一种基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽及其应用

摘要

本发明公开了一种基于蛋白结构域重建的新型PTH(1‑34)模拟肽，该模拟肽含有第29‑34位肽片段重复，且该模拟肽第34位以及第29‑34位重复肽片段的最后一位氨基酸，由苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe，F)改变成为酪氨酸(Tyrosine，Tyr，Y)，形成MY‑3肽，临床前期试验表明，该MY‑3模拟肽能促进成骨细胞分化，具有很好的治疗骨质疏松和促进骨生长的效果，其抗骨质疏松效果优于PTH(1‑34)(目前市场上的产品名复泰奥或特立帕肽)，具有显著的临床应用前景。

权利要求

1.一种基于蛋白结构域重建的新型PTH(1-34)模拟肽，其特征在于，所述模拟肽氨基酸序列为：SEQ ID NO.3。

2.权利要求1所述模拟肽在制备防治骨质疏松症药物中的应用。

3.一种防治骨质疏松症和促进骨生长的药物，其特征在于，其活性成份含有权利要求1所述的基于蛋白结构域重建的新型PTH(1-34)模拟肽。

说明书

一种基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽及其应用。

背景技术

[0002] 骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，具有低骨量、骨组织微观结构退化以及增加的骨脆性和易于骨折的特征。严重影响老年人群身体健康和生命存在的常见疾病。目前，治疗骨质疏松的常见药物包括抗骨吸收药物和促骨合成药物，前者不能有效提高骨质量，需要长期用药，后者能较快提高骨质量，预防骨折的发生，尤其对重度骨质疏松效果明显。

[0003] 甲状旁腺素(PTH)是由甲状旁腺分泌的一种多肽激素，是生物体内调节钙、磷代谢平衡的一种重要因子。特立帕肽(PTH(1-34))是天然甲状旁腺素的氨基端多肽片段，是目前上市的唯一的促骨合成药物，大量的临床应用证明了其独特的有效性，可用于重度骨质疏松，以及骨折的愈合。总体上讲，特立帕肽可以使椎体骨折发生率下降约76％，对髋关节骨折的预防效果还没有明确的定论。所以开发更好的抗骨质疏松药物仍有良好的前景。

[0004] 由于PTH(1-34)能够激活多个信号通路，兼具促骨合成和促骨吸收的作用，其净效果在小剂量间断使用时表现为骨合成，大剂量持续使用时净效果为促进骨吸收。如何提高其骨合成能力，降低甚至阻断其骨吸收能力是开发更高效抗骨质疏松药物的一般思维。但最近在硬化素抗体的研究中发现，如果抑制了骨代谢中的骨吸收元素，其促进成骨的效应也不持久，因为骨合成与骨吸收是骨代谢过程中相辅相成的两个环节。

[0005] 我们的前期研究发现重复PTH的29-34肽片段，可以特异性激活PLC非依赖的PKC信号转导途径，促进成骨而不促进破骨，因此，我们设计了一个基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽，保留其原有的促破骨功能，而增加其成骨功能，得到很好的体外和体内研究结果。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽，该模拟肽能促进成骨细胞分化，具有很好的治疗骨质疏松的效果，具有显著的临床应用前景。

[0007] 实现上述目的的技术方案如下：

[0008] 一种基于蛋白结构域重建的新型PTH(1-34)模拟肽，所述模拟肽含有第29-34位肽片段重复。

[0009] 在其中一个实施例中，所述第29-34位肽片段重复次数为1次，所述模拟肽序列构成为：PTH(1-34)(29-34)，氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

[0010] 在其中一个实施例中，所述第29-34位肽片段重复次数为1次，所述模拟肽的第34位以及第29-34位重复肽片段的最后一位氨基酸，由苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe，F)改变F Y F Y成为酪氨酸(Tyrosine，Tyr，Y)，所述模拟肽序列构成为：PTH(1-34)(29-34)，氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，简称：MY-3肽。

[0011] 在其中一个实施例中，所述第29-34位肽片段重复次数为1次，所述模拟肽N端裁剪两个氨基酸，第34位以及第29-34位重复肽片段的最后一位氨基酸，由苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe，F)改变成为酪氨酸(Tyrosine，Tyr，Y)。所述模拟肽序列构成为：PTH(3-F34Y)(29-F34Y)，氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，简称：MY-1肽。

[0012] 本发明的另一个目的在于上述甲状旁腺素模拟肽在制备防治骨质疏松症的药物中的应用。

[0013] 本发明的另一个目的在于提供一种防治骨质疏松症和促进骨生长的药物，该药物活性成份含有上述甲状旁腺素模拟肽。

[0014] 本发明的有益效果在于：

[0015] 1.细胞实验证明，本发明所述的MY-3肽具有强于PTH(1-34)的促进成骨细胞分化的效果，其促破骨效应不高于PTH(1-34)。

[0016] 2.动物实验证明，MY-3肽具有强于PTH(1-34)的预防骨质疏松作用，该PTH模拟肽具有更好的治疗骨质疏松症的临床药用价值。附图说明：

[0017] 图1是实施例1中，间断刺激时，MY-3具有较PTH(1-34)强的促成骨细胞分化作用，二者具有相同的促破骨细胞分化作用。

[0018] 图2是实施例2中，连续刺激时MY-3具有较PTH(1-34)弱的抑制成骨细胞分化作用，二者具有相同的促破骨细胞分化作用。

[0019] 图3是实施例3中，MY-3具有较PTH(1-34)强的促成骨基因表达作用，二者具有相同的促破骨细胞分化基因的表达作用。

[0020] 图4是实施例4中，MY-3具有强于PTH(1-34)的防骨丢失作用--显微CT观察。

[0021] 图5是实例5中，MY-3具有强于PTH(1-34)的防骨丢失作用--组织学研究具体实施方式

[0022] 下面对本发明的实施例进行详细说明。

[0023] 本发明提供了一种基于蛋白结构域重建的新型PTH模拟肽，即氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PTH模拟肽(MY-3肽)。MY-3肽是在天然PTH(1-34)SEQ ID NO.1的基础上改造形成的，先将第29-34位肽片段重复1次，然后将模拟肽的第34位以及第29-34位重复肽片段的最后一位氨基酸，由苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe，F)改变成为酪氨酸(Tyrosine，Tyr，Y)。改变后，MY-3肽促进骨合成的能力增强。

[0024] 表1 PTH模拟肽的氨基酸序列

[0025]

[0026] 实施例1间断刺激时MY-3具有较PTH(1-34)强的促成骨细胞分化作用，二者具有相同的促破骨细胞分化作用

[0027] 从新生小鼠颅骨分离成骨细胞，体外培养。1x105/孔的密度接种于24孔培养板，3天后开始4h/48h间断性PTH模拟肽刺激实验，即将PTH模拟肽以相应的浓度加入培养体系(含10％血清+α-MEM培养基)，4小时后吸出培养液，α-MEM培养基轻柔洗贴壁细胞一次，换成10％血清+α-MEM培养基并继续培养44小时；如此循环往复。浓度：MY-1肽10-6M，PTH(1-34)肽
10-8M，MY-3肽10-8M。

[0028] 2周后进行碱性磷酸酶染色，4周后进行钙结节染色(图1A，上两排孔)。并定量检测每孔碱性磷酸酶的表达量和钙离子浓度(图1B，C)。发现PTH(1-34)，MY-1肽和MY-3肽可促进成骨细胞的成骨分化，MY-3明显强于PTH(1-34)。

[0029] 提取7周龄小鼠股骨骨髓腔内的骨髓细胞，接种于24孔板，密度1x105/孔。如前述方法进行4h/48h间断性PTH模拟肽刺激实验。7天后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP，破骨细胞标志酶)染色(图1最下一排孔)和定量(图1D)。显示MY-1肽不促进破骨细胞的产生，MY-3肽和PTH(1-34)具有同样促破骨细胞形成作用。

[0030] 表1图1B，C，D涉及数据

[0031]

[0032] 实施例1结果如图1所示，小鼠颅骨原代成骨细胞(A上两排孔)接受PTH(1-34)，MY-3和MY-1间断作用(48小时内，PTH肽加入培养基4小时后去除，然后以普通培养基培养44小时，如此周而复始)，2周时进行细胞培养孔内碱性磷酸酶(ALP)染色(A)和定量(B)，4周时进行培养孔内钙结节染色(A)和钙离子定量(C)。小鼠股骨干骨髓腔内骨髓细胞(A下排孔)接受上述三种肽的同样处理，2周后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色(A)和定量(D)。上述直方图显示的一次独立实验(三复孔)的平均值与标准差，同样的实验重复了三次，获得同样的结果。*P<0.05vs对照组(CON)，#P<0.05vs PTH(1-34)。

[0033] 实施例2：连续刺激时MY-3具有较PTH(1-34)弱的抑制成骨细胞分化作用，二者具有相同的促破骨细胞分化作用

[0034] 从新生小鼠颅骨分离成骨细胞，体外培养。1x105/孔的密度接种于24孔培养板，3天后开始连续PTH模拟肽刺激实验，将PTH模拟肽以相应的浓度加入培养体系(含10％血清+α-MEM培养基)，48小时后更换培养基时加入新的PTH模拟肽，即PTH模拟肽始终处于培养液内。浓度：MY-1肽10-6M，PTH(1-34)肽10-8M，MY-3肽10-8M。2周后进行碱性磷酸酶染色，4周后进行钙结节染色(图2A，上两排孔)。并定量检测每孔碱性磷酸酶的表达量和钙离子浓度(图2B，C)。发现PTH(1-34)，MY-1肽促进成骨细胞的成骨分化，MY-3和PTH(1-34)，抑制成骨细胞的分化，MY-3肽的抑制效能较弱。

[0035] 提取7周龄小鼠股骨骨髓腔内的骨髓细胞，接种于24孔板，密度1x105/孔。如前述方法进行48h连续性PTH模拟肽刺激实验。7天后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP，破骨细胞标志酶)染色(图2最下一排孔)和定量(图2D)。显示MY-1肽不促进破骨细胞的产生，MY-3肽和PTH(1-34)具有同样促破骨细胞形成作用。

[0036] 表2图2B、C、D涉及数据

[0037]

[0038] 实施例2结果如图2所示，小鼠颅骨原代成骨细胞(A上两排孔)接受PTH(1-34)，MY-3和MY-1连续作用(48小时的培养周期内，PTH肽始终停留在培养基内)，2周时进行细胞培养孔内碱性磷酸酶(ALP)染色(A)和定量(B)，4周时进行培养孔内钙结节染色(A)和钙离子定量(C)。小鼠股骨干骨髓腔内骨髓细胞(A下排孔)接受上述三种肽的同样处理，2周后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色(A)和定量(D)。上述直方图显示的一次独立实验(三复孔)的平均值与标准差，同样的实验重复了三次，获得同样的结果。*P<0.05vs对照组(CON)，#P<
0.05vs PTH(1-34)。

[0039] 实施例3：MY-3具有较PTH(1-34)强的促成骨基因表达作用，二者具有相同的促破骨细胞分化基因的表达作用

[0040] 原代小鼠颅骨成骨细胞(图3A和图3B)以及小鼠骨髓细胞(图3C和图3D)培养于细胞培养板内。等细胞生长完全覆盖培养孔底部时，改用含1％胎牛血清的培养基，加入不同浓度的PTH模拟肽(浓度同前述)，接受间断刺激的细胞(图3A和图3C)使用4小时PTH肽，44小时换用普通培养基的方法，共3个48小时循环。末次PTH肽刺激后4小时提取细胞RNA做Realtime PCR检测。接受连续刺激的细胞(图3B和图3D)PTH肽停留在培养基内，48小时更换含肽的培养基一次，连续3次，末次PTH肽刺激48小时后提取细胞RNA做Realtime PCR检测。如图显示的一次独立实验(三复孔)的平均值与标准差，同样的实验重复了三次，获得同样的结果。*P<0.05vs对照组(CON)，#P<0.05vs PTH(1-34)。

[0041] 可见，间断刺激PTH(1-34)，MY-1肽，MY-3肽都可以促进成骨标志基因ALP，OC的表达，MY-3对ALP和OC基因的刺激效应较PTH(1-34)强。MY-3对破骨基因RANKL刺激效果较PTH(1-34)弱(图3C)。连续刺激骨髓细胞时(图3D)，MY-3和PTH(1-34)均抑制ALP，OC的表达。二者同样显著地促进RANKL表达。

[0042] 实施例4：MY-3具有强于PTH(1-34)的防骨丢失作用--显微CT观察

[0043] 我们将7周龄C57BL雌性小鼠摘除卵巢，制作骨质疏松模型。将PTH(3-34)(400μg/kg/日)，MY-1肽(400μg/kg/日)，PTH(1-34)(40μg/kg/日)，MY-3肽(40μg/kg/日)分别进行每天皮下注射(每周5天)，于2周和4周处死小鼠，分离胫骨，使用显微CT测量胫骨骨松质骨量(BV/TV)和骨密度(BMD)(图4)。表中所示为8只小鼠骨量(BV/TV)与BMD的平均值与标准误，*P<0.05vs对照组(CON)，#P<0.05vs PTH(1-34).图像显示胫骨上端骨松质的显微CT三维重建图像。

[0044] 可以看出，MY-3肽具有较PTH(1-34)具有高的骨量(BV/TV)和骨密度(BMD)，具有明显较强的预防去势导致骨丢失的作用。

[0045] 实施例5：MY-3具有强于PTH(1-34)的防骨丢失作用--组织学研究

[0046] 骨质疏松动物模型的制作和PTH模拟肽的给药方法同实施例4。2周和4周后去实验小鼠的胫骨，脱钙，石蜡切片。破骨细胞染色。如图5，无论是2周还是4周，小鼠去势(OVX)后，骨小梁数目明显减少，PTH(1-34),MY-1和MY-3肽骨小梁较对照组增加，MY-3肽的效果较PTH(1-34)显著，与显微CT的结果一致。

[0047] 结果预示MY-3可能在未来成为有效的抗骨质疏松药物。而且MY-3具有较强的促骨合成功能，动物实验证明MY-3较PTH(1-34)的作用显著，有可能成为最强的抗骨质疏松药物。

[0048] 以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。