.5克氯化钾(20mM)；待pH值调节到8.0后，2000U固定化混合酶(EDH、EuK、LDH、PPK)一次性加入混合体系，待反应在30℃轻微搅拌4小时后取溶液检测残余赤藻糖醇(其氧化酶与NAD+检测UV 340nm吸收变化)，结果表明反应完全。(活性单位U代表30℃每分钟转化1μM底物所需要的酶量)

[0072] 过滤反应液回收利用固定化酶，在滤液中加入19.1克草酸钡(75mmol)并与两倍体积的乙醇混合沉淀D-赤藓酮糖-4-磷酸及磷酸腺苷(AMP，ADP及ATP)。离心收集的沉淀固体缓慢溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，加入10.6克无水硫酸钠(75mmol)析出不溶性硫酸钡；过滤除去钡盐并将上清液pH值上调到7.0后，然后直接上样D201阴离子树酯交换柱(晶祥化工)，梯度碳酸氢氨水溶液洗脱分离除掉磷酸腺苷杂质并得到纯D-赤藓酮糖-4-磷酸。最后G25尺寸排阻柱脱盐得到13.6克D-赤藓酮糖-4-磷酸钠淡黄色泡沫，收率达82％(核磁及质谱图见图3-图5)。固定化酶回收10次后保留90％原始活性。

[0073] (4)以D-赤藓酮糖-4-磷酸为原料，利用固定化磷酸水解酶(AP)水解生成D-赤藓酮糖：

[0074] 将10克D-赤藓酮糖-4-磷酸钠(45mM)、77mg氯化镁(2mM)溶解在400毫升25mM pH值7.0的Tris.HCl溶液中，然后加入500U固定化磷酸水解酶AP进行反应，该混合溶液在30℃缓慢搅拌2个小时后直接过滤分离固定化酶。反应液流过D201阴离子树酯交换柱，含磷酸化合物吸附在树脂上而D-赤藓酮糖直接流出，最后用G25尺寸排阻柱脱盐得到3.8克白色泡沫(最终收率71％，核磁谱图见图6-图7)。固定化磷酸水解酶(AP)回收利用12后保留80％的初始活性。

[0075] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。