具有治疗结肠直肠癌能力的戊糖乳杆菌05B0100分离株及其用途

摘要

本发明涉及具有治疗结肠直肠癌能力的戊糖乳杆菌05B0100分离株及其用途。本发明揭示一株戊糖乳杆菌05B0100分离株，它以寄存编号BCRC 910783被寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心(DSMZ)。所述戊糖乳杆菌05B0100分离株的发酵培养物可被用来治疗结肠直肠癌。

权利要求

1.一种组成物，其特征在于，所述组成物包含有戊糖乳杆菌05B0100的液态发酵培养物，其中，所述液态发酵培养物是通过将戊糖乳杆菌05B0100培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中而被获得，所述戊糖乳杆菌05B0100以寄存编号BCRC 910783被寄存于财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的组成物，其特征在于，所述液态发酵培养物是不含有菌体的液体。

3.根据权利要求2所述的组成物，其特征在于，所述液态发酵培养物进一步被进行乙醇萃取处理，而得到经乙醇萃取的产物。

4.根据权利要求1所述的组成物，其特征在于，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。

5.根据权利要求1所述的组成物，其特征在于，所述组成物被制造成医药品或食品产品的形式。

6.根据权利要求5所述的组成物，其特征在于，所述医药品呈供口服给药的剂型。

7.根据权利要求5所述的组成物，其特征在于，所述医药品呈供非经肠道给药的剂型。

8.一种根据权利要求1所述的组成物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述液态发酵培养物是不含有菌体的液体。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述液态发酵培养物进一步被进行乙醇萃取处理，而得到经乙醇萃取的产物。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。

12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述医药品呈供口服给药的剂型。

13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述医药品呈供非经肠道给药的剂型。

14.一种用以制备戊糖乳杆菌菌株的发酵培养物的方法，其特征在于，所述方法包括将所述戊糖乳杆菌菌株培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中，所述戊糖乳杆菌菌株是戊糖乳杆菌05B0100，所述戊糖乳杆菌05B0100以寄存编号BCRC 910783被寄存于财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心，以及以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。

说明书

具有治疗结肠直肠癌能力的戊糖乳杆菌05B0100分离株及其

用途

【技术领域】

[0001] 本发明有关于一株具有治疗结肠直肠癌能力的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)05B0100分离株及其用途，它以寄存编号BCRC 910783被寄存于食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)，以及以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。所述戊糖乳杆菌05B0100分离株的发酵培养物(fermented culture)可被用来治疗结肠直肠癌(colorectal cancer)。
【背景技术】

[0002] 结肠直肠癌(colorectal cancer)[亦被称为结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)或肠癌(bowel cancer)]是一种由位于结肠(colon)、直肠(rectum)或阑尾(appendix)中的细胞的不正常增生(abnormal proliferation)所引起的癌症，它是中国台湾常见的癌症当中发病率最高者。虽然结肠直肠癌的形成机制尚未被完全了解，但是根据流行病学(epidemiology)的研究调查显示，结肠直肠癌的成因与生活饮食习惯具有高度的相关性，例如大量的脂肪(fat)、酒精(alcohol)或红肉(red meat)的摄取、肥胖(obesity)、吸烟(smoking)以及缺乏运动(lack of physical exercise)等都可能导致结肠直肠癌的发生。

[0003] 目前临床上用来治疗结肠直肠癌的药物有化学治疗药物(chemotherapy drug)[例如，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、益乐铂(Oxaliplatin)以及卡培他滨(Capecitabine)]以及靶向治疗药物(targeted therapy drug)[例如，贝伐单抗(Bevacizumab)以及西妥昔单抗(Cetuximab)]。然而，这些抗癌药物对于结肠直肠癌的治愈率(cure rate)仍相当有限，主要的原因包括：患者本身的个体差异、抗癌药物的严重副作用(side effect)以及癌细胞的抗药性(drug resistance)。因此，如何能有效地治疗结肠直肠癌并且不会产生非所欲的副作用，已经成为当今医药界关注与研究的重点。

[0004] 益生菌(probiotics)是一种有益于健康的活的微生物食品成分(microbial food ingredient)，可选择性地刺激肠道中的原生细菌(native bacteria)的生长。联合国粮食农业组织(Food and Agriculture organization of the United Nations,FAO)以及世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将益生菌定义为：活的微生物，当它呈适当数量来被给药时，可赋予宿主健康益处(health benefit)。目前可作为益生菌使用的微生物有许多种类，例如乳杆菌属(Lactobacillus)、双叉杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)、链球菌属(Streptococcus)等等，特别是前两个菌属的物种。

[0005] 已有报导指出，乳杆菌(Lactobacilli)能够刺激免疫反应(immune response)，并且有益于发炎(inflammation)、乳糖不耐症(lactose intolerance)以及胆固醇(cholesterol)的控制以及有助于下列疾病的预防：过敏(allergy)、呼吸道疾病(respiratory disease)、各种类型的腹泻(diarrhea)、发炎性肠疾(inflammatory bowel diseases)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Crohn's disease)、憩室炎(diverticulitis)、大肠激躁症(irritable bowel syndrome)、便秘(constipation)、肝病(liver diseases)、肺癌(lung cancer)、乳腺癌(mammary cancer)以及结肠直肠癌(colorectal cancer)。

[0006] 已知乳杆菌主要是通过下列7种机制来帮助宿主对抗结肠直肠癌：(1)改变肠道微生物群(intestinal microflora)的代谢活性(metabolic activities)；(2)改变结肠中的物化环境(physicochemical conditions)；(3)结合与降解潜在的致癌物(carcinogens)；(4)改变肠道微生物群的数量或性质；(5)生成抗-致肿瘤性的或抗-突变的化合物(anti-tumorigenic or anti-mutagenic compounds)；(6)提升宿主的免疫反应(immune response)；以及(7)影响宿主的生理(physiology)。

[0007] 基于乳杆菌具有上述的有益性质，本领域中的相关研究人员致力于开发具有抗结肠直肠癌能力的乳杆菌分离株。例如，在Thirabunyanon  M.et al.(2009),Biotechnol.Lett.,31:571-576中，Thirabunyanon M.等人从发酵乳中分离出发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)RM28，所述菌株经由酸与胆盐的耐受性分析(acid and bile salt tolerance assay)而被发现能够分别在pH值为2.5的PBS中以及含有0.3％(w/v)胆盐的MRS肉汤培养基(MRS broth)中存活，并且经由附着性分析(adhesion assay)而被发现对于结肠癌细胞(colon cancer cell)Caco-2展现良好的附着能力(adhesion activity)。此外，在结肠癌细胞的抗增生试验中，在将所述菌株的培养物进行离心与过滤后所得到的培养基(cultured medium,CM)以及活的全细胞(live whole cells)皆被发现可以抑制结肠癌细胞Caco-2的生长。

[0008] 在Asha and Gayathri D.(2012),Exp.Ther.Med.,3:1049-1054中，Asha以及Gayathri D.从凝乳(curd)中分离出发酵乳杆菌以及胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并且探讨在使用1,2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine)来诱发在小鼠中的结肠直肠癌形成(colorectal carcinogenesis)之前或之后，发酵乳杆菌、胚芽乳杆菌以及长春新碱(vincristine)[它是一种被用于癌症化学治疗(cancer chemotherapy)的生物碱(alkaloids)]这三者的单独给药或组合给药对于结肠直肠癌的控制效用。而实验结果显示，无论是单独给药或组合给药，皆需于诱导结肠直肠癌形成之前进行才能展现明显的有益效用，而其中发酵乳杆菌与长春新碱的组合给药具有较佳的活性。

[0009] 虽然已存在上述文献报导，申请人仍积极致力于筛选出具有抗结肠直肠癌能力的微生物。经研究，申请人分离出一株细菌分离株(它后来经过特征鉴定而被命名为戊糖乳杆菌05B0100)，并且由它的发酵培养物(fermented culture)所分离出的培养滤液(culture filtrate)以及所述培养滤液的经乙醇萃取的产物能够有效地抑制结肠直肠癌细胞的生长。因此，所述菌株的发酵培养物被预期可供用于治疗结肠直肠癌。【发明内容】

[0010] 于是，在第一个方面，本发明提供一种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)05B0100分离株，其以寄存编号BCRC 910783被寄存于食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，以及以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。

[0011] 在第二个方面，本发明提供一种组成物，其包含有如上所述的戊糖乳杆菌05B0100分离株的发酵培养物。

[0012] 本发明所述组成物，所述发酵培养物是液态发酵培养物。

[0013] 本发明所述组成物，所述液态发酵培养物是通过将所述戊糖乳杆菌05B0100培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中而被获得。

[0014] 本发明所述组成物，所述液态发酵培养物是不含有菌体的液体。

[0015] 本发明所述组成物，所述液态发酵培养物进一步被进行乙醇萃取处理，而得到经乙醇萃取的产物。

[0016] 本发明所述组成物，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。

[0017] 本发明所述组成物，它可被制造成如医药品或食品产品的形式。

[0018] 本发明所述组成物，所述医药品呈供口服给药的剂型。

[0019] 本发明所述组成物，所述医药品呈供非经肠道给药的剂型。

[0020] 在第三个方面，本发明提供一种如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途。

[0021] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述发酵培养物是液态发酵培养物。

[0022] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述液态发酵培养物是通过将所述戊糖乳杆菌05B0100培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中而被获得。

[0023] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述液态发酵培养物是不含有菌体的液体。

[0024] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述液态发酵培养物进一步被进行乙醇萃取处理，而得到经乙醇萃取的产物。

[0025] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。

[0026] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述医药品呈供口服给药的剂型。

[0027] 本发明所述如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途，所述医药品呈供非经肠道给药的剂型。

[0028] 在第四个方面，本发明提供一种用以制备戊糖乳杆菌菌株的发酵培养物的方法，其包括将所述戊糖乳杆菌菌株培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中。

[0029] 本发明所述用以制备戊糖乳杆菌菌株的发酵培养物的方法，所述戊糖乳杆菌菌株是如上所述的戊糖乳杆菌05B0100。

[0030] 本发明所述用以制备戊糖乳杆菌菌株的发酵培养物的方法，所述耐热性小球藻材料是天然的材料或经加工处理的产物。【附图说明】

[0031] 下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可通过参照下文的描述、权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：

[0032] 图1显示本发明的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)05B0100的16S rDNA的核苷酸序列；以及

[0033] 图2显示Colo 205细胞在以不同浓度的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物予以处理后所测得的细胞生长抑制率。【具体实施方式】

[0034] 本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例和图式后，将变得明显。

[0035] 除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。

[0036] 结肠直肠癌是一种由位于结肠、直肠或阑尾中的细胞的不正常增生所引起的癌症，但目前临床上所用的药物对于结肠直肠癌的治愈率仍相当有限，并且会引起非所欲的不利副作用。

[0037] 益生菌是一种有益于健康的活的微生物食品成分，可选择性地刺激肠道中的原生细菌的生长。为了筛选出适合供应用于治疗结肠直肠癌的益生菌，申请人分离出1株细菌分离株05B0100，接着将此细菌分离株接种至添加有耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)的MRS肉汤培养基(MRS broth)中并进行发酵培养，然后由所得到的发酵培养物分离出培养滤液。所述培养滤液经由初步试验而被发现对于人类结肠直肠癌细胞系HT-29以及人类结肠腺癌细胞系Colo 205具有细胞毒性。特别地，所述耐热性小球藻的添加被发现能够有效地提升所得到的培养滤液的细胞毒性。

[0038] 所述细菌分离株05B0100经特征鉴定而被归属于戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，它被申请人命名为“戊糖乳杆菌05B0100”，并已于西元2017年06月30日以寄存编号BCRC 910783被寄存于中国台湾的食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。这个分离株亦依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定，于西元2016年10月28日以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心。

[0039] 申请人接着使用乙醇来萃取本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液，并且进一步经由实验而发现到，本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物具有优异的抑制结肠直肠癌细胞生长的活性，并且能够在小鼠体内有效地抑制结肠直肠癌细胞的增生。

[0040] 基于上述的有利生物活性，申请人认为：本发明的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物具有发展成为抗结肠直肠癌药物的高潜力。于是，本发明揭示如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物供应用于制备用来治疗结肠直肠癌的医药品的用途。因此，本发明提供一种组成物，其包含有如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物。

[0041] 依据本发明，所述发酵培养物是液态发酵培养物。

[0042] 依据本发明，所述液态发酵培养物是通过将所述戊糖乳杆菌05B0100培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中而被获得。

[0043] 如本文中所使用的，术语“培育(cultivation)”、“培养(culturing)”以及“发酵(fermentation)”可被交换地使用。

[0044] 有关发酵培养的操作程序与参数条件等落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，CN 102807959 A以及CN 104381440 A。

[0045] 依据本发明，所述发酵培养在范围落在30℃至38℃内的温度下被进行。在本发明的一个较佳具体例中，所述发酵培养于37℃下被进行。

[0046] 依据本发明，所述发酵培养被进行历时一段范围落在40至56小时内的时间。在本发明的一个较佳具体例中，所述发酵培养被进行历时48小时。

[0047] 依据本发明，适用于本发明的液态培养基包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRS broth)。

[0048] 依据本发明，所述液态发酵培养物是不含有菌体的液体。

[0049] 依据本发明，所述不含有菌体的液体通过对所述液态发酵培养物进行分离处理而被获得。

[0050] 依据本发明，所述分离处理选自于下列所构成的群组：过滤处理(filtration treatment)、离心处理(centrifugation treatment)、浓缩处理(concentration treatment)，以及它们的组合。

[0051] 在本发明的一个较佳具体例中，所述不含有菌体的液体通过对所述液态发酵培养物进行离心处理，继而过滤处理而被获得。

[0052] 依据本发明，所述液态发酵培养物进一步被进行乙醇萃取处理(ethanol-extraction treatment)，而得到经乙醇萃取的产物。

[0053] 依据本发明，所述乙醇萃取处理是令所述液态发酵培养物与乙醇在适当比例下混合历时一段时间，继而离心以得到醇溶性上清液(alcohol soluble supernatant)。较佳地，所述液态发酵培养物与乙醇的混合比例是1：1至1：10，更佳为1：4。

[0054] 依据本发明，所述耐热性小球藻材料可以是天然的材料(natural material)或经加工处理的产物(processed material)(例如，经冷冻干燥或喷雾干燥的产物)。在本发明的一个较佳具体例中，所述耐热性小球藻材料是经加工处理的耐热性小球藻粉。

[0055] 依据本发明，所述组成物可被制造成如医药品的形式。所述医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于非经肠道地(parenterally)或口服地(orally)给药的剂型(dosage form)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。

[0056] 依据本发明的医药品可以选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来给药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)以及静脉内注射(intravenous injection)。

[0057] 依据本发明的医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，所述药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。

[0058] 依据本发明的医药品包含有药学上可接受的溶剂，并且所述溶剂是下列的任一者：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液以及含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

[0059] 本发明亦提供一种用于治疗具有结肠直肠癌的个体的方法，其包括对所述个体给药以如上所述的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物。

[0060] 如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指减少(reducing)、减轻(alleviating)、改善(ameliorating)、缓解(relieving)或控制(controlling)疾病(disease)或障碍(disorder)的一或多个临床征兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing)正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性的进展(progression of severity)。

[0061] 依据本发明，所述戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物的给药剂量与给药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗的个体的年龄、身体状况与反应。一般而言，依据本发明的医药品可呈单一剂量或是分成数个剂量的形式而被口服地、非经肠道地或局部地给药。

[0062] 依据本发明，所述组成物可被当作食品添加物(food additive)，通过已知方法于原料制备时被添加，或是于食品的制作过程中被添加，而与任一种可食性材料被配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

[0063] 本发明亦提供一种用以制备戊糖乳杆菌菌株的发酵培养物的方法，其包括将所述戊糖乳杆菌菌株培养于包含有耐热性小球藻材料的液态培养基中。较佳地，所述戊糖乳杆菌菌株是如上所述的戊糖乳杆菌05B0100。

[0064] 依据本发明，适用于本发明的液态培养基是如上面所述者。

[0065] 依据本发明，所述发酵培养物是液态发酵培养物。

[0066] 依据本发明，有关发酵培养的操作程序与参数条件是如上面所述者。

[0067] 本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

[0068] <实施例>

[0069] 一般实验材料：

[0070] 1.MRS肉汤培养基(MRS broth)：

[0071] 在下面实施例中所使用的MRS肉汤培养基是商业上可购得的乳杆菌MRS肉汤培养基(Lactobacilli MRS broth)。

[0072] 2.MRS-耐热性小球藻肉汤培养基(MRS-Chlorella sorokiniana broth)：

[0073] 在下面实施例中所使用的MRS-耐热性小球藻肉汤培养基是通过将上面第1项的MRS肉汤培养基添加以市售的耐热性小球藻粉至最终浓度5％(w/v)而被制得。

[0074] 3.细胞系的来源与培养：

[0075] 在下面实施例中所使用的人类结肠直肠癌细胞系(human colorectal cancer cell line)HT-29(BCRC 67003)、人类结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Colo 205(BCRC 60054)以及正常的人类肺纤维母细胞(normal human lung fibroblast)MRC-5(BCRC 60023)皆购自于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)。

[0076] 这3种细胞分别依照下面表1所示的培养基被培养于T-75细胞培养瓶(T-75flask)中，并在设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。当细胞密度达到约80-90％汇聚(confluence)时，移除培养基并以杜贝可氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco’s phosphate buffered saline,D-PBS)(购自于Life Technologies GIBCO BRL Co.,Ltd)来清洗细胞，接着加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使细胞自培养瓶的底部脱离。之后，加入新鲜的培养基来中和胰蛋白酶的活性并以移液管(pipette)反复地吸冲培养基以充分打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分配到新的培养瓶中，并在培养箱中进行培养。

[0077] 表1.用于培养3种细胞系的培养基

[0078]

[0079] 4.实验动物：

[0080] 在下面实施例中所使用的雄性Nu/Nu小鼠(Nu/Nu mice)(5周大，体重约为26至29g)购自于乐斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co.,Ltd)。所有的实验动物被饲养于一个光照与黑暗各为12小时、室温维持在23±2℃以及相对湿度维持在60±5％的独立空调的动物房内，而且水分与饲料被充分地供给。有关实验动物的一切实验程序均符合中国台湾动物保护法(Animal Protection Act of Taiwan)的规定并且依据中国台湾某机构实验动物管理委员会准则(guidelines of Animal Care Committee of the Council of Agriculture,Taiwan)来进行。

[0081] 实施例1.细菌分离株05B0100的抗结肠直肠癌活性的初步分析

[0082] A.制备细菌分离株05B0100的接种原(inoculum)：

[0083] 将细菌分离株05B0100以1％(v/v)的接种量分别接种至MRS肉汤培养基中，并于37℃下进行培养历时48小时。此培养步骤被重复1次，以活化菌株。所形成的培养物被使用作为下面第B项中的接种原。

[0084] B.制备细菌分离株05B0100的培养滤液(culture filtrate)：

[0085] 将依据上面第A项当中所得到的细菌分离株05B0100的接种原以1％(v/v)的接种量接种至MRS-耐热性小球藻肉汤培养基中，并于37℃下进行发酵培养历时48小时。之后，调整所形成的发酵培养物的pH值至6.0，并于12,000rpm下进行离心历时5分钟，然后收集上清液并使用孔径为0.22μm的滤膜来进行过滤，而得到细菌分离株05B0100的培养滤液1。

[0086] 细菌分离株05B0100的培养滤液2大体上是依照上述步骤而被制得，不同之处在于：使用MRS肉汤培养基来代替MRS-耐热性小球藻肉汤培养基。

[0087] C.评估细菌分离株05B0100的培养滤液对于人类结肠直肠癌细胞系HT-29的细胞毒性(cytotoxicity)：

[0088] 首先，将HT-29细胞培养于含有McCoy’s 5A培养基(添加有10％FBS以及1.5mM谷氨酰胺)的96-孔培养盘(96-well plate)中，而使得各孔(well)的体积为180μL，并且在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24小时。

[0089] 接着，将20μL的依据本实施例的第B项当中所得到的细菌分离株05B0100的培养滤液1分别添加至各孔的细胞培养物中。另外，不作任何处理的细胞培养物被使用作为对照组。

[0090] 各孔细胞培养物在培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养后历时72小时之后，移除各孔中的液体，继而加入20μL的5mg/mL 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT}溶液(配于PBS中，并使用孔径为0.22μm的滤膜来进行过滤)并予以培养历时4小时。之后，移除各孔中的液体，继而加入100μL的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)并予以混合均匀，然后于690nm的波长下以ELISA读取机(ELISA reader)来读取各孔的吸光值(OD690)。

[0091] 细胞生长抑制率(cell growth inhibition rate)(％)是通过将所测得的吸光值(OD690)代入下列公式(1)而被计算出：

[0092] 公式(1)：A＝[1-(B/C)]×100

[0093] 其中：A＝细胞生长抑制率(％)

[0094] B＝在以细菌分离株的培养滤液处理之后所测得的OD690吸光值

[0095] C＝对照组所测得的OD690吸光值

[0096] 若所测得的细胞生长抑制率越高，代表细菌分离株的培养滤液对于HT-29细胞的细胞毒性越高。

[0097] 实验结果显示：细菌分离株05B0100的培养滤液对于人类结肠直肠癌细胞系HT-29具有高细胞毒性(数据未显示)。

[0098] D.评估细菌分离株05B0100的培养滤液对于人类结肠腺癌细胞系

[0099] Colo 205以及正常的人类肺纤维母细胞MRC-5的细胞毒性：

[0100] 本实验大体上参照上面第C项当中所述的方法来进行，不同之处在于：分别使用Colo 205细胞以及MRC-5细胞来代替HT-29细胞。实验结果显示：细菌分离株05B0100的培养滤液对于人类结肠腺癌细胞系Colo 205具有高细胞毒性，并且不会对正常的MRC-5细胞造成伤害(数据未显示)。

[0101] E.评估耐热性小球藻对于细菌分离株05B0100的培养滤液的抗结肠直肠癌的效用的影响：

[0102] 为了评估在细菌分离株05B0100的培养滤液的制备过程中，耐热性小球藻的添加与否对于培养滤液的抗结肠直肠癌的效用的影响，申请人大体上参照上面第C项当中所述的方法来进行实验，不同之处在于：使用Colo 205细胞来代替HT-29细胞，以及额外使用依据本实施例的第B项当中所得到的细菌分离株05B0100的培养滤液2来进行实验。所得到的实验结果被显示于下面的表2中。

[0103] 表2.Colo 205细胞的生长抑制率

[0104] 培养滤液 细胞生长抑制率(％)细菌分离株05B0100的培养滤液1 59.2±7.8
细菌分离株05B0100的培养滤液2 29.9±6.5

[0105] 由表2可见，以细菌分离株05B0100的培养滤液1来处理Colo 205细胞所测得的细胞生长抑制率显著地高于细菌分离株05B0100的培养滤液2所具者。这个实验结果显示：在细菌分离株05B0100的培养过程中添加耐热性小球藻能够大幅地提升发酵培养物的抗结肠直肠癌的效用。

[0106] 实施例2.细菌分离株05B0100的特征鉴定

[0107] 为了确认细菌分离株05B0100所属菌种，细菌分离株05B0100被拿来进行下面的初步试验、糖类发酵型态分析(carbohydrate fermentation profile analysis)以及16S rDNA序列分析(16S rDNA sequence analysis)。

[0108] A.初步试验：

[0109] 对细菌分离株05B0100进行初步试验，试验项目包括：革兰氏染色(gram staining)、形态观察(morphological observation)、运动性(motility)、触酶(catalase)与氧化酶(oxidase)反应、在好氧(aerobic)与厌氧(anaerobic)条件下的生长情形，以及是否会形成内生孢子(endospore)等。

[0110] 依据初步试验结果，所述细菌分离株05B0100为革兰氏阳性杆菌、不具运动性、不具触酶或氧化酶的活性、在好氧与厌氧条件下均可生长，以及不会形成内生孢子。

[0111] B.糖类发酵型态分析：

[0112] 本实验使用API 50 CHL鉴定系统(API 50 CHL identification system)(bioMérieux)并参照厂商所提供的操作指引来进行，所试验的糖类以及试验的结果被显示于下面表3中。

[0113] 表3.细菌分离株05B0100的糖类发酵型态分析结果

[0114]

[0115]

[0116] 注：+，阳性反应；－，阴性反应；/，无法判定。

[0117] 依据表3的结果，申请人发现：本发明的细菌分离株05B0100的糖类发酵型态与戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)所具者之间有高达99.9％的相同性，申请人据此而认为所述细菌分离株05B0100的所属菌种为戊糖乳杆菌。

[0118] C.16S rDNA序列分析：

[0119] 将细菌分离株05B0100的接种原接种于MRS琼脂平板培养基上并以L型玻棒予以涂布均匀，继而于37℃下进行培养。之后，从MRS琼脂平板培养基上刮取少量的新鲜菌体置于1.5mL微量离心管中，并使用DNeasy血液&组织试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit,QIAGEN)来进行基因组DNA(genomic DNA)的萃取。由此所得到的基因组DNA被溶于适量的ddH2O中，借此而形成含有所述细菌分离株05B0100的基因组DNA的样品。

[0120] 以所得到的基因组DNA作为模版(template)，并且在PCR系统中使用完整基因16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒( Full Gene 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit)(Applied Biosystem)来进行16S rDNA的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)。于完成PCR之后，通过琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)来确认是否有得到大小约为500bps的PCR扩增产物，并从凝胶中回收纯化所述经确认的PCR扩增产物。

[0121] 经纯化的PCR扩增产物是在所述PCR系统中使用 完整基因16S rDNA细菌鉴定测序试剂盒( Full Gene 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit)(Applied Biosystem)来进行循环测序(cycle sequencing)，继而将所得到的循环测序产物(cycle sequencing product)进行纯化。经纯化的循环测序产物接而使用3730 DNA分析仪(3730DNA Analyzer)(Applied Biosystems and Hitachi,Ltd.)来进行测序，而所得到的测序结果被显示于图1中。经与NCBI网站中的基因资料库比对后，发现所述细菌分离株05B0100的部分16S rDNA序列(序列辨识编号：1)与戊糖乳杆菌DSM 20314(T)[Genbank登录编号(accession number)AZCU01000047]的部分16S rDNA序列之间具有100％的相似性。

[0122] 综合本实施例的第A至C项的特征鉴定结果，申请人认为：本发明的细菌分离株05B0100是一株戊糖乳杆菌分离株。

[0123] 本发明的戊糖乳杆菌05B0100已于西元2017年06月30日以寄存编号BCRC 910783被寄存于财团法人食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331号，中国台湾)。这个分离株亦依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定，于西元2016年10月28日以寄存编号DSM 32388被寄存于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。

[0124] 实施例3.戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物的活体外抗结肠直肠癌试验(in vitro anti-colorectal cancer test)

[0125] 在本实施例中，申请人使用乙醇来萃取本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液，继而将所得到的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物拿来处理人类结肠腺癌细胞系Colo 205并进行细胞生长抑制率(cell growth inhibition rate)的分析，以评估戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物是否具有活体外抗结肠直肠癌的效用。

[0126] 实验方法：

[0127] A.制备戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物：

[0128] 首先，将上面实施例1的第B项“制备细菌分离株05B0100的培养滤液”中所得到的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液1与95％的乙醇以1：4的比例予以混合，然后于室温下静置历时45至60分钟，接着进行离心并收取上清液。之后，将所述上清液于50℃下以减压浓缩机来进行浓缩而得到戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物。接着，将所述戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物溶于PBS中而得到浓度为50mg/mL的储备溶液备用。

[0129] B.细胞生长抑制率的分析(analysis of cell growth inhibition rate)：

[0130] 首先，将Colo 205细胞分成8组，其中包括1个对照组、4个培养基组(亦即培养基组1至4)以及3个实验组(亦即实验组1至3)。将Colo 205细胞培养于含有RPMI 1640培养基(添加有10％FBS、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠以及2mM L-谷氨酰胺)的96-孔培养盘的各孔中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养。

[0131] 接着，将各组的细胞培养物更换以新鲜的培养基，继而将适量的依据本实施例的第A项当中所得到的储备溶液添加至实验组1至3的细胞培养物中，而使得实验组1至3分别具有不同最终浓度的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物。另外，将适量的MRS-耐热性小球藻肉汤培养基添加至培养基组1至4的细胞培养物中，而使得培养基组1至4分别具有不同最终浓度的MRS-耐热性小球藻肉汤培养基。至于对照组的细胞培养物则不作任何处理。各组细胞培养物在培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养后，加入20μL的5mg/mL MTT溶液(配于PBS中，并使用孔径为0.22μm的滤膜来进行过滤)并予以培养历时4小时。之后，移除各孔中的液体，继而加入100μL的DMSO并予以混合均匀，然后于690nm的波长下以ELISA读取机来读取各孔的吸光值(OD690)。

[0132] 细胞生长抑制率(％)是通过将所测得的吸光值(OD690)代入下列公式(2)而被计算出：

[0133] 公式(2)：D＝[1-(E/F)]×100

[0134] 其中：D＝细胞生长抑制率(％)

[0135] E＝各组所测得的OD690吸光值

[0136] F＝对照组所测得的OD690吸光值

[0137] 另外，抑制50％细胞生长的浓度(50％inhibition concentration of cell growth,IC50)是通过计算本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物会降低经处理的细胞的吸光值(OD690)达50％(与对照组细胞相较之下)的浓度而从曲线的线性部分被测定出。

[0138] 结果：

[0139] 图2显示Colo 205细胞在以不同浓度的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物予以处理后所测得的细胞生长抑制率。由图2可见，与培养基组相较之下，实验组1至3所测得的细胞生长抑制率呈现升高的情形，其中实验组2与3的细胞生长抑制率皆可达至95％以上。特别地，本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物对于Colo 205细胞的IC50为1.78mg/mL。这个实验结果显示：本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物具有优异的抑制结肠直肠癌细胞生长的活性。

[0140] 实施例4.戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物在活体内(in vivo)抑制结肠直肠癌细胞Colo 205生长上的效用评估

[0141] 为了探讨本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物是否能够在活体内抑制结肠直肠癌细胞的生长，下面的实验被进行。

[0142] 实验方法：

[0143] 首先，将雄性Nu/Nu小鼠随机分成1个病理对照组、1个培养基组以及1个实验组(每组n＝5)，各组小鼠被皮下注射(subcutaneously injected)以3×106个人类结肠腺癌细胞系Colo 205。在人类结肠腺癌细胞系Colo 205注射之后的第1周，实验组的小鼠被皮下注射以上面实施例3的第A项当中所得到的储备溶液(剂量为5mg/只)，培养基组的小鼠被皮下注射以MRS-耐热性小球藻肉汤培养基(剂量为5mg/只)，而病理对照组的小鼠被皮下注射以PBS(剂量为100μL/只)。之后，各组小鼠依照上述方式每天被给药1次，并且给药被持续进行至人类结肠腺癌细胞系Colo 205注射之后的第5周结束为止。

[0144] 在人类结肠腺癌细胞系Colo 205注射之后的第5周结束之时，各组小鼠通过CO2而被麻醉，然后予以牺牲，接着取出肿瘤并测量其重量。所得到的实验结果是以平均值±标准偏差(standard deviation,S.D.)来表示。

[0145] 结果：

[0146] 本实验的结果被显示于下面表4中。

[0147] 表4.各组小鼠的肿瘤重量

[0148]组别 肿瘤重量(mg)
病理对照组 680±130
培养基组 690±120
实验组 330±130

[0149] 从表4可见，与病理对照组以及培养基组相较之下，实验组的小鼠的肿瘤重量有下降的情形。这个实验结果显示：本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液的经乙醇萃取的产物能够在小鼠体内有效地抑制结肠直肠癌细胞的增生。

[0150] 综合以上的实验结果，申请人认为：本发明的戊糖乳杆菌05B0100的培养滤液及其经乙醇萃取的产物能够有效地治疗结肠直肠癌。因此，本发明的戊糖乳杆菌05B0100的发酵培养物具有发展成为抗结肠直肠癌药物的高潜力。

[0151] 于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。

[0152] 虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如权利要求所示者的限制。

[0153] 生物材料保藏信息说明

[0154] 保藏编号：DSM 32388

[0155] 分类命名：戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)05B0100

[0156] 保藏日期：2016年10月28日

[0157] 保藏单位：德国微生物保藏中心

[0158] 保藏单位地址：德国银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克