一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中的应用

摘要

本发明公开了一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中的应用。所述淬灭菌为不动杆菌F15Y，该菌株于2018年8月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为是GDMCC No：60440。该菌株具有DSF及AHLs高降解活性，降解效率高、效果显著、降解性能稳定；对依赖DSF或AHLs致病的致病菌以及相关植物病害，具有很好的防治效果；而且菌株F15Y分离于常年耕作的番薯田土壤，对环境能够较好的适应，且对环境友好；因此菌株F15Y在依赖DSF或AHLs介导致病的植物病原菌的防治中具有巨大的推广应用潜力，同时本发明可以减少抗生素滥用问题和农药残留污染问题，为生物防治植物病害提供了新思路。

权利要求

1.一种微生物群体感应信号分子淬灭菌，其特征在于，所述淬灭菌是不动杆菌(Acinetobacter seifertii)菌株F15Y，该菌株于2018年8月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No：60440；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为3OC6HSL或3OC12HSL。

2.不动杆菌在降解群体感应信号分子，或在制备降解群体感应信号分子的产品中的应用，其特征在于，所述不动杆菌为权利要求1所述不动杆菌菌株F15Y；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为3OC6HSL或3OC12HSL。

3.不动杆菌在防治群体感应信号分子介导致病的病害，或在制备依赖群体感应信号分子致病的致病菌的防治制剂方面的应用，其特征在于，所述不动杆菌为权利要求1所述不动杆菌菌株F15Y；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为3OC6HSL或

3OC12HSL；所述群体感应信号分子介导致病的病害为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora,Pcc)引起的软腐病、或野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)引起的黑腐病；所述依赖群体感应信号分子致病的致病菌为黄单胞菌(Xanthomonas)或果胶杆菌(Pectobacterium)。

4.一种防治群体感应信号分子介导致病的病害的方法，其特征在于，用权利要求1所述菌株F15Y的菌液处理植物；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为

3OC6HSL或3OC12HSL；所述群体感应信号分子介导致病的病害为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora,Pcc)引起的软腐病、或野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)引起的黑腐病。

5.一种可降解群体感应信号分子的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株F15Y或其菌液；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为3OC6HSL或

3OC12HSL。

6.一种依赖群体感应信号分子致病的致病菌的生防制剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株F15Y或其菌液；所述微生物群体感应信号分子为AHLs或DSF；所述AHLs为3OC6HSL或3OC12HSL；所述依赖群体感应信号分子致病的致病菌为黄单胞菌(Xanthomonas)或果胶杆菌(Pectobacterium)。

说明书

一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中

的应用

技术领域

[0001] 本发明属于病害生物防治技术领域。更具体地，涉及一种微生物群体感应信号分子淬灭菌及其在病害生物防治中的应用。

背景技术

[0002] 我国是农药化肥生产和使用大国，不规范使用农药导致生态环境问题突出，致使很多植物病原菌产生抗性，为此人们加大农药使用量去防治植物病害，如此恶性循环，造成的环境污染和农作物农药残留给人类健康带来潜在的巨大威胁。

[0003] 生物防治是近年来提倡的新型防治方法，基于群体感应提出的群体淬灭是生物防治的热点。群体感应（Quorum sensing,QS）是指信号分子调控微生物特定基因的表达，协调群体行为。群体淬灭（Quorum quenching, QQ）是通过抑制信号分子的合成、积累、检测或对信号分子进行酶降解或修饰，从而干扰群体感应。群体感应广泛存在于革兰氏阴性菌中，且参与调控多种重要的生物功能（生物膜的合成，抗生素的合成，胞外多糖的产生等），但不同细菌的群体感应信号分子可能不同，如：植物致病菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）水解酶的产生受到群体感应系统的调控，其群体感应信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯类物质（N-Acyl homoserine lactones, AHLs）。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc）具有群体感应系统并调控着胞外酶的产生，其群体感应信号分子为DSF（Diffusible Signal Factor）。Pcc和Xcc的受群体感应系统调控的酶均与其致病性密切相关。在农业生产中，Pcc引起的蔬菜软腐病和Xcc引起的十字花科黑腐病均可带来巨大的经济损失。目前对于软腐病和黑腐病的防治主要依靠化学农药，如农用链霉素、氯霉素等，而利用群体淬灭菌降解群体感应信号分子则提供了一种新型的防治思路。

[0004] 通过从环境中筛选高效降解信号分子的微生物，破坏信号分子积累，使其浓度低于阈值而不能激活病原菌致病基因表达，从而达到保护植物的目的，该方法具有操作简便、经济实用、环境友好、效率高、周期短等特点，不对病原菌产生选择压力，对解决化学农药带来的环境污染问题有重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有微生物群体感应信号分子淬灭菌的不足，提供一种新的高效微生物群体感应信号分子DSF /AHLs淬灭菌，即不动杆菌（Acinetobacter seifertii）F15Y，该菌株对包括DSF、OHHL和OdDHL在内的多种群体感应信号分子具有显著的降解作用，还具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，具有巨大的推广应用潜力。

[0006] 本发明的目的是提供一种微生物群体感应信号分子淬灭菌。

[0007] 本发明另一目的是提供所述微生物群体感应信号分子淬灭菌在病害生物防治中的应用。

[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0009] 本发明研究发现，不动杆菌对群体感应信号分子 DSF /AHLs有显著且快速的降解作用，在防治 DSF /AHLs介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的治疗策略提供了新的开发途径。

[0010] 同时，本发明筛选到的不动杆菌菌株 F15Y，该菌株于 2018 年8 月 28 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为是GDMCC No：60440。该菌株从采集自广东佛山市南海区和顺鲁岗长年耕作的番薯田土壤中，经人工筛选分离纯化获得。

[0011] 菌株 F15Y 的菌落形态特征为：在营养琼脂平板上培养 48h，菌落淡黄绿色，稍隆起，表面光滑不透明，边缘整齐；在营养肉汤培养基中培养 48h，呈扩散性混浊。电镜观察菌体的形态特征为：菌体呈杆状，或近球形。

[0012] 所述菌株 F15Y 对羧苄青霉素（CARB）的抗性达到 400 μg·mL-1或以上，对氨苄青霉素（AMP）的抗性达到300 μg·mL-1 或以上，对庆大霉素（GEN）、氯霉素（CM）、卡那霉素（KAN）、链霉素（STR）、硫酸新霉素（NEO）的抗性达到50 μg·mL-1。

[0013] 经过实验研究显示，该不动杆菌菌株 F15Y能降解多种群体感应信号分子包括DSF、OHHL、OdDHL等，对对依赖  AHLs  致病的胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）引起的软腐病和野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris, Xcc）引起的黑腐病均具有显著的生防效果，在防治DSF和/或DSF类似物、AHLs介导的病原菌危害方面有巨大的应用潜力。而且该菌株具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，在群体淬灭方向、防治依赖群体感应信号包括DSF、OHHL和OdDHL致病的病原菌危害方面具有推广应用的巨大潜力，同时本发明可以减轻现有的农药残留污染问题，为生物防治植物病害提供了新思路。

[0014] 因此基于上述研究成果，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

[0015] 不动杆菌在降解群体感应信号分子 DSF和/或DSF类似物，或在制备降解DSF和/或DSF类似物的产品中的应用。

[0016] 不动杆菌在降解群体感应信号分子AHLs，或在制备降解AHLs的产品中的应用。

[0017] 不动杆菌在防治DSF和/或DSF类似物介导致病的病害，或在制备依赖 DSF和/或DSF类似物致病的致病菌的防治制剂方面的应用。

[0018] 不动杆菌在防治AHLs介导致病的病害，或在制备依赖AHLs致病的致病菌的防治制剂方面的应用。

[0019] 优选地，上述不动杆菌为不动杆菌菌株 F15Y。

[0020] 优选地，所述DSF信号类似物包括顺-2-十二碳烯酸、（2Z，3Z）-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸、顺-11-甲基-2-十二碳烯酸、顺-2-葵烯酸、12-甲基-十四烷酸在内的DSF家族群体感应信号分子。

[0021] 优选地，所述AHLs包括N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯、N-(3-氧代癸酰)-L-高丝氨酸内酯、异戊酰基-高丝氨酸内酯、羧化酰基-高丝氨酸内酯（carboxyl-AHLs）、芳基-高丝氨酸内酯或香豆酰基-高丝氨酸内酯。

[0022] 优选地，AHLs包括传统的AHLs，如：N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯（N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone,OHHL）、N-(3-氧代辛酰)-L-高丝氨酸内酯（N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,OOHL）和N-(3-氧代癸酰)-L-高丝氨酸内酯（N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone,OdDHL），还包括一些新的特殊的AHLs，如：异戊酰基-高丝氨酸内酯（Isovaleryl-homoserine lactone）、羧化酰基-高丝氨酸内酯（carboxyl-AHLs）、芳基-高丝氨酸内酯（Aryl-homoserine lactone）和香豆酰基-高丝氨酸内酯（p-coumaroyl-HSL）。

[0023] 更优选地，所述AHLs为3OC6HSL或3OC12HSL。

[0024] 所述依赖  DSF和/或DSF类似物、或AHLs致病的致病菌包括：黄单胞菌（Xanthomonas）、伯克氏菌（Burkholderia）、欧文氏菌（Erwinia）、迪卡氏菌（Dickeya）、果胶杆菌（Pectobacterium）和/或绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。

[0025] 本发明还提供一种防治依赖 DSF或AHLs致病的致病菌病害的方法，是用不动杆菌菌株 F15Y 的菌液处理植物，以预防依赖DSF / AHLs 致病的致病菌的侵染。

[0026] 另外，具体应用时，所述不动杆菌降解 DSF和/或AHLs的最适 pH 为 6.8 7.2，最~适温度为 28℃ 30℃。即可以将不动杆菌菌株 F15Y 的菌液的pH 控制在 6.8 7.2，在环境~ ~
温度为 28℃ 30℃时对作物进行喷雾或接种。
~

[0027] 优选地，应用时，制备不动杆菌的菌液所用的最适培养基为 MSM 培养基，[0028] 其配方为：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L； Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；KH2PO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L，pH 7.2。

[0029] 另外，一种含有不动杆菌菌株 F15Y 或其菌液的可降解群体感应信号分子 DSF和/或AHLs的降解菌剂，以及含有不动杆菌菌株 F15Y 或其菌液的依赖 DSF和/或AHLs致病的致病菌的生防制剂，均应在本发明的保护范围之内。

[0030] 实验显示，将该菌株的发酵液和 DSF 共同培养，经过萃取和液相色谱分析发现 DSF被明显降解，可知对 DSF 起降解作用的是发酵液。因此，可使用发酵所得菌液来制备降解菌剂和生防制剂。

[0031] 本发明同时还提供了一种菌株 F15Y 菌液的制备方法：具体是将菌株 F15Y 划线于 LB 固体培养基平板上，28℃ 30℃下培养 12 36 h，挑取单菌落接种于 LB 液体培养基~ ~中预培养至对数期，所得菌体用 0.9%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再将种子悬液按照体积比 0.5% 5%（优选 1%）的接种量接种至 LB 液体培养基培养至对数期，菌~
体用 PBS 缓冲液重悬得到菌株 F15Y 的菌液。菌液的浓度不做严格限制，具体可根据实际病害程度和应用效果进行调整。

[0032] 优选地，LB 培养基的配方为：胰蛋白胨 10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，氯化钠 10.0 g/L，pH 6.8 7.2，121℃灭菌 20 min。LB 固体培养基配方是在液体培养基中加入 ~
1.5%（w/v）的琼脂。

[0033] 本发明具有以下有益效果：

[0034] 本发明提供了一株不动杆菌菌株 F15Y，具有 DSF 及AHLs高降解活性，降解效率高、效果显著；对依赖DSF或AHLs致病的致病菌以及相关植物病害，具有很好的防治效果。

[0035] 另外，菌株 F15Y 分离于常年耕作的番薯田土壤，对环境能够较好的适应，且对环境友好，对植物病原菌中群体感应信号分子DSF及AHLs具有较好的降解活性、且降解性能稳定、环境友好，因此菌株 F15Y 在依赖 DSF 或AHLs介导致病的植物病原菌的防治中具有巨大的推广应用潜力，同时本发明可以减少抗生素滥用问题和农药残留污染问题，为生物防治植物病害提供了新思路。

附图说明

[0036] 图 1 为本发明的菌株 F15Y 在营养琼脂培养基上的菌落形态图。

[0037] 图 2 为本发明的菌株 F15Y 的扫描电镜图。

[0038] 图 3 为本发明的菌株 F15Y 的系统进化树分析图。

[0039] 图 4 为本发明的菌株 F15Y 在不同抗生素中的生长情况图。

[0040] 图 5为本发明的菌株 F15Y 对 DSF 降解的HPLC 图（图 A 为未接种菌株 F15Y 的对照图，图 B、C、D、E、F、G分别为菌株F15Y 对2 mM DSF 降解 0h、6 h、12 h、18 h、24h、30h、36h的高效液相色谱（HPLC）图）。

[0041] 图 6 为本发明菌株 F15Y 以DSF 为唯一碳源的生长曲线和降解曲线图。

[0042] 图 7为本发明的菌株 F15Y 单独接种及与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）共同接种于萝卜肉质根切片 48 h 后萝卜肉质根切片的发病情况。

[0043] 图 8为本发明的菌株 F15Y 单独接种及与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）共同接种于马铃薯块茎切片 48 h 后马铃薯块茎切片的发病情况。

[0044] 图9为利用报告菌株 CF11 测定F15Y对不同 AHLs （3OC6HSL 、 3OC6HSL 和3OC12HSL）的降解结果。

[0045] 图 10为本发明的菌株 F15Y 单独接种及与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）共同接种于马铃薯块茎切片 24 h 后马铃薯块茎切片的发病情况。

[0046] 图 11为本发明的菌株 F15Y 单独接种及与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）共同接种于胡萝卜肉质根切片 24 h 后胡萝卜肉质根切片的发病情况。

具体实施方式

[0047] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0048] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0049] 实施例1 不动杆菌菌株 F15Y的分离与鉴定

[0050] 1、菌株 F15Y 的分离、筛选

[0051] （1）土样采集：以采集自长年耕作的番薯田的土壤作为微生物源。

[0052] 土样于 2017 年 3 月 16 日采集自广东省佛山市南海区和顺鲁岗长常年耕作的番薯田土壤，对表层至深层 5 cm 的土壤都进行取样、装袋、保存作为微生物源进行菌株分离。

[0053] （2）菌株的富集培养：制备 MSM 培养基，将 50 mL 的MSM 培养基装到 250 mL 三角瓶中灭菌，冷却后在无菌条件下加入 DSF 母液（母液浓度为100mM,甲醇为溶剂），使 DSF 的最终质量浓度为 0.01 mM。同时加入土样 5 g，于 30℃、200 rpm 摇床培养 7 d 后，按 10%的接种量转接到第二批 DSF 最终质量浓度为 0.02 mM的 MSM 培养基中。相同条件培养 7 d 后，再按 10%的接种量转接到 DSF 最终质量浓度为 0.04 mM的 MSM 培养基中，继续培养 7 d。以此类推，不断增加 DSF 的质量浓度。

[0054] MSM 培养基的配方为：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L； Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；KH2PO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L，pH 7.2。

[0055] （3）菌株分离与纯化：采用稀释、平板涂布划线进行分离纯化。

[0056] 取 1mL 终 MSM 培养基发酵液用无菌水将其稀释成梯度浓度为10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6的发酵液，然后吸取 100 μL 稀释好的各个浓度梯度的发酵液均匀地涂布在 LB 固体平板上，30℃培养，挑取长出的不同菌落形态的单菌落，在 LB 固体平板反复划线培养纯化，直至分离出单菌株。将单菌株-80℃保存，待 HPLC 测定 DSF 降解率进行筛选。

[0057] （4）菌株的筛选：利用以 DSF 作为唯一碳源的 MSM 基础培养基对从土样中分离得到的菌株进行筛选。

[0058] 将分离纯化后的菌株单菌落接种于以DSF作为唯一碳源的40 mL 含有DSF 的MSM基础盐培养基中，DSF 最终质量浓度为2 mM，在 30℃、200 rpm 摇床培养48 h 后进行DSF的提取和 HPLC 测定 DSF 残余量。

[0059] DSF 的提取方法：每个样品取 5 mL 至 15 mL 离心管中，4000 rpm 离心 5 min，取上清液转移到 50 mL 分液漏斗中，向分液漏斗中加入 5 mL 乙酸乙酯，摇匀，剧烈震荡 3min，静置，分层，弃去下层溶液至 15 mL 离心管中，上层液经漏斗过滤到 50 mL 圆底烧瓶中，漏斗中铺有滤纸。下层溶液按上述方法再萃取 1 次。滤液并入圆底烧瓶，50℃恒温浓缩蒸干，用色谱甲醇分2 次洗涤圆底烧瓶，定容至 2 mL，经 0.45 μM 有机滤膜过滤至进样瓶，使用 HPLC 法测定其残余量。

[0060] HPLC测定 DSF残余量条件：C18反向色谱柱，流速为1 mL/min，柱温为35℃，流动相为甲醇：水=80：20（ν：ν），检测波长为 210 nm，进样量 20 μL，样品运行时间20min。

[0061] 按照下式计算 DSF 降解率：降解率（%）=（1-A1/A0）×100，A1为淬灭菌处理后 DSF 残留浓度，A0为对照处理后的 DSF 残留浓度。

[0062] 最终获得 DSF 降解率最高的菌株，命名为 F15Y。

[0063] 2、菌株 F15Y 的鉴定及系统进化分析

[0064] （1）菌落形态特征：将上述菌株 F15Y 划线于 LB 固体培养基，于 30℃培养 48 h。如图 1 所示，菌落颜色呈淡黄绿色，菌落稍隆起，表明光滑不透明，边缘整齐。菌株 F15Y 在 LB 液体培养基中呈扩散性混浊，好氧。

[0065] （2）菌体形态特征：如图 2 所示，细胞呈杆状，或近球形，大小为(2.0～2.6)×(2.6～3.2)μm。

[0066] （3）16S rDNA 序列及系统进化分析：

[0067] 获得菌株 F15Y 的 16S rDNA 基因序列，长度为 1433bp，然后与 NCBI 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，发现所述菌株 F15Y 与Acinetobacter seifertii strain LUH 1472 (NR 134684.1)具有较高的同源性，相似度达到 100%，其系统进化树如图 3所示。

[0068] 综上所述，通过对菌株 F15Y 的形态学特征、16S rDNA 基因序列的鉴定及 系统进化树分析，将菌株鉴定为不动杆菌（Acinetobacter seifertii），并于 2018 年8 月 28 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为是GDMCC No：60440，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0069] 实施例 2 菌株 F15Y的抗生素敏感性分析

[0070] 为了能够更好地研究实施例 1 所获得菌株 F15Y 的生防潜力，我们对该菌株 F15Y 的抗生素敏感性进行了研究。如图 4所示，该菌株F15Y 对羧苄青霉素（CARB）的抗性-1  -1达到 400 μg·mL 或以上，对氨苄青霉素（AMP）的抗性达到300 μg·mL  或以上，对庆大霉素（GEN）、氯霉素（CM）、卡那霉素（KAN）、链霉素（STR）、硫酸新霉素（NEO）的抗性达到50 μg·mL-1。

[0071] 这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为防治植物病害的参考。

[0072] 实施例 3 菌株 F15Y生长和降解 DSF关系曲线的测定

[0073] 1、挑取菌株 F15Y 单菌落接种于 LB 培养基中预培养至对数期，所得菌液于 4000 rpm 离心 5 min 后，弃去上清液，菌体用 0.9%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以 1：100 的接种量接种到 50 mL MSM 基础培养基中，并添加 DSF 母液，使其最终浓度为 2 mM，30℃，200 rpm 下培养 24 h，定时取样。采集不同时间点的样品，进行分光光度计测定 OD600 值表示菌株 F15Y 的生长情况，HPLC 测定 DSF 的残留量表示菌株 F15Y 对 DSF 的降解情况。

[0074] 2、HPLC 检测结果如图 5所示（其中图 A 为未接种菌株 F15Y 的对照图，图 B、C、D、E 、F、G为菌株 F15Y 对 DSF0 h、 6 h、 12 h、 18 h、24 h 、30h、36h降解图），在 6 h、12 h、18 h、24 h 菌株 F15Y 对 DSF 降解率分别达到 26.22%、37.38%、44.29%和 100%。

[0075] 由图 6可知，DSF 的降解与菌株生长呈正相关，在 DSF 的存在下，菌株生长没有滞留期，迅速进入生长对数期，6～18h 为菌株生长的对数期，此时该菌株对 DSF 的降解也最快，菌株培养至 24 h，DSF 完全分解。对照中 DSF 24 h 内的自然降解率不到 20%。

[0076] 结果表明，不动杆菌 F15Y 对 DSF 有显著且快速的降解作用，在防治 DSF介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。

[0077] 实施例 4 菌株 F15Y对萝卜黑腐病的生防效果研究

[0078] 1、本实施例以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc（Xanthomonas campestris pv.campestris）为例，研究菌株 F15Y 对依赖 DSF 致病的致病菌的生防效果。

[0079] 分别挑取菌株 F15Y 与依赖 DSF 致病的致病菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc 单菌落，分别接种于 LB 培养基中预培养至对数期，所得菌液于 4000 rpm 离心 5 min 后，弃去上清液，菌体用 0.9%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以 1： 100 的接种量接种到 LB 培养基中，30℃、200 rpm 培养至对数期，菌体用 PBS 缓冲液重悬至 OD600=1.0，得到菌株 F15Y 和Xcc 的菌悬液，两者菌悬液的OD600 都为 0.2。

[0080] 将菌株 F15Y 菌悬液与Xcc 菌悬液混匀得到混合菌液。另外白萝卜肉质根用蒸馏水清洗干净，待外表干燥进行切片，肉质根横切获取厚约 0.3 cm 的圆片，分别放入培养皿( 内置已用无菌水浸润的棉花)。取 100 μL 混合菌液，接种到萝卜肉质根切片上，用涂布棒将其涂匀，30℃培养 48 h，观察发病情况。单独接种Xcc和菌株 F15Y 的实验组分别作为阴性对照和空白对照。

[0081] 2、结果如图 7所示，菌株 F15Y 与Xcc 共同接种较单独接种 Xcc 时萝卜黑腐病病害程度明显减轻。实验结果表明，菌株 F15Y 对Xcc 引起的黑腐病具有显著的生防效果。

[0082] 实施例 5 菌株 F15Y对马铃薯黑腐病的生防效果研究

[0083] 1、本实施例以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc（Xanthomonas campestris pv.campestris）为例，研究菌株 F15Y 对依赖 DSF 致病的致病菌的生防效果。马铃薯块茎用蒸馏水清洗干净，进行切片，获取厚约 0.5cm 的圆片，用蒸馏水洗去淀粉，放在接种盘上稍晾干后进行实验。接菌量为200 μL。混合菌液的配置、实验组设计和实验方法同上。

[0084] 2、结果如图8 所示，菌株 F15Y 与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc 共同接种较单独接种 Xcc 时马铃薯黑腐病病害程度明显减轻。实验结果表明，菌株F15Y 对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc 引起的马铃薯黑腐病同样具有显著的生防效果。

[0085] 实施例 6 菌株 F15Y对 AHLs 的降解测定

[0086] 1、本实施例对降解菌株 F15Y 底物谱进行了分析，测定其对信号分子 AHLs 的降解能力。将 F15Y 活化后，挑取单菌落接种至液体LB 培养基中，以30 ℃、200 rpm 的条件过夜培养后，取一个 OD600 的 F15Y 菌体，接种到以AHLs（浓度为20 μM ）为唯一碳源的MSM 无机盐培养基中培养24 h 后，取 5 μL 反应混合物点样至 1 cm 宽的MM 琼脂条顶端，然后在下方点一排可以检测 AHLs 的报告菌株CF11 (Agrobacterium tumefaciens NT1)。其中MM 琼脂条的pH 为 6.5，琼脂条中含有 40 μg/mL 的 X-gal 。将 MM 点好样本和报告菌株的琼脂条放置在28 ℃ 培养箱，避光培养 24 h 后观察实验结果。

[0087] 2、当报告菌株CF11 (Agrobacterium tumefaciens NT1) 检测到琼脂条中含有AHLs 时，CF11 向环境分泌 环境半乳糖苷酶，可以将 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β哚D-半乳糖苷）降解为半乳糖和深蓝色物质 5-溴-4-靛蓝， 5-溴-4-靛蓝可使整个报告菌株变成蓝色。 AHLs 可以在琼脂条上扩散，而且扩散距离与其浓度成正比。因此，根据琼脂条上报告菌株自顶端变蓝的距离可以判断出样本中 AHLs 含量的多少。

[0088] 3、结果如图9所示，不含有F15Y 的3OC6HSL、3OC8HSL 和3OC12HSL实验组（CK）的报告菌株均有变蓝，降解菌株 F15Y 分别与 3OC6HSL、3OC12HSL混合的实验组的报告菌株变蓝长度明显短于各自的CK，说明含有菌株 F15Y 的3OC6HSL、3OC12HSL 的含量均减少，即 F15Y 对 3OC6HSL、3OC12HSL 有良好的降解效果，而含有F15Y 的3OC8HSL实验组与不含有F15Y 的3OC8HSL实验组的报告菌株变蓝的距离没有明显的差距，即F15Y 对 3OC8HSL不具有降解活性。

[0089] 实施例 6 菌株 F15Y对马铃薯软腐病的生防效果研究

[0090] 1、本实施例以胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）为例，研究菌株 F15Y 对依赖 AHLs 致病的致病菌的生防效果。将降解菌株 F15Y、胡萝卜软腐果胶杆菌 Z3-3 用LB 固体板活化，于 30 ℃ 恒温生化培养箱培养 24 h，挑取单菌落接种至液体LB 培养基中，以30 ℃、200 rpm 的条件过夜培养后，将浑浊菌液调整至1×107 cfu/mL。将 Z3-3 分别与 F15Y 和 液体LB 培养基以一定比例混合，待用。另外马铃薯块茎用蒸馏水清洗干净，进行切片，获取厚约 0.5cm 的圆片，用蒸馏水洗去淀粉，放在接种盘上稍晾干。将 5μL 混合菌液分别接种到马铃薯上。即设置 F15Y＋LB，Z3-3 + LB，F15Y + Z3-3，LB 四个实验组。密封后于28℃ 生化培养培养箱，观察发病情况。

[0091] 2、结果如图10 所示，菌株 F15Y 与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 Z3-3（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）共同接种较单独接种 Z3-3时马铃薯软腐病病害程度明显减轻。实验结果表明，菌株F15Y 对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）引起的马铃薯软腐病具有显著的生防效果。

[0092] 实施例 7 菌株 F15Y对胡萝卜软腐病的生防效果研究

[0093] 1、本实施例以胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）为例，研究菌株 F15Y 对依赖 AHLs 致病的致病菌的生防效果。配制混合菌液的方法和步骤同实验例6。另外胡萝卜肉质根用蒸馏水清洗干净，进行切片，获取厚约0.7 cm 的圆片，放在接种盘上稍晾干。将 5μL 混合菌液分别接种到胡萝卜上。即设置 F15Y＋LB，Z3-3 + LB，F15Y + Z3-3，LB 四个实验组。密封后于28℃ 生化培养培养箱，观察发病情况。

[0094] 2、结果如图11 所示，菌株 F15Y 与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 Z3-3（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）共同接种较单独接种 Z3-3时胡萝卜软腐病病害程度明显减轻。实验结果表明，菌株F15Y 对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）引起的胡萝卜肉质根软腐病同样具有显著的生防效果。

[0095] 综上结果显示，本发明的不动杆菌菌株 F15Y具有 DSF 高降解活性，不动杆菌 F15Y 与野油菜黄单胞菌 Xcc 共同接种较单独接种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种Xcc（Xanthomonas campestris pv.campestris）时马铃薯块茎切片、萝卜肉质根切片黑腐病病害程度明显减轻，说明F15Y对黑腐病具有显著防治效果。

[0096] 同时，菌株F15Y对AHLs 信号分子：N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (OHHL, 3OC6HSL) 、N-(3-oxododecanoyl)-L-homoseine lactone (OdDHL, 3OC12HSL)均具有降解效果。将依赖 AHLs 的致病菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora,Pcc）与降解菌株 F15Y 共同接种于马铃薯块茎切片、胡萝卜肉质根切片，软腐病发病程度较单独接种Pcc的明显降低，说明 F15Y 对软腐病也具有显著的生防作用。

[0097] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。