一种黄酮类化合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201811459359.X
文献号 : CN109265503B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 高雪梅 , 朱鸿 , 王闪闪 , 张再 , 崔笛
申请人 : 云南民族大学
摘要 :
本发明公开了一种黄酮类化合物及其制备方法和应用，所述的黄酮类化合物分子式为C24H24O10，该化合物命名为kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]，具有下述结构式：所述黄酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而得到。所述的应用为黄酮类化合物在神经氨酸酶抑制活性中的应用。经神经氨酸酶抑制活性实验，选用奥司他韦羧酸盐作为对照，kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]对神经氨酸酶的IC50值为187.40μmol/L，其具有较好的神经氨酸酶抑制活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗流感病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
权利要求 :
1.一种黄酮类化合物，其特征在于所述的黄酮类化合物是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为 C24H24O10，命名为 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]，具有下述结构式：。
2. 一种权利要求 1 所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实粗粉碎到 20 40 目，用有机溶剂~
超声提取 2 4 次，每次 30 60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ ~ ~
1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1 2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取 ~
3 5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
~
C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5 3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 0.8~ ~
1.2 倍的 100 200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200 300 目，用量为浸膏 ~ ~
b 重量 6 8 倍量；用体积比为 1:0 0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓~ ~
缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将以 4:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C‑18、C‑8 或 ODS 装柱；用体积含量为 20 100% 的甲醇水溶液进行梯度~
洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将以体积含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液~
相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] ；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 30 50% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，~
21.2 ×250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样
20 50μL，收集 10 30min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物~ ~
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] 。
3.根据权利要求 2 所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征是： A步骤所述的有机溶剂为 80 100% 的丙酮、乙醇或甲醇。
~
4. 根据权利要求 2 所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征是： B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯。
5.根据权利要求 2 所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征是在于C步骤所述的混合有机溶剂为二氯甲烷‑甲醇、二氯甲烷‑乙酸乙酯、石油醚‑丙酮或石油醚‑乙酸乙酯。
6.根据权利要求 2 所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。
7.一种权利要求 1 所述的黄酮类化合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
说明书 :
一种黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种黄酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 豆科苏木亚科决明属(Cassia L.)植物全世界共有600 多种，广泛分布于地球的热带及亚热带地区，尤以热带美洲及热带非洲甚多。我国有25 种，广布于南部各省区，所有
种在云南都有分布。决明属植物的主要化学成分为三萜、蒽醌、甾体、生物碱、黄酮、二苯乙
烯等类型；这些化合物表现出抗癌、抗HIV 病毒、抗肝炎、杀虫、抗焦虑及镇静等多种活性。
近几年来国内研究者从决明属傣药植物中发现的活性新化合物有：具有抗疟疾活性的生物
碱；色原酮类化合物；具有抗HIV‑1 活性的环阿尔廷三萜和皂甙、蒽醌和木脂素；口山酮类
化合物和聚酮类化合物；以及具有抗烟草花叶病毒和抗HIV‑1 活性的色原酮、异噢哢和黄
酮类化合物。为了更有效地利用我国苏木亚科植物资源，从中寻找具有开发前景的活性成
分，我们选择对苏木亚科植物开展较系统的活性成分研究工作。
种在云南都有分布。决明属植物的主要化学成分为三萜、蒽醌、甾体、生物碱、黄酮、二苯乙
烯等类型；这些化合物表现出抗癌、抗HIV 病毒、抗肝炎、杀虫、抗焦虑及镇静等多种活性。
近几年来国内研究者从决明属傣药植物中发现的活性新化合物有：具有抗疟疾活性的生物
碱；色原酮类化合物；具有抗HIV‑1 活性的环阿尔廷三萜和皂甙、蒽醌和木脂素；口山酮类
化合物和聚酮类化合物；以及具有抗烟草花叶病毒和抗HIV‑1 活性的色原酮、异噢哢和黄
酮类化合物。为了更有效地利用我国苏木亚科植物资源，从中寻找具有开发前景的活性成
分，我们选择对苏木亚科植物开展较系统的活性成分研究工作。
[0003] 流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，每年影响全球数百万人的生命健康，从而在一定程度上造成比较严重的经济和社会问题。但是截至目前，人类现有的
医疗水平对流感病毒始终缺乏安全有效的控制方法。神经氨酸酶是甲型和乙型流感病毒生
命周期中的关键酶，它也是抗流感病毒药物研制中的理想靶点。神经氨酸酶抑制剂类抗流
感病毒药物，不易产生抗药性且具有良好的耐受性，对甲型和乙型流感病毒均有抑制作用，
研究高效、低毒的神经氨酸酶抑制剂对于临床治疗具有重大的意义，且具有广阔的市场前
景。
医疗水平对流感病毒始终缺乏安全有效的控制方法。神经氨酸酶是甲型和乙型流感病毒生
命周期中的关键酶，它也是抗流感病毒药物研制中的理想靶点。神经氨酸酶抑制剂类抗流
感病毒药物，不易产生抗药性且具有良好的耐受性，对甲型和乙型流感病毒均有抑制作用，
研究高效、低毒的神经氨酸酶抑制剂对于临床治疗具有重大的意义，且具有广阔的市场前
景。
[0004] 本发明从豆科植物中分离得到一个新的黄酮化合物，该化合物具有较好的神经氨酸酶抑制活性。
发明内容
[0005] 本发明的第一目的是提供一种黄酮类化合物；第二目的在于提供所述黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述黄酮类化合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
[0006] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得
到的，该化合物分子式为 C24H24O10，该化合物命名为kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]，具有下述结构式：
到的，该化合物分子式为 C24H24O10，该化合物命名为kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]，具有下述结构式：
[0007]
[0008] 本发明的第二目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液
相色谱分离获得，具体为：
相色谱分离获得，具体为：
[0009] A、浸膏提取：将豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实粗粉碎到 20 40 目，用有机~
溶剂超声提取 2 4 次，每次 30 60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4
~ ~
1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
~
溶剂超声提取 2 4 次，每次 30 60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4
~ ~
1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏 a ；
~
[0010] B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1 2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂~
萃取 3 5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
~
萃取 3 5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏 b；
~
[0011] C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5 3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 ~
0.8 1.2 倍的 100 200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200 300 目，用量为
~ ~ ~
浸膏 b 重量 6 8 倍量；用体积比为 1:0 0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
~ ~
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
0.8 1.2 倍的 100 200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200 300 目，用量为
~ ~ ~
浸膏 b 重量 6 8 倍量；用体积比为 1:0 0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
~ ~
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
[0012] D、反相柱层析：将以 4:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C‑18、C‑8 或 ODS 装柱；用体积含量为 20 100% 的甲醇水溶液进行
~
梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
~
梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
[0013] E、高效液相色谱分离：将以体积含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高~
效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]；
效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]；
[0014] F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 30 50% 的甲醇为流动相，流速 3ml/~
min，21.2× 250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进
样 20 50μL，收集 10 30min 的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的黄酮类化合物
~ ~
kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑ rhamnopyranoside]。
min，21.2× 250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进
样 20 50μL，收集 10 30min 的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的黄酮类化合物
~ ~
kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑ rhamnopyranoside]。
[0015] 本发明黄酮类化合物是首次被分离出来的，以上述方法制备的黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的，并表征其具体结构为：
[0016]
[0017] 本发明化合物为淡黄色无定形粉末；紫外光谱（溶剂为甲醇），λma（x log ε）：345 (3.76), 265 (3.91) nm；红外光谱（溴化钾压片）νmax 3425, 1656, 1609, 1507, 1450,
–1
1361, 1176, 1086, 839 cm ；HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 472.4369 [M
+ 13 1
] ，（计算值472.4404），结合 C（CD3OD, 100 MHz）和H NMR (CD3OD, 400 MHz)谱（图1和图
2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C24H24O10。
–1
1361, 1176, 1086, 839 cm ；HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 472.4369 [M
+ 13 1
] ，（计算值472.4404），结合 C（CD3OD, 100 MHz）和H NMR (CD3OD, 400 MHz)谱（图1和图
2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C24H24O10。
[0018] HRESIMS 显示其准分子离子峰为m/z472.4369 [M]+（计算值472.4404），结合13C ‑1
NMR谱确定分子式为 C24H24O10，不饱和度为13。红外光谱显示该化合物含羟基（3425 cm ）、
‑1 ‑1 ‑1
羰基（1656 cm ）及苯基（1609 cm 和 1507 cm ）等官能团。根据其紫外光谱在 265、345
1 13
nm 有最大吸收, 推测该化合物为黄酮类化合物，该化合物的 H‑和 C‑NMR 数据归属，见表
1。在黄酮的 A 环处存在两处耦合信号 [δH 6.33 (1H, s, H‑8) 和 6.15 (1H, s, H‑6)]
以及由 H‑2′ / H‑6′和 H‑3′ / H‑5′的对称性推导出 B 环 [δH 7.75 (2H, d, J = 8.0
Hz, H‑2′, 6′) 和 6.88 (2H, d, J = 8.0 Hz, H‑3′, 5′)] 为一个苯环 A2X2自旋系统,
此外，通过化学位移为 5.66 (1H, s, H‑1′′) 和 0.73 (3H, d, J = 4.0 Hz, H‑9′′) 的
质子信号以及HMBC谱（图1）中，δ5.66（H‑1′′）的糖端基氢信号与δ135.5（C‑3）的碳信号相
13
关，提示黄酮3位连有一个α‑鼠李吡喃糖。该化合物的 C NMR 谱（表 1）显示存在 24 个碳
信号（其中两组为对称碳，δC 132.1和δC 116.7 处的 C‑2' / C‑6' 和 C‑3' / C‑5'）， 24
个碳信号包括 15 个黄酮骨架上的碳，鼠李吡喃糖上的 6 个碳和二氧异丙基上的 3 个碳
[δC 110.5 (s, C‑6′′), 26.7 (q, C‑7′′), 28.5 (q, C‑8′′)。通过查阅文献，对比相关数
据，发现该化合物与已知化合物 kaempferol‑3‑O‑a‑L‑rhamnopyranoside 最为相似，其不
1
同在于鼠李吡喃糖的化学位移变化以及额外的二氧异丙基信号。在H NMR 光谱中，H‑5′′
的化学位移从 3.99 升高到 4.47 (△ + 0.48 ppm) 和 H‑4′′的化学位移从 3.52 升高
1
到 3.90 (△ + 0.38 ppm)。C NMR 谱中，C‑1′′的化学位移从 102.3 降低至 99.8 (△ ‑
2.5 ppm) 和 C‑3′′的化学位移从 71.6 升到 74.8 (△ + 3.2 ppm)，C‑4′′化学位移从
71.1 升高到 79.6 (△ + 8.5 ppm) 以及 C‑5′′化学位移从 70.8 升高为 77.3 (△ +
6.5 ppm)；在HMBC谱（图1）中，δ3.90（H‑4′′），δ4.47（H‑5′′），δ1.33（H‑7′′），δ1.40（H‑8′′）
的氢信号与δ110.5（C‑6′′）的碳信号有相关，提示鼠李吡喃糖的 4″和 5″位连有一个二氧
异丙叉基。综上所述可推断化合物的结构，确定化合物为 kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑ rhamnopyranoside] 。
NMR谱确定分子式为 C24H24O10，不饱和度为13。红外光谱显示该化合物含羟基（3425 cm ）、
‑1 ‑1 ‑1
羰基（1656 cm ）及苯基（1609 cm 和 1507 cm ）等官能团。根据其紫外光谱在 265、345
1 13
nm 有最大吸收, 推测该化合物为黄酮类化合物，该化合物的 H‑和 C‑NMR 数据归属，见表
1。在黄酮的 A 环处存在两处耦合信号 [δH 6.33 (1H, s, H‑8) 和 6.15 (1H, s, H‑6)]
以及由 H‑2′ / H‑6′和 H‑3′ / H‑5′的对称性推导出 B 环 [δH 7.75 (2H, d, J = 8.0
Hz, H‑2′, 6′) 和 6.88 (2H, d, J = 8.0 Hz, H‑3′, 5′)] 为一个苯环 A2X2自旋系统,
此外，通过化学位移为 5.66 (1H, s, H‑1′′) 和 0.73 (3H, d, J = 4.0 Hz, H‑9′′) 的
质子信号以及HMBC谱（图1）中，δ5.66（H‑1′′）的糖端基氢信号与δ135.5（C‑3）的碳信号相
13
关，提示黄酮3位连有一个α‑鼠李吡喃糖。该化合物的 C NMR 谱（表 1）显示存在 24 个碳
信号（其中两组为对称碳，δC 132.1和δC 116.7 处的 C‑2' / C‑6' 和 C‑3' / C‑5'）， 24
个碳信号包括 15 个黄酮骨架上的碳，鼠李吡喃糖上的 6 个碳和二氧异丙基上的 3 个碳
[δC 110.5 (s, C‑6′′), 26.7 (q, C‑7′′), 28.5 (q, C‑8′′)。通过查阅文献，对比相关数
据，发现该化合物与已知化合物 kaempferol‑3‑O‑a‑L‑rhamnopyranoside 最为相似，其不
1
同在于鼠李吡喃糖的化学位移变化以及额外的二氧异丙基信号。在H NMR 光谱中，H‑5′′
的化学位移从 3.99 升高到 4.47 (△ + 0.48 ppm) 和 H‑4′′的化学位移从 3.52 升高
1
到 3.90 (△ + 0.38 ppm)。C NMR 谱中，C‑1′′的化学位移从 102.3 降低至 99.8 (△ ‑
2.5 ppm) 和 C‑3′′的化学位移从 71.6 升到 74.8 (△ + 3.2 ppm)，C‑4′′化学位移从
71.1 升高到 79.6 (△ + 8.5 ppm) 以及 C‑5′′化学位移从 70.8 升高为 77.3 (△ +
6.5 ppm)；在HMBC谱（图1）中，δ3.90（H‑4′′），δ4.47（H‑5′′），δ1.33（H‑7′′），δ1.40（H‑8′′）
的氢信号与δ110.5（C‑6′′）的碳信号有相关，提示鼠李吡喃糖的 4″和 5″位连有一个二氧
异丙叉基。综上所述可推断化合物的结构，确定化合物为 kaempferol‑3‑O‑[(4′′,5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑ rhamnopyranoside] 。
[0019] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物在制备抗流感病毒药物中的应用。经神经氨酸酶抑制活性实验，选用奥司他韦羧酸盐作为对照，kaempferol‑3‑O‑
[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]对神经氨酸酶的 IC50值为
187.40 μmol/L，其具有较好的神经氨酸酶抑制活性。本发明化合物结构简单活性好，可作
为抗流感病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]对神经氨酸酶的 IC50值为
187.40 μmol/L，其具有较好的神经氨酸酶抑制活性。本发明化合物结构简单活性好，可作
为抗流感病毒药物的先导性化合物，有良好的应用前景。
附图说明
[0020] 图1为化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑13
rhamnopyranosi de]的核磁共振碳谱（ C NMR）；
rhamnopyranosi de]的核磁共振碳谱（ C NMR）；
[0021] 图2为化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑1
rhamnopyranosi de]的核磁共振氢谱（H NMR）；
rhamnopyranosi de]的核磁共振氢谱（H NMR）；
[0022] 图3为化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranosi de]的主要HMBC（→）相关。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0024] 本发明所述的黄酮类化合物是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为
C24H24O10，命名为kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑ a‑L‑
rhamnopyranoside]，具有下述结构式：
C24H24O10，命名为kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑ a‑L‑
rhamnopyranoside]，具有下述结构式：
[0025]
[0026] 本发明的第二目的是这样实现的，所述的黄酮类化合物的制备方法，是以干燥豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液
相色谱分离获得，具体为：
相色谱分离获得，具体为：
[0027] A、浸膏提取：将豆科决明属乔木植物枝条、叶或果实粗粉碎到 20 40 目，用有机~
溶剂超声提取 2 4 次，每次 30 60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4
~ ~
1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
~
溶剂超声提取 2 4 次，每次 30 60 min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4
~ ~
1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
~
[0028] B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比 1 2 倍量的水，用与水等体积的有机溶剂~
萃取 3 5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
~
萃取 3 5 次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
~
[0029] C、硅胶柱层析：将浸膏 b 用重量比 1.5 3 倍量的有机溶剂溶解，然后用浸膏重 ~
0.8 1.2 倍的 100 200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200 300 目，用量为
~ ~ ~
浸膏 b 重量 6 8 倍量；用体积比为 1:0 0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
~ ~
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
0.8 1.2 倍的 100 200 目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200 300 目，用量为
~ ~ ~
浸膏 b 重量 6 8 倍量；用体积比为 1:0 0:1 的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
~ ~
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
[0030] D、反相柱层析：将以 4:1 配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料 C‑18、C‑8 或 ODS 装柱；用体积含量为 20 100% 的甲醇水溶液进行
~
梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
~
梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；
[0031] E、高效液相色谱分离：将以体积含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高~
效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] ；
效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑
isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] ；
[0032] F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以 30 50% 的甲醇为流动相，流速 3ml/~
min，21.2 × 250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次
进样 20 50μL，收集 10 30min 的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的黄酮类化合物
~ ~
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] 。
min，21.2 × 250 mm，5μm 的反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次
进样 20 50μL，收集 10 30min 的色谱峰，多次累加后蒸干。即得所述的黄酮类化合物
~ ~
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑ isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] 。
[0033] 本发明所述的黄酮类化合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
[0034] 本发明所述的豆科植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。
[0035] 实施例 1
[0036] 取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 12kg，粗粉碎至 20 目，用 90% 的乙醇水超声提取 4 次，每次 30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/4；静置，滤除
沉淀物，浓缩成 2767g 浸膏a；在浸膏 a 中加入2760g 水，用与水等体积的氯仿萃取 5
次，合并萃取相，减压浓缩成 1430g 浸膏 b；用 200 目硅胶 14000g 装柱，在浸膏 b 中加
入 1000g 的甲醇溶解，然后加入 100 目硅胶 1400g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为
1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的二氯甲烷‑甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集
梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分，得到 9 个部分，体积比 9:1 的二氯甲
烷‑甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c 为 25g；用反相材料 C‑18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，
以体积含量为 20 100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC
~
监测，合并相同的部分；取以体积含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以40% 的
~
甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱
为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 50 μL，收集 19 min 的色谱峰，多次
累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑
a‑L‑rhamnopyranoside]。
沉淀物，浓缩成 2767g 浸膏a；在浸膏 a 中加入2760g 水，用与水等体积的氯仿萃取 5
次，合并萃取相，减压浓缩成 1430g 浸膏 b；用 200 目硅胶 14000g 装柱，在浸膏 b 中加
入 1000g 的甲醇溶解，然后加入 100 目硅胶 1400g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为
1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的二氯甲烷‑甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集
梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分，得到 9 个部分，体积比 9:1 的二氯甲
烷‑甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c 为 25g；用反相材料 C‑18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，
以体积含量为 20 100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC
~
监测，合并相同的部分；取以体积含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以40% 的
~
甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱
为固定相，紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 50 μL，收集 19 min 的色谱峰，多次
累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑
a‑L‑rhamnopyranoside]。
[0037] 实施例 2
[0038] 取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 4.8kg，粗粉碎至 20 目，用 100%的乙醇超声提取 3 次，每次 30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/3；静置，滤除沉
淀物，浓缩成 560g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 560g 的水，用与水等体积的氯仿萃取 3
次，合并萃取相，减压浓缩成 320g 浸膏 b；用 200‑300 目硅胶 4000g 装柱，在浸膏 b 中
加入 340g 的乙酸乙酯溶解，然后加入 100 目硅胶 320g拌样，拌样后上柱；用体积比分别
为 20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2、0:1 的二氯甲烷‑乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，
收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比6:4 的二氯甲烷‑乙酸乙酯
混合有机溶剂的洗脱液 c 为 16g；用反相材料 C‑18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含
量为 20 100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并
~
相同的部分；取以体积含量 30 60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 35% 的甲醇为流
~
动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，
紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 30μL，收集 26min 的色谱峰，多次累加后蒸干，
即得所述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
淀物，浓缩成 560g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 560g 的水，用与水等体积的氯仿萃取 3
次，合并萃取相，减压浓缩成 320g 浸膏 b；用 200‑300 目硅胶 4000g 装柱，在浸膏 b 中
加入 340g 的乙酸乙酯溶解，然后加入 100 目硅胶 320g拌样，拌样后上柱；用体积比分别
为 20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2、0:1 的二氯甲烷‑乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，
收集梯度洗脱液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比6:4 的二氯甲烷‑乙酸乙酯
混合有机溶剂的洗脱液 c 为 16g；用反相材料 C‑18 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含
量为 20 100% 的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并
~
相同的部分；取以体积含量 30 60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 35% 的甲醇为流
~
动相，流速 3ml/min，22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，
紫外检测器检测波长为 254 nm，每次进样 30μL，收集 26min 的色谱峰，多次累加后蒸干，
即得所述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
[0039] 实施例 3
[0040] 取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 6.5kg，粗粉碎至 30 目，用 80%的甲醇超声提取 4 次，每次 30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/2；静置，滤除沉
淀物，浓缩成 675g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 700g 的水，用与水等体积的乙醚萃取 4
次，合并萃取相，减压浓缩成 342g 浸膏 b；用 180 目硅胶 2800g 装柱，在浸膏 b 中加入
930g 的丙酮溶解，然后加入 90 目硅胶 360g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、
20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿‑丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 3:2 的氯仿‑丙酮混合有机溶剂的洗脱液
c 为 45g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇水
~
溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含
量 40 60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 45% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22
~
×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为
254nm，每次进样 50μL，收集 13min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
淀物，浓缩成 675g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 700g 的水，用与水等体积的乙醚萃取 4
次，合并萃取相，减压浓缩成 342g 浸膏 b；用 180 目硅胶 2800g 装柱，在浸膏 b 中加入
930g 的丙酮溶解，然后加入 90 目硅胶 360g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、
20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿‑丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱
液、浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 3:2 的氯仿‑丙酮混合有机溶剂的洗脱液
c 为 45g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇水
~
溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含
量 40 60% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 45% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22
~
×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为
254nm，每次进样 50μL，收集 13min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
[0041] 实施例 4
[0042] 取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 5.9kg，粗粉碎至 40 目，用 90%的乙醇提取 3 次，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成
810g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 880g 的水，用与水等体积的石油醚萃取 4 次，合并萃取
相，减压浓缩成 265g 浸膏 b；用 160 目硅胶 1450g 装柱，在浸膏 b 中加入 290g 的甲
醇溶解，然后加入 80 目硅胶 265g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、20:1、9:1、8:
2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的石油醚‑乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓
缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 1:2 的石油醚‑乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱
液 c 为 52g；用反相材料 C‑8 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇
~
水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积
含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 43% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，
~
22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长
为 254nm，收集 16min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
810g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 880g 的水，用与水等体积的石油醚萃取 4 次，合并萃取
相，减压浓缩成 265g 浸膏 b；用 160 目硅胶 1450g 装柱，在浸膏 b 中加入 290g 的甲
醇溶解，然后加入 80 目硅胶 265g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、20:1、9:1、8:
2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1 的石油醚‑乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓
缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 1:2 的石油醚‑乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱
液 c 为 52g；用反相材料 C‑8 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇
~
水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积
含量 30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 43% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，
~
22×250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长
为 254nm，收集 16min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
[0043] 实施例 5
[0044] 取干燥的豆科乔木枝条、叶和/或果实 5.6 kg，粗粉碎至 20 目，用 70%的甲醇超声提取 4 次，每次 35min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的 1/2；静置，滤除沉
淀物，浓缩成 700g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 1400g 的水，用与水等体积的苯萃取 5 次，
合并萃取相，减压浓缩成 310g 浸膏 b；用 200 目硅胶 1860g 装柱，在浸膏 b 中加入
420g 的甲醇溶解，然后加入 100 目硅胶 310g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、
20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿‑甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、
浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 8:2 的氯仿‑甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c
为 56g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇水溶
~
液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量
30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 370% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×
~
250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为
254nm，收集 22min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑
O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
淀物，浓缩成 700g 浸膏 a；在浸膏 a 中加入 1400g 的水，用与水等体积的苯萃取 5 次，
合并萃取相，减压浓缩成 310g 浸膏 b；用 200 目硅胶 1860g 装柱，在浸膏 b 中加入
420g 的甲醇溶解，然后加入 100 目硅胶 310g 拌样，拌样后上柱；用体积比分别为 1:0、
20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1 的氯仿‑甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、
浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；体积比 8:2 的氯仿‑甲醇混合有机溶剂的洗脱液 c
为 56g；用反相材料 ODS 装柱，洗脱液 c 上反相柱，以体积含量为 20 100% 的甲醇水溶
~
液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经 TLC 监测，合并相同的部分；取以体积含量
30 50% 甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以 370% 的甲醇为流动相，流速 3ml/min，22×
~
250 mm，5μm 的 Agilent Zorbax SB‑C18 反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为
254nm，收集 22min 的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑
O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
[0045] 实施例 6
[0046] 取实施例 1 制备的化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]，为淡黄色无定形粉末；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术
鉴定结构。
鉴定结构。
[0047] （1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λma（x logε）：345 (3.76), 265 (3.91)nm；
[0048] （2）红外光谱（溴化钾压片）νmax 3425, 1656, 1609, 1507, 1450, 1361, 1176, –1
1086, 839 cm ；
1086, 839 cm ；
[0049] （3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰为m/z472.4369 [M]+（计算值13 1
472.4404），结合 C 和H NMR 谱（图 1 和图 2 ，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式
1 13
为 C24H24O10。H NMR(400 MHz,CD3OD) 和 C NMR(100 MHz,CD3OD) 数据，见表1。
472.4404），结合 C 和H NMR 谱（图 1 和图 2 ，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式
1 13
为 C24H24O10。H NMR(400 MHz,CD3OD) 和 C NMR(100 MHz,CD3OD) 数据，见表1。
[0050] HRESIMS 显示其准分子离子峰为m/z472.4369 [M]+（计算值472.4404），结合13C ‑1
NMR谱确定分子式为 C24H24O10，不饱和度为13。红外光谱显示该化合物含羟基（3425 cm ）、
‑1 ‑1 ‑1
羰基（1656 cm ）及苯基（1609 cm 和 1507 cm ）等官能团。根据其紫外光谱在 265、345
1 13
nm 有最大吸收, 推测所述化合物为黄酮类化合物，该化合物的 H‑和 C‑NMR 数据归属，见
表 1。在黄酮的 A 环处存在两处耦合信号 [δH 6.33 (1H, s, H‑8) 和 6.15 (1H, s, H‑
6)] 以及由 H‑2′ / H‑6′和 H‑3′ / H‑5′的对称性推导出 B 环 [δH 7.75 (2H, d, J =
8.0 Hz, H‑2′, 6′) 和 6.88 (2H, d, J = 8.0 Hz, H‑3′, 5′)] 为一个苯环 A2X2自旋系
统, 此外，通过化学位移为 5.66 (1H, s, H‑1′′) 和 0.73 (3H, d, J = 4.0 Hz, H‑
9′′) 的质子信号以及HMBC谱（图1）中，δ5.66（H‑1′′）的糖端基氢信号与δ135.5（C‑3）的碳
13
信号相关，提示黄酮3位连有一个α‑鼠李吡喃糖。化合物的 C NMR 谱（表 1）显示存在 24
个碳信号（其中两组为对称碳，δC 132.1和δC 116.7 处的 C‑2' / C‑6' 和 C‑3' / C‑5'），
24 个碳信号包括 15 个黄酮骨架上的碳，鼠李吡喃糖上的 6 个碳和二氧异丙基上的 3
个碳 [δC 110.5 (s, C‑6′′), 26.7 (q, C‑7′′), 28.5 (q, C‑8′′)。通过查阅文献，对比
相关数据，发现该化合物与已知化合物 kaempferol‑3‑O‑a‑L‑rhamnopyranoside 最为相
1
似，其不同在于鼠李吡喃糖的化学位移变化以及额外的二氧异丙基信号。在 H NMR 光谱
中，H‑5′′的化学位移从 3.99 升高到 4.47 (△ + 0.48 ppm) 和 H‑4′′的化学位移从
1
3.52 升高到 3.90 (△ + 0.38 ppm)。C NMR 谱中，C‑1′′的化学位移从 102.3 降低至
99.8 (△ ‑ 2.5 ppm) 和 C‑3′′的化学位移从 71.6 升到 74.8 (△ + 3.2 ppm)，C‑4′′
化学位移从 71.1 升高到 79.6 (△ + 8.5 ppm) 以及 C‑5′′化学位移从 70.8 升高为
77.3 (△ + 6.5 ppm)；在HMBC谱（图1）中，δ3.90（H‑4′′），δ4.47（H‑5′′），δ1.33（H‑7′′），δ
1.40（H‑8′′）的氢信号与δ110.5（C‑6′′）的碳信号有相关，提示鼠李吡喃糖的 4″和 5″位连
有一个二氧异丙叉基。综上所述可推断化合物的结构，确定化合物为 kaempferol‑3‑O‑
[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
NMR谱确定分子式为 C24H24O10，不饱和度为13。红外光谱显示该化合物含羟基（3425 cm ）、
‑1 ‑1 ‑1
羰基（1656 cm ）及苯基（1609 cm 和 1507 cm ）等官能团。根据其紫外光谱在 265、345
1 13
nm 有最大吸收, 推测所述化合物为黄酮类化合物，该化合物的 H‑和 C‑NMR 数据归属，见
表 1。在黄酮的 A 环处存在两处耦合信号 [δH 6.33 (1H, s, H‑8) 和 6.15 (1H, s, H‑
6)] 以及由 H‑2′ / H‑6′和 H‑3′ / H‑5′的对称性推导出 B 环 [δH 7.75 (2H, d, J =
8.0 Hz, H‑2′, 6′) 和 6.88 (2H, d, J = 8.0 Hz, H‑3′, 5′)] 为一个苯环 A2X2自旋系
统, 此外，通过化学位移为 5.66 (1H, s, H‑1′′) 和 0.73 (3H, d, J = 4.0 Hz, H‑
9′′) 的质子信号以及HMBC谱（图1）中，δ5.66（H‑1′′）的糖端基氢信号与δ135.5（C‑3）的碳
13
信号相关，提示黄酮3位连有一个α‑鼠李吡喃糖。化合物的 C NMR 谱（表 1）显示存在 24
个碳信号（其中两组为对称碳，δC 132.1和δC 116.7 处的 C‑2' / C‑6' 和 C‑3' / C‑5'），
24 个碳信号包括 15 个黄酮骨架上的碳，鼠李吡喃糖上的 6 个碳和二氧异丙基上的 3
个碳 [δC 110.5 (s, C‑6′′), 26.7 (q, C‑7′′), 28.5 (q, C‑8′′)。通过查阅文献，对比
相关数据，发现该化合物与已知化合物 kaempferol‑3‑O‑a‑L‑rhamnopyranoside 最为相
1
似，其不同在于鼠李吡喃糖的化学位移变化以及额外的二氧异丙基信号。在 H NMR 光谱
中，H‑5′′的化学位移从 3.99 升高到 4.47 (△ + 0.48 ppm) 和 H‑4′′的化学位移从
1
3.52 升高到 3.90 (△ + 0.38 ppm)。C NMR 谱中，C‑1′′的化学位移从 102.3 降低至
99.8 (△ ‑ 2.5 ppm) 和 C‑3′′的化学位移从 71.6 升到 74.8 (△ + 3.2 ppm)，C‑4′′
化学位移从 71.1 升高到 79.6 (△ + 8.5 ppm) 以及 C‑5′′化学位移从 70.8 升高为
77.3 (△ + 6.5 ppm)；在HMBC谱（图1）中，δ3.90（H‑4′′），δ4.47（H‑5′′），δ1.33（H‑7′′），δ
1.40（H‑8′′）的氢信号与δ110.5（C‑6′′）的碳信号有相关，提示鼠李吡喃糖的 4″和 5″位连
有一个二氧异丙叉基。综上所述可推断化合物的结构，确定化合物为 kaempferol‑3‑O‑
[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]。
[0051] 实施例 7
[0052] 取实施例 2 制备的化合物，为淡黄色无定形粉末；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例 6，分子式为 C24H24O10。确认实施例 2 制备的化合物为所述
的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
[0053] 实施例 8
[0054] 取实施例 3 制备的化合物，为淡黄色无定形粉末；按实施例 6 中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例 6，分子式为 C24H24O10。确认实施例 3 制备的化合物为所
述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
述的黄酮类化合物 kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
[0055] 表1 化合物的1H 和13C NMR 数据 (400/100 MHz,CD3OD)
[0056]
[0057] 实施例 9
[0058] 取实施例 4 制备的化合物，为淡黄色无定形粉末；按实施例 6 中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例 6，分子式为 C24H24O10。确认实施例 4 制备的化合物为所
述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
[0059] 实施例 10
[0060] 取实施例 5 制备的化合物，为淡黄色无定形粉末；按实施例 6 中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例 6，分子式为 C24H24O10。确认实施例 5 制备的化合物为所
述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
述的黄酮类化合物kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑
rhamnopyranoside]。
[0061] 实施例 11
[0062] 取实施例 1 5 所制备的任一黄酮类化合物进行神经氨酸酶抑制活性检测试验，~
试验情况如下：
试验情况如下：
[0063] (a) 活性测定方法
[0064] 1、阳性对照奥司他韦羧酸盐溶液的配制
[0065] a．取市奥司他韦胶囊 5 粒，将胶囊粉末在玻璃研钵内研匀，精密称定质量。
[0066] b．取 25 mg 奥司他韦的粉末至 25 mL 容量瓶中，加 15 mL 蒸馏水，超声溶解 15 min 。
[0067] c．用蒸馏水定容至 25 mL，振荡摇匀，10000 r/min 离心 10 min。
[0068] d．取 8 mL 上清液转移至 20 mL 烧杯，加 0.1 g/mL 氢氧化钠溶液 2 mL。
[0069] e. 室温搅拌 5 h 后，用冰醋酸调节 pH 7.5 左右。
[0070] 2、待测化合物溶液的配制
[0071] 将待测化合物各精确称取 1 mg，用蒸馏水和 DMSO，配成浓度为 1 mg/mL 的 10% DMSO 水溶液，超声溶解。然后按倍比稀释，分别配制成 200 μg/mL，40μg/mL，8 μg/mL 的水
溶液，备用。
溶液，备用。
[0072] 3、样品检测的准备：
[0073] a．在 96 孔板内，用微量加样器，每孔加入 70μl 神经氨酸酶检测缓冲液。
[0074] b．每孔再加入 10μl 神经氨酸酶。
[0075] c．每孔再加入 0‑10μl 待筛选的神经氨酸酶抑制剂样品。
[0076] d．每孔再加入 0‑10μl Mili‑Q 水使每孔总体积为 90μl。
[0077] 4、检测：
[0078] a．振动混匀约 l min。
[0079] b．37 oC 孵育 2 min 使抑制剂和神经氨酸酶充分相互作用。
[0080] c．每孔加入 10μl 神经氨酸酶荧光底物。
[0081] d．再振动混匀约 1 min。
[0082] e．37 oC 孵育 20 min 后进行荧光测定。激发波长为 360 nm，发射波长为 440 nm。
[0083] 每板均以奥司他韦羧酸作对照，加样量 0‑10μl。
[0084] 实验结果
[0085] 按照如下公式计算抑制率：
[0086] 抑制率＝（酶活性荧光强度―样品荧光强度）÷（酶活性荧光强度―空白）
[0087] 实验结果表明：经神经氨酸酶抑制活性实验，选用奥司他韦羧酸盐作为对照，kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside]对神经氨酸酶
的 IC50值为187.40 μmol/L，其具有较好的神经氨酸酶抑制活性。
的 IC50值为187.40 μmol/L，其具有较好的神经氨酸酶抑制活性。
[0088] 表 2 化合物的神经氨酸酶抑制活性No. IC50 (µM)
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] 187.40±1.02
Oseltamivir carboxylate 94.63±1.03
kaempferol‑3‑O‑[(4′′, 5′′‑O‑isopropylidene)‑a‑L‑rhamnopyranoside] 187.40±1.02
Oseltamivir carboxylate 94.63±1.03
[0089] a所有数据均表示为平均值± SD（标准差）; n = 3。