一种荧光银纳米团簇探针的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种荧光银纳米团簇探针的制备方法和应用，属于荧光纳米材料。探针是以聚乙烯吡咯烷酮作为配体合成水溶性的荧光银纳米团簇(PVP@AgNCs)。合成的发蓝色荧光的银纳米团簇有较高的量子产率和较小的粒径，同时发现铁离子可使PVP@AgNCs的荧光猝灭，故该探针可用于高灵敏、高选择性的检测铁离子(Fe3+)。该方法原料广泛易得，成本较低，操作简单；而且制得的荧光银纳米团簇探针水溶性好、稳定性强，可应用于实际水样中Fe3+的检测，并获取了PVP@AgNCs在人体肝癌细胞内的成像。

权利要求

1.一种荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于：以聚乙烯吡咯烷酮作为保护剂、抗坏血酸为还原剂，通过一锅法制备得到；

上述制备方法具体包括如下步骤：

(1) 配制0.01- 0.15g/mL 的聚乙烯吡咯烷酮0.5-2 mL，超声8-12 min使其均匀地分散于水中；

(2) 向步骤(1)中加入0.10-0.20 mL、15-25 mmol/L的硝酸银和0.10-0.20 mL 80-120 mmol/L的抗坏血酸；抗坏血酸与硝酸银的摩尔比为5:3-15:1；

硝酸银溶液与聚乙烯吡咯烷酮水溶液的体积比为5:1-10:1；

(3) 在30-80 ℃下继续搅拌3.5-10 h；

(4) 将步骤(3)得到的混合溶液经过离心，最终得到荧光银纳米团簇探针溶液。

2.根据权利要求1所述的荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于：步骤 (1) 中的聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为0.1 g/mL。

3.根据权利要求1所述的荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于：步骤 (2) 中抗坏血酸与硝酸银的摩尔比为5:1。

4.根据权利要求1所述的荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于：步骤 (3) 中在70℃下搅拌7 h。

5.根据权利要求1所述的荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于：步骤 (4) 中离心是以10000-13000 r /min转速离心10 min。

6.一种采用权利要求1 5任一项所述的制备方法制得的荧光银纳米团簇探针。

~

7.一种权利要求6所述的荧光银纳米团簇探针在水样和生物体Fe3+检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将荧光银纳米团簇探针用于水样Fe3+检测中，采用标准加入法进行检测；用实际水样配制浓度分别为5 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L的Fe3+ 溶液，取荧光银纳米团簇探针溶液100 μL、10 μLFe3+ 溶液分别加入到900 μLPBS缓冲溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将荧光银纳米团簇探针用于细胞毒性实验中，荧光银纳米团簇探针溶液对人体肝癌细胞SMMC7721的毒性通过标准的MTT方法评估：将SMMC7721细胞接种到96微孔板上，再与浓度为0-500 µg/mL的荧光银纳米团簇探针溶液在

37℃共同孵育24h；然后将培养基丢弃，向每个孔中加入0.1 mL的0.5 mg/mLMTT溶液，37℃培养4 h后，将上清液舍弃，向每个孔中加入150 μL的DMSO，振荡10 min；最后采用酶标仪测量每个孔在360 nm处的吸光度；计算细胞存活率(VR)：VR=(OD实验组/OD对照组)*100%，其中，OD实验组与OD对照组分别表示有与没有荧光银纳米团簇探针溶液存在时的吸光度。

说明书

一种荧光银纳米团簇探针的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种荧光银纳米团簇探针的制备方法和应用，属于荧光纳米材料领域。

背景技术

[0002] 金属纳米团簇，是一种金属核心尺寸小于2 nm的超小纳米粒子。最近几年，高荧光强度、高稳定性的金属纳米团簇被密集的报道作为新型荧光纳米团簇探针，用于检测多种目标物。金属纳米团簇的一个明显特征是它强的光致发光，并且具有尺寸小、无毒、水溶性好、Stocks位移大、光稳定性好和抗光漂白能力较强的特点，因而引起了研究者广泛的兴趣。银纳米团簇逐渐成为金属纳米材料中的重要组成部分，并广泛应用于化学分析、生物传感、生物成像、催化等研究领域。

[0003] 铁（Fe）是地球上分布最广的金属之一，约占地壳质量的5.1%，在生产生活中具有广泛的应用。其中，铁也是生命体必需的微量元素，在很多生化过程中扮演着重要角色，如细胞代谢、酶催化、电子转移、氧化反应、氧运输、DNA 和 RNA 的合成等。然而，生物体系中铁的含量必须严格控制，它的升高或降低都将引起某些生理障碍。铁的缺乏会导致贫血、智力下降、免疫力和抗感染力降低，而心脏病、肝脏病、糖尿病等多种疾病又与铁的含量过多有关。正常人体血清中铁的含量约为30 µmol/L。在我国《生活饮用水卫生标准》中规定饮用水中铁含量不超过0.3 mg/L。因此，我们期望可以找寻一种简单、灵敏度高和选择性好的方法来检测Fe3+。

[0004] 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 作为一种合成水溶性高分子化合物，具有优异的溶解性能及生理相容性。文献(Synergistic anticancer activity of fluorescent copper nanoclusters and cisplatin delivered through a hydrogel nanocarrier, R. 
Ghosh, U. Goswami, S. Sankar Ghosh, A. Paul, A. Chattopadhyay, ACS Appl. 
Mater. Interfaces, 2015, 7, 209-222)报道了以二氢硫辛酸为原料，结合生物相容性聚合物(聚乙烯吡咯烷酮)作为稳定剂，红荧光单分散CuNCs在水介质中的合成。但是，该方法合成过程需要两种模板，合成步骤繁琐，因此我们迫切需要一种合成简单、成本低廉的新方法。

发明内容

[0005] 本发明旨在提供一种荧光银纳米团簇探针的制备方法，以及该探针在检测实际水3+
样中铁离子(Fe )的应用及细胞成像。

[0006] 由于金属纳米簇的表面积高，外层原子的价键高度不饱和使其表面自由能很高，这就导致纳米簇具有自动聚集长大的趋势。所以，制得稳定的金属纳米簇，在制备过程中，通常需要加入保护剂来减小表面自由能以制得大小均匀、稳定性好的纳米团簇；本发明以聚乙烯吡咯烷酮作为保护剂和抗坏血酸为还原剂制得荧光的银纳米簇，该方法操作简单，成本较低，原料广泛易得。

[0007] 本发明提供了一种荧光银纳米团簇探针的制备方法，是以聚乙烯吡咯烷酮作为保护剂、抗坏血酸为还原剂，通过“一锅法”制备得到。

[0008] 本发明提供的一种荧光银纳米团簇探针的制备方法，包括如下步骤：

[0009] (1) 配制0.01- 0.15g/mL 的聚乙烯吡咯烷酮0.5-2.0 mL，超声8-15 min使其均匀地分散于水中；

[0010] (2) 向步骤(1)中加入0.10-0.20 mL、15-25 mmol/L的硝酸银和0.10-0.20 mL 80-120 mmol/L的抗坏血酸；抗坏血酸与硝酸银的摩尔比为5:3-15:1；

[0011] 硝酸银溶液与聚乙烯吡咯烷酮水溶液的体积比为5:1-10:1；

[0012] (3) 在30-80 ℃下继续搅拌3.5-10 h；

[0013] (4) 将步骤(3)得到的混合溶液经过离心，最终得到荧光银纳米团簇探针溶液。

[0014] 进一步地，步骤 (1) 中的聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度优选为0.1 g/mL；

[0015] 步骤 (2) 中抗坏血酸与硝酸银的摩尔比为5:1；

[0016] 步骤 (3) 中在70℃下搅拌7 h；

[0017] 步骤 (4) 中离心是以10000-13000 r /min转速离心8-15 min。

[0018] 本发明提供了采用上述方法制备的荧光银纳米团簇探针。

[0019] 本发明提供了上述荧光银纳米团簇探针在水样和生物体Fe3+检测中的应用。

[0020] 将荧光银纳米团簇探针用于水样Fe3+检测中，采用标准加入法进行检测；用实际水样配制浓度分别为5 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L的Fe3+溶液，取荧光银纳米团簇探针溶液100 μL、10 μLFe3+溶液分别加入到900 μLPBS缓冲溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。

[0021] 将荧光银纳米团簇探针用于细胞毒性实验中，荧光银纳米团簇探针溶液对人体肝癌细胞SMMC7721的毒性通过标准的MTT方法评估：将SMMC7721细胞接种到96微孔板上，再与浓度为0-500 µg/mL的荧光银纳米团簇探针溶液在37℃共同孵育24 h；然后将培养基丢弃，向每个孔中加入0.1 mL的0.5mg/mLMTT溶液，37℃培养4 h后，将上清液舍弃，向每个孔中加入150 μL的DMSO，振荡10 min；最后采用酶标仪测量每个孔在360 nm处的吸光度；计算细胞存活率(VR)：VR=(OD实验组/OD对照组)*100%，其中，OD实验组与OD对照组分别表示有与没有荧光银纳米团簇探针溶液存在时的吸光度。

[0022] 本发明的有益效果：

[0023] (1) 以聚乙烯吡咯烷酮为模板，制备方法简单，成本低廉，生成的银纳米簇具有较高的量子产率, 量子产率为14.8％。

[0024] (2) 本发明制备的荧光银纳米团簇探针可检测实际水样中的Fe3+；荧光银纳米团簇探针具有良好的蓝色发光性能，将其用于构建实际水样中检测Fe3+的传感体系，可以避免其它金属离子的干扰。

[0025] (3) 制得的荧光银纳米团簇探针尺寸小、光稳定性强、水溶性好、荧光强度高、毒副作用小，可用于生物成像对Fe3+的测定。

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例1制备的荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图；

[0027] 图2为实施例1制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图，图中a为紫外-可见吸收光谱图，b和c为荧光激发和发射峰；

[0028] 图3为实施例2荧光银纳米团簇探针溶液加入不同阳离子时荧光峰强度的变化；

[0029] 图4为实施例3荧光银纳米团簇探针溶液在不同pH值下荧光峰强度的变化；

[0030] 图5为实施例4荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度随响应时间的变化；

[0031] 图6为实施例5荧光银纳米团簇探针溶液随离子强度(氯化钠的浓度)的变化其荧光峰强度的变化；

[0032] 图7为实施例6荧光银纳米团簇探针溶液随Fe3+浓度的变化其荧光峰强度的变化；

[0033] 图8为实施例7荧光银纳米团簇探针溶液与浓度范围为0-100 μmol/L Fe3+之间的线性关系；

[0034] 图9为实施例8荧光银纳米团簇探针浓度的存活率。

具体实施方式

[0035] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。

[0036] 实施例1：

[0037] 以聚乙烯吡咯烷酮为模板的荧光银纳米团簇探针的制备：

[0038] (1) 配制0.10 g/mL 的聚乙烯吡咯烷酮1.0 mL，超声10 min使其均匀的分散于水中；

[0039] (2) 向步骤(1)中加入0.15 mL、20 mmol/L的硝酸银和0.15 mL、100 mmol/L的抗坏血酸，继续搅拌使溶液充分反应；

[0040] (3) 在70 ℃下继续搅拌7 h；

[0041] (4) 将步骤(3)得到的混合溶液以13000 r /min转速离心10 min，最终得到荧光银纳米团簇探针溶液。

[0042] 制备的荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图见图1。

[0043] 制备的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图见图2，表明制备的荧光银纳米团簇探针在固定激发波长为360 nm条件下，发射峰位置在440 nm左右。

[0044] 实施例2：

[0045] 金属离子对实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：

[0046] 将金属离子Na+、K+、Al3+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Pb2+、Fe2+、Fe3+配制成浓度为10 mmol/L的溶液，将实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取10 μL上述含不同金属离子的溶液加入到稀释后的1000 μL荧光银纳米团簇探针溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据440 nm左右的荧光峰强度，检测不同金属离子对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0047] 金属离子对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图3：在360 nm激发下，从含不同金属离子的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度F与荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度F0的比值(F/F0)得出：Fe3+变化最大，其他金属离子变化相对较小，说明本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液能够定性检测Fe3+。

[0048] 实施例 3

[0049] pH值对实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响实验：

[0050] 分别将100 μL实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液加入到900 μL不同pH值的PBS缓冲溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据440 nm左右的荧光峰强度，检测pH值对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响。

[0051] pH值对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图4：在360 nm激发下，荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度在pH达到4后，其荧光强度随着pH增加，变化不大。因而，考虑到在人体中的环境为7.4，本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液选择在pH=7.4的条件下检测Fe3+。

[0052] 实施例4

[0053] 响应时间对实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液和加入Fe3+后的荧光银纳米团簇溶液的荧光强度的影响实验：

[0054] 将100 μL实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液和加入Fe3+后的荧光银纳米团簇溶液分别加入到900 μL PBS缓冲溶液(pH=7.4)中，固定激发波长为360 nm，在室温下0-10 min内进行荧光光谱检测，根据440 nm左右的荧光峰强度，检测时间对荧光银纳米团簇探针溶液和加入Fe3+后的荧光银纳米团簇溶液的荧光强度的影响

[0055] 时间对荧光银纳米团簇探针溶液和加入Fe3+后的荧光银纳米团簇溶液的荧光强度的影响见图5：在10 min内，荧光银纳米团簇探针溶液和加入Fe3+后的荧光银纳米团簇溶液3+
的荧光强度基本保持不变，说明Fe 的响应时间很短，反应很快。

[0056] 实施例 5

[0057] 离子强度对实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响实验：

[0058] 将100 μL实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液加入到900 μL PBS缓冲溶液(pH=7.4)中，固定激发波长为360 nm，加入不同浓度的氯化钠溶液(0   500 mmol/L)，根据~
440nm左右的荧光强度，检测离子强度对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响。

[0059] 离子强度对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图6：在360 nm激发下，荧光银纳米团簇探针溶液在不同浓度的氯化钠溶液(0   500 mmol/L)范围内，荧光强度基~本不变，说明本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液抗离子干扰性强。

[0060] 实施例 6

[0061] 实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液对Fe3+检测的实验：

[0062] 将实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液100 μL加入到900 μLPBS缓冲溶液中，滴加不同浓度的Fe3+到该溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据440 nm左右的荧光强度，检测Fe3+对银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响。

[0063] Fe3+对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的影响见图7：在360 nm激发下，荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的Fe3+后，荧光强度逐渐减小，最后荧光峰基本趋于平滑；其中0-150 μmol/L分别是0, 1, 2, 3, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125130, 135, 
140, 145, 150 μmol/L的Fe3+对荧光银纳米团簇探针溶液荧光强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对Fe3+的检测。

[0064] 此外，本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度的变化与Fe3+的浓度呈3+ 3+
线性关系，如图8所示，Fe 线性方程为F/F0= -0.00781[Fe ] + 0.990，线性范围为1-100 µmol/L，检出限为384 nmol/L (信噪比为S/N=3)。

[0065] 实施例 7

[0066] 实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液用于实际水样中Fe3+的检测实验：

[0067] 采用标准加入法用于实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液在实际水样中Fe3+检测应用的实验。如表1所示，用实际水样配制浓度分别为5, 20, 50 μmol/L的Fe3+溶液，将取实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液100 μL，10 μLFe3+的分别加入到900 μLPBS缓冲溶液中，固定激发波长为360 nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。

[0068] 利用图8中的线性方程计算出实际水样中Fe3+的回收率。本实验中多组平行测定并计算Fe3+的回收率，如表1所示，利用这种方法测定的回收率为97.4-103.6%，说明实施例1制3+
备的荧光银纳米团簇探针溶液能够用于水样中Fe 的检测。

[0069] 表1为本发明制备的荧光银纳米团簇探针溶液用于实际水样中Fe3+的检测

[0070]

[0071] 实施例 8

[0072] 实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液用于细胞毒性实验

[0073] 为实现细胞成像，实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液需要具有低毒性和较好的生物相容性等优点，所以荧光银纳米团簇探针溶液对人体肝癌细胞(SMMC7721)的毒性通过标准的MTT方法评估。简单地，将SMMC7721细胞接种到96微孔板上，再与不同浓度的荧光银纳米团簇探针溶液(0-500 µg/mL)在37℃共同孵育24 h。然后将培养基丢弃，向每个孔中加入0.1 mL的MTT溶液(0.5mg/mL,溶剂DMEM)，37℃培养4 h后，将上清液舍弃，向每个孔中加入150 μL的DMSO，振荡10 min。最后采用酶标仪测量每个孔在360 nm处的吸光度(OD)。
计算细胞存活率(VR)：VR=(OD实验组/OD对照组)*100%，其中，OD实验组与OD对照组分别表示有与没有荧光银纳米团簇探针溶液存在时的吸光度。

[0074] 采用MTT实验对荧光银纳米团簇探针溶液的细胞毒性进行评估结果见图9：SMMC7721细胞与不同浓度的荧光银纳米团簇探针溶液孵育24 h后，当荧光银纳米团簇探针溶液浓度为200 µg/mL时，细胞存活率依旧保持在80%以上，这说明荧光银纳米团簇探针溶液具有低毒性，可以进一步应用于细胞成像。

[0075] 实施例 9

[0076] 实施例1制备的荧光银纳米团簇探针溶液用于细胞成像实验

[0077] 将实验所用的人肝癌细胞SMMC7721用含10% (体积比)胎儿牛血清和1% (体积比)盘尼西林-链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。然后向培养基中加入200 μg/mL 荧光银纳米团簇探针溶液溶液在37 ℃孵育1 h后，吸走多余培养基，用pH=7.4的PBS缓冲液洗涤3次，在荧光共聚焦扫描显微镜观察成像情况。除此之外，用 Fe3+ (50 µmol/L)处理含有荧光银纳米团簇探针溶液SMMC7721细胞，将它们置于含有1 mL PBS (pH 7.4)的培养皿中培养约2 min。观察其成像情况。在激发波长为405 nm下收集了410-500 nm发射波段的蓝色荧光。

[0078] SMMC7721细胞用荧光银纳米团簇探针溶液及含Fe3+的荧光银纳米团簇探针溶液标记， SMMC7721细胞在含200 µg/mL的荧光银纳米团簇探针溶液中培养1 h后的共聚焦荧光显微图像可以看出SMMC7721细胞形态良好、分布均匀，并且荧光银纳米团簇探针溶液可以进入细胞质中，呈现明亮的蓝色荧光。SMMC7721细胞在含50 µmol/L Fe3+的荧光银纳米团簇探针溶液中的共聚焦荧光成像可以看出，Fe3+的加入使荧光强度减弱，说明该实验可以将荧光银纳米团簇探针溶液应用于细胞内的Fe3+检测。