一种哈茨木霉LTR-2的应用

摘要

本发明涉及微生物的技术领域，特别是涉及一种防治烟草花叶病毒病的代谢产物制备方法及应用，本发明针对烟草花叶病毒病的盛行和化学农药对环境的破坏，以及混菌菌剂的使用对植株自身微生物群落的平衡存在潜在风险等问题，提供一种哈茨木霉LTR‑2的防治烟草花叶病毒病的应用，更具体为哈茨木霉LTR‑2代谢产物防治烟草花叶病毒病的应用。本发明从实验室保存的木霉菌中筛选获得一株防治烟草花叶病毒病的菌株，并对该菌株代谢产物进行了病毒防治研究，以期直接快速防治烟草花叶病毒病，保障烟草产量与品质，维持烟草种植中微生物群落平衡提供参考。

权利要求

1.一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2，已于2005年1月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.1498。

2.根据权利要求1所述的哈茨木霉LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，其特征在于，具体为哈茨木霉LTR-2代谢产物在防治烟草花叶病毒病方面的应用；所述的哈茨木霉LTR-2代谢产物的制备方法，由以下步骤进行：(1)菌种的活化培养：将保存的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株LTR-2接种到固体PDA培养基上，30℃±1℃条件下培养之平板长满孢子，供接种用；

(2)发酵液的获得：在超净工作台中接种一铂金环哈茨木霉LTR-2孢子至液体培养基，在30℃±1℃条件下，摇床转速160r/min，发酵培养120h；

(3)哈茨木霉LTR-2代谢产物的提取：发酵完毕后，液体发酵产物经Φ＝45μm过滤网处理，收集发酵上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，用等体积正丁醇萃取，收集上层在真空条件下浓缩至浸膏，得到正丁醇萃取物，即哈茨木霉LTR-2代谢产物。

3.根据权利要求2所述的哈茨木霉LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，其特征在于，步骤(2)中液体培养基配方：每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充去离子水至1000mL；每1000mL滤液加入葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉5g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，pH7.0～7.5；500mL三角瓶装100mL液体培养基；

115℃灭菌30min，待冷却到室温条件下使用。

4.根据权利要求2所述的哈茨木霉LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，其特征在于，将得到的哈茨木霉LTR-2代谢产物配置为浓度5g/L的代谢产物母液。

5.根据权利要求4所述的哈茨木霉LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，其特征在于，所述的代谢产物母液配置的具体步骤为，准确称取哈茨木霉LTR-2代谢产物0.50g，加入

100mL无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置为浓度5g/L的代谢产物母液。

说明书

一种哈茨木霉LTR-2的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物的技术领域，特别是涉及一种防治烟草花叶病毒病的代谢产物制备方法及应用，具体为一种哈茨木霉LTR-2的应用。

背景技术

[0002] 烟草是我国北方和南方地区广泛种植的重要经济作物。影响烟草业发展的病害主要是烟草花叶病毒病。近年来, 该病发病逐年严重, 田间发病率一般5 20%，个别田块可高~达90 100%，造成上等烟比率、单产量以及产值明显下降。烟草花叶病毒病是由烟草花叶病~
毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起的，该病毒可通过相邻叶面轻微摩擦产生的微小伤口入侵，主要侵染源是带毒叶片；烟株苗期抵抗烟草花叶病毒的能力最弱，最易患病。烟草花叶病毒能够侵染多达270种植物，该病毒降低烟草产量，劣化烟草品质，严重制约烟草生产。
病害严重的年份减产达50％以上，对其经济生产带来巨大损失。

[0003] 目前对烟草花叶病毒病防治主要采用化学农药杀灭病原，但化学农药的毒副作用和农药残留问题至今难以解决。据资料统计，木霉菌对多种植物病原具有拮抗作用，凭借其广谱性、适应性强等特点而被广泛应用于农业的各个方面。除对病原菌拮抗作用外，木霉菌通过分泌抗生素类及酶类等物质，诱导植物产生病原抗性。借助木霉菌产生的抗病毒活性物质进行植物病害生物防治，具有生态友好，低毒高效等优点。

[0004] 中国专利201710942648.4，公开了一种防治烟草花叶病毒的菌剂及其制备方法，该菌剂由烟曲霉、绿色木霉、哈茨木霉、荧光假单胞菌和多黏芽孢杆菌等15个菌种混菌同罐发酵获得。该发明通过促进植株生长防治烟草花叶病，但其需要经过菌株萌发生长后方能起防治作用，不能直接快速地抵御烟草花叶病。另外，混菌菌剂的使用对植株自身微生物群落的平衡存在潜在风险。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对烟草花叶病毒病的盛行和化学农药对环境的破坏，以及混菌菌剂的使用对植株自身微生物群落的平衡存在潜在风险等问题，提供一种哈茨木霉LTR-2的防治烟草花叶病毒病的应用，更具体为哈茨木霉LTR-2代谢产物防治烟草花叶病毒病的应用。本发明从实验室保存的木霉菌中筛选获得一株防治烟草花叶病毒病的菌株，并对该菌株代谢产物进行了病毒防治研究，以期直接快速防治烟草花叶病毒病，保障烟草产量与品质，维持烟草种植中微生物群落平衡提供参考。

[0006] 本发明提供了一种哈茨木霉LTR-2在防治烟草花叶病毒病方面的应用，具体为哈茨木霉LTR-2代谢产物在防治烟草花叶病毒病方面的应用。

[0007] 本发明的木霉菌-哈茨木霉LTR-2，为哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株LTR-2，是由山东省科学院生态研究所分离获得并保存，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：
CGMCC NO.1498，菌种的拉丁文名称是Trichoderma harzianum，参据微生物（株）：LTR-2，保藏日期为2005年1月30日。该菌株经液体发酵﹑提取可获得对烟草花叶病毒有抑制作用的代谢产物，从而对烟草花叶病有较好的防治效果。

[0008] 本发明的防治烟草花叶病毒病的哈茨木霉LTR-2代谢产物的制备方法，由以下步骤进行：

[0009] （1）菌种的活化培养：将已分离保存的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株LTR-2接种到固体PDA培养基上，30℃±1℃条件下培养之平板长满孢子，供接种用；

[0010] （2）发酵液的获得：发酵培养液每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充水分至1000mL；每1000mL滤液加入葡萄糖20g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，pH 7.0～7.5；500mL三角瓶装100mL液体培养基；115℃灭菌30min，待冷却到室温条件备用；在超净工作台中接种一铂金环哈茨木霉LTR-2孢子至液体培养基，在30℃±1℃条件下，摇床转速160r/min，发酵培养120h；

[0011] （3）哈茨木霉LTR-2代谢产物提取：发酵完毕后，液体发酵产物经Φ=45μm过滤网处理，收集发酵上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，用等体积正丁醇萃取，收集上层在真空条件下浓缩至浸膏，得到正丁醇萃取物，即哈茨木霉LTR-2代谢产物。

[0012] 进一步的，将得到的哈茨木霉LTR-2代谢产物配置为浓度5g/L的代谢产物母液，具体步骤为，准确称取哈茨木霉LTR-2代谢产物0.50g，加入100mL无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置为浓度5g/L的代谢产物母液。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] 本发明提供了利用哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2液体发酵获得活性代谢产物的制备方法；该代谢产物可应用于植物烟草花叶病毒病的防治，为微生物源农药的开发开拓新的途径。

[0015] 本发明获得的哈茨木霉LTR-2代谢产物与市场化学农药相比，对烟草花叶病毒病的防治效果好，防治效果在75%以上，最高可达90%；制备方法简单，易操作。

[0016] 通过实验发现，哈茨木霉LTR-2代谢产物为母液浓度（浓度为0.5%哈茨木霉LTR-2代谢产物）时，对烟草花叶病毒的抑制率接近100%；浓度为10×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率接近100%；浓度为100×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率达到90%以上；浓度为500×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率超过80%。因此，哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒有很好的抑制效果。

[0017] 通过实验还发现，哈茨木霉LTR-2代谢产物工作浓度为100×母液浓度时，对烟草植株的烟草花叶病毒病的防效达到80％以上；哈茨木霉LTR-2代谢产物工作浓度为500×母液浓度时，对烟草的烟草花叶病毒病的防效达到75％以上。

具体实施方式

[0018] 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

[0019] 实施例1

[0020] 哈茨木霉Trichoderma harzianum LTR-2代谢产物的制备方法，由以下步骤进行：

[0021] （1）菌种的活化培养：将已分离保存的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株LTR-2接种到固体PDA培养基上，30℃±1℃条件下培养之平板长满孢子，供接种用；

[0022] （2）发酵液的获得：发酵培养液每1000mL中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充水分至1000mL；每1000mL滤液加入葡萄糖20g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，磷酸二氢钾3.0g，七水硫酸镁1.50g，pH 7.0～7.5；500mL三角瓶装100mL液体培养基；115℃灭菌30min，待冷却到室温条件备用；在超净工作台中接种一铂金环哈茨木霉LTR-2孢子至液体培养基，在30℃±1℃条件下，摇床转速160r/min，发酵培养120h；

[0023] （3）哈茨木霉LTR-2代谢产物提取：发酵完毕后，液体发酵产物经Φ=45μm过滤网处理，收集发酵上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，用等体积正丁醇萃取，收集上层在真空条件下浓缩至浸膏，得到正丁醇萃取物。

[0024] 上述代谢产物用于烟草花叶病毒抑制活性测定。

[0025] 以下实施例2、3、4中所述哈茨木霉LTR-2代谢产物均为实施例1所制得；所述产品的百分含量均为质量／体积百分比。

[0026] 实施例2

[0027] 哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒的抑制作用，由以下步骤进行：

[0028] （1）母液（0.5%哈茨木霉LTR-2代谢产物）制备：准确称取哈茨木霉LTR-2代谢产物0.50g，并加入100mL体积的无菌水，超声震荡充分溶解，最终配置成浓度为5000mg/L的母液，即母液为0.5%哈茨木霉LTR-2代谢产物；

[0029] （2）样品液制备：取上述母液用无菌水分别稀释为10×、100×和500×（浓度分别为500mg/L﹑50mg/L和10mg/L）；

[0030] （3）抑制病毒活性测定：采用半叶枯斑法测定代谢产物对烟草花叶病毒（TMV）的抗性。选择生长旺盛、健康的真叶期三生烟，右半叶接种含有TMV和少量二氧化硅不同浓度的代谢产物（TMV和代谢产物稀释液体积比为1∶1）100μL，左半叶接种等浓度含有TMV、二氧化硅和无菌水组成的混合物対照，完成接种后用清水冲洗干净，每棵烟草处理1片叶子，每处理6株，重复3次，3 5 d 后观察统计左右半叶的枯斑数目，并计算抑制率。~

[0031] 抑制率=（对照平均枯斑数－处理平均枯斑数）/对照平均枯斑数×100%[0032] 哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒抑制率如下表1所示。

[0033] 表1 哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒抑制试验

[0034]

[0035]  结果显示，哈茨木霉LTR-2代谢产物为母液浓度（浓度为0.5%哈茨木霉LTR-2代谢产物）时，对烟草花叶病毒的抑制率接近100%；浓度为10×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率接近100%；浓度为100×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率达到90%以上；浓度为500×母液时，对烟草花叶病毒的抑制率超过80%。这表明哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒有很好的抑制效果。

[0036] 实施例3（本发明产品与田间常见农药对比）

[0037] 实施步骤参照实施例2中（3）实施。试验结果见表2。

[0038] 表2 哈茨木霉LTR-2代谢产物与常见农药对比

[0039]  由表2可知，哈茨木霉LTR-2代谢产物抑制效果较常见化学药剂相仿或略优，并且安全性高。

[0040]  实施例4

[0041] 哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒病的防治

[0042] 试验在山东省科学院生态所试验田进行，品种为易感品种中烟100。

[0043] 试验按农业部药检所田间试验准则设计，共5个处理：哈茨木霉LTR-2代谢产物浓度为50mg/L，10mg/L ，8%宁南霉素水剂400倍液，病毒A水剂600倍液，清水对照。采用喷雾法施药，在下午15：00后进行，每处理100株，3次重复，随机区组设计。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录各株病级。

[0044] 病情严重度分级指标：参考中华人民共和国行业标准（NY／T1464-2007）病害分级标准中的番茄花叶病分级标准，以整株为单位进行分级。0级：无病株；1级：明脉，轻花叶；3级：心叶及中部叶片花叶；5级：心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩或植株轻度矮化；7级：重花叶，多数叶片畸形、皱缩或植株矮化；9级：重花叶，叶片明显畸形，植株严重矮化，甚至死亡。

[0045] 病情指数=∑(病级叶数×该级代表值)/调查总叶数×发病最高级

[0046] 防效（%）＝［１－（对照区药前病指×处理区药后病指）／（对照区药后病指×处理区药前病指）］×100%

[0047] 数据统计分析：统计分析用EXCEL2003 和SPSS19.0 软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。

[0048] 在苗期植株零星发病时开始施药，间隔7天用药1次，连续用药5次。在最后一次施药后5天调查药后病情指数。试验期间平均温度28℃。防治效果见表3。

[0049] 表3 哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒病的防治效果

[0050]

[0051] 由表3可知，哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒病的防效显著，10.00mg/L哈茨木霉LTR-2代谢产物对烟草花叶病毒病防效为76.56%，高于对照药剂8%宁南霉素（AS）400倍液和病毒A可湿性粉剂 600倍液的防效。