一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法

摘要

本发明涉及一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，采用一类结构的吖啶磺酰胺，通过过氧化氢定量测定方法来考察不同稳定剂对过氧化氢的消耗能力，所述的稳定剂包括BSA、还原性氨基酸如甘氨酸、赖氨酸、组氨酸等，柠檬酸、TRIS缓冲液等具备还原性的物质。该方法极大地节省了筛选试剂稳定剂的工作强度和时间，检测快速高效，每次检测只需要几分钟即可完成，给化学发光试剂稳定剂的选择和用量上提供了参考依据。

权利要求

1.一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，

选定若干种稳定剂；

取体积为V1的一系列的C0-C1浓度范围的过氧化氢标准溶液，分别向其中加入高纯水和体积为V2、浓度为C2的化学发光检测试剂，并立即加入体积为V3、浓度为C3的激发液，分别收集一段时间内的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到标准曲线；

取与建立标准曲线时相同体积的C0-C1浓度范围内某一浓度的过氧化氢标准溶液若干份，份数至少为比稳定剂数量多1份，向其中一份过氧化氢标准溶液中加入与建立标准曲线过程中高纯水体积相同的高纯水，其余份过氧化氢标准溶液中加入与建立标准曲线过程中高纯水体积相同的某一种稳定剂，分别进行温育后,再分别加入体积为V2、浓度为C2的化学发光检测试剂，并立即加入与体积为V3、浓度为C3的激发液，分别收集与建立标准曲线过程中相同时间内的总光子数；将加入某一种稳定剂和高纯水后所测总光子数与建立的标准曲线进行比照，分别得到加入每一种稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率H2O2＝(C-C＇)/C*100％，计算得到每一种稳定剂下的过氧化氢的降解率；

根据每种稳定剂的降解率选择过氧化氢消耗能力合适的化学发光试剂稳定剂；

所述化学发光检测试剂为吖啶磺酰胺溶液，所述吖啶磺酰胺的结构式如下：

其中，R、R＇选自烷基及其取代物中的一种，X、X＇选自磺酰基、卤素、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。

2.根据权利要求1所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，V2·C2≥1.5(V1·C1)，且V2·C2＝(2-5)V3·C3。

3.根据权利要求1所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述吖啶磺酰胺为下述结构中的一种：

4.根据权利要求1所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述稳定剂为BSA、还原性氨基酸和还原性缓冲液中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述稳定剂为BSA、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、柠檬酸-Na2HPO4、柠檬酸-TRIS、MES-TRIS缓冲液中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述缓冲液为酸性。

7.根据权利要求1-6任一项所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述温育温度为37℃，时间为0.5h-240h。

8.根据权利要求1-6任一项所述的化学发光试剂稳定剂的筛选方法，其特征在于，所述总光子数的收集时间至少为5秒。

说明书

一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，属于化学分析技术领域。

背景技术

[0002] 化学发光发光免疫分析是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术，它具有选择性好、灵敏度高、特异性强、无放射性危害、分析速度快、设备简单等优点，在环境、临床、食品、药物检测等领域得到了广泛应用，成为免疫分析方法的研究热点和发展趋势。

[0003] 吖啶化合物作为一种化学发光免疫分析试剂的标记物，在化学发光发光免疫分析中得到了广泛的应用。吖啶化合物跟其他标记物(如放射元素标记、酶标记)相比，有许多重要优势，比如相对高的灵敏度，低成本、线性范围宽，相对简单的信号检测设备等。

[0004] 尽管吖啶化合物在化学发光免疫分析的使用中有诸多优势，但仍存在一些问题，尤其是此化学发光信号启动是由一个氧化反应启动的，而液体试剂中一些偶然的氧化剂如过氧化氢等的存在(例如试剂中的表面活性剂会自动生成过氧化氢，一些液体里本身也有少量的过氧化氢，另外试剂在生产、运输、储存的过程中也会产生过氧化氢)，对吖啶标记物有一个去稳定的作用。另外，化学发光免疫分析方法中使用的各种稳定试剂的组分，如免疫球蛋白、白蛋白等，含有氧化敏感的氨基酸如半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等，也能被过氧化氢氧化从而生物活性消失或改变。

[0005] 上述吖啶标记物或蛋白质活性的改变会导致试剂检测结果的准确性降低，因此，在优化试剂组分时有必要去除一些偶然的氧化剂如过氧化氢，但是现有技术在过氧化氢消耗试剂的选择和用量上尚没有参考依据，通常需要实时添加稳定剂以考察试剂的实时稳定性来考察稳定剂的过氧化氢消耗能力，但这需要长达数月甚至一到两年时间，因此需要建立一种快速测量方法来考察稳定剂的过氧化氢消耗能力，预先筛选出过氧化氢消耗能力合适的化学发光试剂稳定剂，为试剂稳定性研究提供指导依据。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术在过氧化氢消耗试剂的选择和用量上无参考依据的技术问题，提供一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，该方法通过对各种化学发光试剂稳定剂对过氧化氢的消耗能力进行检测，根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的化学发光试剂稳定剂，极大地节省了筛选化学发光试剂稳定剂的工作强度和时间。

[0007] 本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0008] 一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，包括以下步骤，

[0009] 选定若干种稳定剂；

[0010] 取体积为V1的一系列的C0-C1浓度范围的过氧化氢标准溶液，分别向其中加入高纯水和体积为V2、浓度为C2的化学发光检测试剂，并立即加入体积为V3、浓度为C3的激发液，分别收集一段时间内的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到标准曲线；

[0011] 取与建立标准曲线时相同体积的C0-C1浓度范围内某一浓度的过氧化氢标准溶液若干份，份数至少为比稳定剂数量多1份，向其中一份过氧化氢标准溶液中加入与建立标准曲线过程中高纯水体积相同的高纯水，其余份过氧化氢标准溶液中加入与建立标准曲线过程中高纯水体积相同的某一种稳定剂，分别进行温育后,再分别加入体积为V2、浓度为C2的化学发光检测试剂，并立即加入与体积为V3、浓度为C3的激发液，分别收集与建立标准曲线过程中相同时间内的总光子数；将加入某一种稳定剂和高纯水后所测总光子数与建立的标准曲线进行比照，分别得到加入每一种稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率(H2O2)＝(C-C＇)/C*100％，计算得到每一种稳定剂的过氧化氢降解率；

[0012] 根据每种稳定剂的过氧化氢降解率选择过氧化氢消耗能力合适的化学发光试剂稳定剂。

[0013] 优选地，V2·C2≥1.5(V1·C1)，且V2·C2＝(2-5)V3·C3。

[0014] 优选地，所述化学发光检测试剂为吖啶磺酰胺溶液，所述吖啶磺酰胺的结构式中如下：

[0015]

[0016] 其中，R、R＇选自烷基及其取代物中的一种，X、X＇选自磺酰基、卤素、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。

[0017] 优选地，所述吖啶磺酰胺为下述结构中的一种：

[0018]

[0019]

[0020] 优选地，所述稳定剂为BSA、还原性氨基酸和还原性缓冲液中的一种或几种。

[0021] 优选地，所述稳定剂为BSA、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、PB、柠檬酸-Na2HPO4、柠檬酸-TRIS、MES-TRIS、MES-NaOH缓冲液中的一种或几种。

[0022] 优选地，所述缓冲液为酸性。

[0023] 优选地，所述温育温度为37℃，时间为0.5h-240h。

[0024] 优选地，所述D至少为5秒。

[0025] 本发明的有益效果是：

[0026] (1)本发明的化学发光试剂稳定剂的筛选方法首先选定若干种化学发光试剂稳定剂，对每个化学发光试剂稳定剂对过氧化氢的消耗能力进行检测，根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的化学发光试剂稳定剂。该方法极大地节省了筛选试剂稳定剂的工作强度和时间，检测快速高效，给化学发光试剂稳定剂的选择和用量上提供了参考依据。

[0027] (2)本发明的化学发光试剂稳定剂的筛选方法在测定过氧化氢的消耗率时，由于加稳定剂和不加稳定剂，溶液的pH有所变化，而标准曲线是在不加稳定剂时做出的，本发明采用一类结构的吖啶磺酰胺适用于测定加稳定剂后的不同pH溶液的过氧化氢含量，测定结果准确。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] 本实施例提供一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，包括以下步骤,选定甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和谷氨酸等氨基酸作为化学发光试剂稳定剂，对每个氨基酸对过氧化氢的降解率进行检测，根据检测结果可以选择过氧化氢消耗能力合适的氨基酸，所述不同氨基酸对过氧化氢消耗能力的检测步骤如下：

[0030] 取50μL浓度为2.5μM、10μM、40μM、100μM、250μM的过氧化氢标准溶液，向其中加入体积为50μL高纯水和50μL浓度为2M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入100μL浓度为0.25M的氢氧化钠溶液，分别收集5S的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到线性标准曲线，y＝10658x+5963.1,R2＝0.9998；

[0031] 取50μL浓度为10μM的过氧化氢标准溶液两份，向其中一份加入50μL浓度为1％的氨基酸，另一份加入50μL高纯水作为对照，分别于37℃下温育0.5h、12h、24h、72h、240h后,加入50μL浓度为2M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入100μL浓度为0.25M的氢氧化钠溶液，分别收集5S后的总光子数；

[0032] 将检测步骤中所测总光子数与建立的线性标准曲线进行对照，通过计算得到加入稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率(H2O2)＝(C-C＇)/C*100％，计算得到过氧化氢的降解率。

[0033] 所述吖啶磺酰胺的结构式中如下：

[0034]

[0035] 各种氨基酸在不同温育时间下的降解率结果如下表：

[0036]

[0037] 由上表可以看出，实验选取的氨基酸稳定剂都具备一定的过氧化氢消耗能力，其中，甘氨酸、赖氨酸和组氨酸均显示较强的过氧化氢消耗能力，而谷氨酸对过氧化氢的降解能力较弱。实际可根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的氨基酸，比如，当需要过氧化物消耗能力较强时，可以选择甘氨酸、赖氨酸和组氨酸作为稳定剂，当需要过氧化物消耗能力较弱时，可以选择谷氨酸作为稳定剂。

[0038] 实施例2

[0039] 本实施例提供一种化学发光试剂稳定剂的筛选方法，包括以下步骤,选定0.1M PB(pH＝6.8)、0.1M柠檬酸-Na2HPO4(pH＝6.8)、0.1M柠檬酸-TRIS(pH＝6.8)、0.1M MES-TRIS(pH＝6.8)、0.1M MES-NaOH(pH＝6.8)等缓冲液作为化学发光试剂稳定剂，对每种缓冲液对过氧化氢的消耗能力进行检测，根据检测结果可以选择过氧化氢消耗能力合适的缓冲液，所述不同缓冲液对过氧化氢消耗能力的检测步骤如下：

[0040] 取100μL浓度为2.5μM、10μM、40μM、100μM、250μM的过氧化氢标准溶液，向其中加入体积为150μL高纯水和150μL浓度为1M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入50μL浓度为0.6M的氢氧化钠溶液，分别收集5S的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到线性标准曲线，y＝15628x+4543.2,R2＝0.9999；

[0041] 取100μL浓度为10μM的过氧化氢标准溶液两份，向其中一份加入150μL浓度为0.1M的缓冲液，另一份加入150μL高纯水作为对照，分别于37℃下温育0.5h、12h、24h、72h、240h后,加入150μL浓度为1M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入50μL浓度为0.6M的氢氧化钠溶液，分别收集5S后的总光子数；

[0042] 将检测步骤中所测总光子数与建立的线性标准曲线进行对照，通过计算得到加入稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率(H2O2)＝(C-C＇)/C*100％，计算得到过氧化氢的降解率。

[0043] 所述吖啶磺酰胺的结构式中如下：

[0044]

[0045] 各种缓冲液在不同温育时间下的降解率结果如下表：

[0046]

[0047] 由于吖啶磺酰胺本身在碱性环境下不稳定，所以选取能稳定发光试剂的缓冲液都偏酸性。由上表可以看出，实验选取的缓冲液中PB和MES-NaOH两种缓冲液不能消耗过氧化氢，柠檬酸-Na2HPO4、柠檬酸-TRIS显示出较强的过氧化氢消耗能力，而MES-TRIS对过氧化氢的降解能力相对较弱。实际可根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的缓冲液，比如，当需要过氧化物消耗能力较强时，可以选择柠檬酸-Na2HPO4、柠檬酸-TRIS作为稳定剂，当需要过氧化物消耗能力较弱时，可以选择MES-TRIS作为稳定剂。

[0048] 实施例3

[0049] 为考察不同浓度稳定剂对过氧化氢的消耗能力，本实施例以BSA作为稳定剂为例，选定不同浓度BSA对过氧化氢的消耗能力进行检测，根据检测结果可以选择过氧化氢消耗能力合适的一定浓度的稳定剂，所述不同浓度BSA对过氧化氢消耗能力的检测步骤如下：

[0050] 取150μL浓度为2.5μM、10μM、40μM、100μM、250μM的过氧化氢标准溶液，向其中加入体积为100μL高纯水和100μL浓度为0.5625M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入150μL浓度为0.1875M的氢氧化钠溶液，分别收集5S的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到线性标准曲线，y＝6758x+6356.5,R2＝0.9998；

[0051] 取150μL浓度为40μM的过氧化氢标准溶液两份，向其中一份加入100μL0.1％-10％浓度范围的BSA，另一份加入100μL高纯水作为对照，分别于37℃下温育0.5h、12h、24h、72h、240h后,加入100μL浓度为0.5625M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入150μL浓度为0.1875M的氢氧化钠溶液，分别收集5S后的总光子数；

[0052] 将检测步骤中所测总光子数与建立的线性标准曲线进行对照，通过计算得到加入稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率(H2O2)＝(C-C＇)/C*100％，计算得到过氧化氢的降解率。

[0053] 所述吖啶磺酰胺的结构式中如下：

[0054]

[0055] 不同浓度的BSA在不同温育时间下的降解率结果如下表：

[0056]

[0057] BSA是牛血清中的球蛋白，因为表面含有还原性的半胱氨酸残基而具有还原性，所以能消耗溶液中的过氧化氢而保护发光试剂的稳定性。由上表可以看出，从结果可见，相同温育时间下，BSA浓度越高,对过氧化氢的降解率越高。实际可根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的稳定剂，比如，当需要过氧化物消耗能力较强时，可以选择较高浓度的稳定剂，当需要过氧化物消耗能力较弱时，可以选择较低浓度的稳定剂。

[0058] 实施例4

[0059] 为考察稳定剂对不同浓度过氧化氢的消耗能力，本实施例以BSA作为稳定剂为例，选定1％BSA对2.5μM-250μM过氧化氢的消耗能力进行检测，根据检测结果可根据过氧化氢的浓度选择过氧化氢消耗能力合适的一定浓度和种类的稳定剂，所述1％BSA对2.5μM-250μM过氧化氢的消耗能力的检测步骤如下：

[0060] 取50μL浓度为2.5μM、10μM、40μM、100μM、250μM的过氧化氢标准溶液，向其中加入体积为50μL高纯水和50μL浓度为2M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入100μL浓度为0.35M的氢氧化钠溶液，分别收集5S的总光子数，通过总光子数与过氧化氢标准溶液的浓度之间的对应关系得到线性标准曲线，y＝11028x+5375.4,R2＝0.9998；

[0061] 取50μL浓度为2.5μM、10μM、40μM、100μM、250μM过氧化氢标准溶液各两份，向相同浓度的其中一份过氧化氢标准溶液加入50μL浓度为1％的BSA，另一份加入50μL高纯水作为对照，分别于37℃下温育0.5h、12h、24h、72h、240h后,加入50μL浓度为2M的吖啶磺酰胺溶液，并立即加入100μL浓度为0.25M的氢氧化钠溶液，分别收集5S后的总光子数；

[0062] 将检测步骤中所测总光子数与建立的线性标准曲线进行对照，通过计算得到加入稳定剂后的过氧化氢浓度C＇和未加稳定剂的过氧化氢浓度C，根据公式降解率(H2O2)＝(C-C＇)/C*100％，计算得到过氧化氢的降解率。

[0063] 所述吖啶磺酰胺的结构式中如下：

[0064]

[0065] 不同浓度的过氧化氢标准溶液在不同温育时间下的降解率结果如下表：

[0066]

[0067] 由上表可以看出，BSA对过氧化氢的消耗是一个逐渐进行的过程，过氧化氢浓度越高，稳定剂BSA对过氧化氢的降解速率越慢。实际可根据检测结果选择过氧化氢消耗能力合适的稳定剂，比如，当化学发光试剂中过氧化氢含量较高时，可以选择较高浓度过氧化物消耗能力较强的稳定剂，当化学发光试剂中过氧化氢含量较低时，可以选择较低浓度过氧化物消耗能力较弱的稳定剂。

[0068] 本发明采用一类结构的吖啶磺酰胺，通过过氧化氢定量分析方法来测定稳定剂对过氧化氢的消耗能力，由于加稳定剂和不加稳定剂，溶液的pH有所变化，而标准曲线是在不加稳定剂时做出的，采用本发明所用的吖啶磺酰胺适用于测定加稳定剂后的不同pH溶液的过氧化氢含量。

[0069] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。