低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法

摘要

本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。制备步骤：将自由基引发剂偶氮二异丁腈加入低共熔溶剂/离子液体中，超声分散后，加入功能单体甲基丙烯酸、共聚单体甲基丙烯酸丁酯、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，超声溶解后注入毛细管中，热引发合成整体柱，用三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP‑HCl）试剂使胰蛋白酶中的双硫键还原为巯基，加入过硫酸铵和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺制备酶衍生液，在室温下与整体柱反应固定到整体柱表面，进行酶解蛋白。整体柱结构稳定，对酶活性影响较低，可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉，具有广泛的应用前景。

权利要求

1.一种低共熔溶剂整体柱酶反应器应用于酶解N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯的方法，其特征在于包括以下步骤：

一、低共熔溶剂整体柱的制备

1）毛细管整体柱的制备

将2.0 mg的自由基引发剂偶氮二异丁腈加入80μL的低共熔溶剂，294μL离子液体，超声

5 min分散后，加入8.2μL、0.096 mmol的功能单体甲基丙烯酸、46μL、0.326 mmol的共聚单体甲基丙烯酸甲酯、18μL，0.058 mmol的交联单体二甲基丙烯酸乙二醇酯，超声15 min使其完全溶解；通入氮气10 min，用注射器将预聚合液注入毛细管中，两端密封，在53 ℃下反应

1.5 h；反应完成后，乙腈洗去整体柱中残留的致孔剂离子液体、氯化胆碱‑乙二醇和可溶性物质，氮气吹干备用；

2）低共熔溶剂整体柱酶反应器的制备

用20 mM pH 8.0的Tris‑Hcl缓冲液配制胰蛋白酶溶液10 mg/mL和三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液1 mg/mL，两者体积比为1:10混合，25℃下反应3 h，然后在4 ℃下离心10 min，

10000 rpm，以除去不溶物；取上清液加入1 mg/mL过硫酸铵和2 mg/mL N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺，即为酶衍生液；

将酶衍生液注入1）中合成的毛细管整体柱，25 ℃下反应5 h，反应完成后用20 mM pH 

8.0的Tris‑Hcl缓冲液冲洗柱子1 h以除去未反应的物质；将制得的整体柱4 ℃保存备用；

二、低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性测定为定量地得到低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性，以米氏常数Km和最大酶反应速率Vmax表征酶反应器的性能：

米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）由米氏方程计算得到，使用Linewaver‑Burk作图法以1/V对1/[S]作图：

得到一条直线，直线在横轴上的截距为‑1/Km，纵截距为1/Vmax，求出Km与Vmax；

用上述合成低共熔溶剂整体柱酶反应器，以N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯为酶反应底物，在胰蛋白酶的作用下，底物被水解成苯酰酯‑L‑精氨酸，在214 nm处有紫外吸收；将N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯溶于20 mM pH 8.0的Tris‑Hcl缓冲液中，配成不同浓度溶液：0.1 mM, 

0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 6 mM；使用注射泵将底物注入毛细管酶反应器，收集流出液，使用高效毛细管电泳仪测定产物苯酰酯‑L‑精氨酸的峰面积；

低共熔溶剂酶反应器的有效长度为5 cm，高效毛细管电泳分析使用的为长50 cm，内径

100μm的空毛细管，流动相为20 mM pH 8.0Tris‑Hcl缓冲液，分离电压15 kV，检测波长214 nm。

说明书

低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法，即以低共熔溶剂为绿色致孔剂制备毛细管整体柱酶反应器以及其在酶解蛋白中的应用。

背景技术

[0002] 蛋白质组学是一门用科学技术手段研究蛋白质组的科学，由整体出发分析细胞内动态变化的蛋白质。传统的溶液酶解蛋白质的方法存在酶解时间长，分析通量低，自水解的
问题，难以用于微量蛋白样品分析。目前主要的酶反应器主要包括整体柱酶反应器，颗粒固
定化酶反应器，开管酶反应器，其中整体柱酶反应器应用较为广泛。整体柱是在柱内通道通
过原位聚合反应形成的连续整体多孔材料。根据整体柱酶反应器中单体的不同，其类型可
分为有机整体柱酶反应器和无机整体柱酶反应器。有机整体柱酶反应器由于用化学反应固
定酶，固化过程中会引起酶的空间构象变化，易导致酶活性下降，而无机整体柱酶反应器多
用二氧化硅做整体材料，对比有机整体柱，制备不易，而且后续表面衍生步骤也较繁琐。

[0003] 胆碱类低共熔溶剂是由一定化学计量比的季铵盐（氯化胆碱）与多元醇（乙二醇）混合构成的低共熔溶剂。低共熔溶剂本质上是一种离子混合物，通过几种不同熔点的化合
物按一定比例混合后形成，其理化性质与离子液体十分相似，也有人称其为“新型离子液
体”。而低共熔溶剂具有低毒性、可降解、制备简单、价格低廉的优点，而且合成过程中的原
子利用率达100%。相比甲苯等传统致孔剂，是十分理想的绿色溶剂。

[0004] 点击化学指通过小单元的拼接，形成高选择性的碳‑杂原子键，反应条件简单，环境友好，有很强的立体选择性。“巯基‑烯”点击反应以光引发自由基反应为催化剂，在特定
的区域和官能团间反应，具有高度选择性。点击反应利用整体柱上的残余双键与胰蛋白酶
的巯基反应将酶固定在整体柱上，是一种有效的酶固定方法，可避免在整体柱上二次接枝
而影响通透性。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种低共熔溶剂整体柱酶反应器及其制备方法。以低共熔溶剂为绿色致孔剂，提高整体柱的通透性，增加样品液的通量，以及最大程度的保留酶活性，
保证酶解效率。通过原位聚合法制备毛细管整体柱，应用“巯基‑烯”点击反应原理在整体柱
表面固定胰蛋白酶，得到整体柱酶反应器。本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合
成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉。本发明整体柱结构稳定，对酶活性影
响较低，可作为重复利用的新型酶反应器酶解蛋白溶液，具有广泛的应用前景。

[0006] 本发明提供的一种低共熔溶剂整体柱酶反应器是按下述具体方法步骤制备：

[0007] 1）将氯化胆碱加入乙二醇中，油浴加热4小时后完全溶解，即得到氯化胆碱‑乙二醇低共熔溶剂；其中，氯化胆碱与乙二醇的质量比为1:3。

[0008] 2）将自由基引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）溶于步骤1）的低共熔溶剂与离子液体中超声混匀后，加入甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（BMA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）
得到预聚合液，超声，通氮气除去溶液中溶解的氧。注入经γ‑甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基
硅烷(γ‑MPS)预处理的毛细管柱，65℃热聚合反应1.5小时，反应完全后通乙腈冲毛细管
柱，去除未反应的试剂。

[0009] 其中低共熔溶剂和离子液体为整体柱的致孔剂。

[0010] 所述的离子液体为1‑己基‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐；所述的离子液体与低共熔溶剂质量比为3:2；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为48:163:
29；石英毛细管内径为100μm。

[0011] 3）还原胰蛋白酶中的双硫键：用pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris‑HCl）缓冲液配制10 mg/mL的胰蛋白酶溶液和1 mg/mL的三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液，按胰蛋白酶溶
液与三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液体积比为1:10混合溶液，25℃反应3小时后，4℃下离心
10分钟，转速10000 rpm，除去不溶物；溶液恢复到室温后取上清液5 mL加入过硫酸铵5 mg
和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺10 mg，震荡使其充分溶解即得酶衍生液。

[0012] 4）用1 mL注射器将酶衍生液注入步骤2）中的整体柱，在室温下反应5小时将酶固定到整体柱表面，反应结束后用pH 8.0的Tris‑HCl 缓冲液冲洗1小时，以洗去未反应的物
质，置于4℃冰箱保存。

[0013] 其中，胰蛋白酶溶液与三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液的体积比为10:1；

[0014] 步骤4）中所述的整体柱反应之前通氮气吹干；

[0015] 所述的过硫酸铵和N,N’‑亚甲基双丙烯酰胺的浓度分别为1 mg/mL和2 mg/mL。

[0016] 本发明提供的一种低共熔溶剂整体柱酶反应器用于固定胰蛋白酶，以酶解蛋白质，实现酶解的高通量。

[0017] 本发明提供的一种低共熔溶剂整体柱酶反应器有以下优点：

[0018] 1.以低共熔溶剂为绿色致孔剂，具有可降解、毒性低，可为整体柱提供良好的孔道结构和通透性，对酶活性影响较低。通过调整致孔剂的比率可以对孔径进行调整，适应不同
的反应条件。

[0019] 2.本方法合成的酶反应器酶解效率高，在线酶解3 mM N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯，15 s即可完成水解，可重复利用，稳定性好，相比传统的溶液酶解方法，大大减少酶解时
间，提高了酶解效率。

[0020] 3.本发明采用原位聚合法在毛细管内直接聚合，合成方法简便易行，操作简单，聚合时间较短，成本低廉，具有广泛的应用前景。

附图说明

[0021] 图1为整体柱的红外光谱图。

[0022] 图2为本发明酶反应器水解2 mM N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯样品的毛细管电泳图谱。

[0023] 图3为本发明酶反应器在线酶解3 mM N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯样品的毛细管电泳图。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通
用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 实施例1、低共熔溶剂整体柱酶反应器的制备

[0026] （1）低共熔溶剂整体柱的制备

[0027] 1）毛细管整体柱的制备

[0028] 将自由基引发剂偶氮二异丁腈（2.0 mg），加入低共熔溶剂（80μL），离子液体（294μL），超声5 min（650 W）分散后，加入功能单体甲基丙烯酸（8.2μL，0.096 mmol）、共聚单体甲
基丙烯酸甲酯（46μL，0.326 mmol）、交联单体二甲基丙烯酸乙二醇酯（18μL，0.058 mmol），
超声15 min使其完全溶解。通入氮气10 min，用注射器将预聚合液注入毛细管中，两端密
封，在53 ℃下反应1.5 h。反应完成后，乙腈洗去整体柱中残留的致孔剂离子液体、氯化胆
碱‑乙二醇和可溶性物质，氮气吹干备用。

[0029] 2）低共熔溶剂整体柱酶反应器的制备（胰蛋白酶的固定）

[0030] 用20 mM Tris‑Hcl缓冲液（pH 8.0）配制胰蛋白酶溶液（10 mg/mL）和三（2‑羰基乙基）磷盐酸盐溶液（1 mg/mL），两者体积比为1:10混合，25℃下反应3 h，然后在4 ℃下离心
10 min（10000 rpm）以除去不溶物。取上清液加入过硫酸铵（1 mg/mL）和N,N’‑亚甲基双丙
烯酰胺（2 mg/mL），即为酶衍生液。

[0031] 将酶衍生液注入1）中合成的毛细管整体柱，25 ℃下反应5 h，反应完成后用20 mM Tris‑Hcl缓冲液（pH 8.0）冲洗柱子1 h以除去未反应的物质。将制得的整体柱4 ℃保存备
用。

[0032] 实施例2、低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性测定

[0033] 为定量地得到低共熔溶剂整体柱酶反应器的酶活性，本发明以米氏常数Km和最大酶反应速率Vmax表征酶反应器的性能。

[0034] 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）由米氏方程计算得到。使用Linewaver‑Burk作图法以1/V对1/[S]作图：

[0035]

[0036] 可得到一条直线。直线在横轴上的截距为‑1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。

[0037] 用上述方法（实施例1）合成低共熔溶剂整体柱酶反应器，以N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯为酶反应底物，在胰蛋白酶的作用下，底物被水解成苯酰酯‑L‑精氨酸，在214 nm处有
紫外吸收。将N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯溶于20 mM Tris‑Hcl缓冲液（pH 8.0）中，配成不同
浓度溶液（0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM, 6 mM），使用
注射泵将底物注入毛细管酶反应器，收集流出液，使用高效毛细管电泳仪（安捷伦 CE7100）
测定产物苯酰酯‑L‑精氨酸的峰面积。

[0038] 低共熔溶剂酶反应器的有效长度为5 cm，高效毛细管电泳分析使用的为长50 cm，内径100μm的空毛细管，流动相为20 mM Tris‑Hcl缓冲液（pH 8.0），分离电压15 kV，检测波
长214 nm。

[0039] 图1为整体柱的红外光谱图。

[0040] 图2为酶反应器水解2 mM N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯样品的毛细管电泳图谱，可知产物N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸与未反应完全的底物N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯在毛细管中
的分离效果良好。

[0041] 图3为酶反应器在线酶解3 mM N‑苯甲酰基‑L‑精氨酸乙酯样品的毛细管电泳图，15 s即可完全水解。