一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗

摘要

本发明公开了一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗，涉及动物生物制品领域。本发明提供的重组猪伪狂犬病毒的保藏编号为CGMCC No：16289。该重组猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，其致病性被去除，缺失了伪狂犬病毒TK、gI、gE、11K和28K基因，并能表达猪流行性腹泻病毒S截短蛋白融合猪CD40L蛋白的融合蛋白。使用该重组猪伪狂犬病毒制备的重组伪狂犬病活疫苗免疫猪后可以使猪获得抵抗猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒攻毒的免疫力。免疫效果较好，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种重组猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No：16289。

2.权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒在制备猪用疫苗中的应用。

3.一种用于预防猪伪狂犬病和/或猪流行性腹泻的重组猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于，其包括权利要求1所述的重组伪狂犬病毒以及稳定剂。

4.制备如权利要求3所述的重组猪伪狂犬病活疫苗的方法，其特征在于，其包括如下步骤：步骤(a)：将权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒接种传代细胞，收获病毒液；步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稳定剂为明胶蔗糖保护剂；所述明胶蔗糖保护剂中含1％-3％明胶和10％蔗糖。

说明书

一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及动物生物制品领域，具体而言，涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗。

背景技术

[0002] 猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶斯基氏病(Aujeszky's disease,AD)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)所引起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。猪是该病的天然宿主、主要储存宿主和传染源，PRV可以感染所有年龄的猪，年龄越小感染后发病越严重，死亡率也越高。哺乳仔猪感染后死亡率很高，可达100％，可出现腹泻、呕吐、四肢泳动等神经症状；断奶仔猪和育肥猪感染后主要表现为发热和呼吸道症状；成年猪感染后不发病或仅表现为体温升高等轻微症状，多呈隐形感染；妊娠母猪感染后会导致流产、产死胎、木乃伊胎等；该病还可引起种猪不育、公猪睾丸肿胀等。

[0003] 2011前后我国多个地区爆发猪伪狂犬病，给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。同期我国也出现了猪流行性腹泻的爆发流行。经过实验室检测发现，很多病例中存在猪伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的混合感染。两种病原感染后发病严重程度均与猪年龄呈负相关，均能引起仔猪腹泻呕吐。针对猪伪狂犬病和猪流行性腹泻，使用疫苗免疫可以显著降低因疾病感染而造成的经济损失，但尚无猪伪狂犬病和猪流行性腹泻病毒二联疫苗上市。因此开发一种能同时预防猪伪狂犬病和猪流行性腹泻的重组疫苗迫在眉睫。

[0004] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种重组猪伪狂犬病毒，该重组猪伪狂犬病毒是经人工改造后得到的，通过基因编辑和重组技术缺失了伪狂犬病毒的主要致病基因TK、gI、gE和11K、28K基因，并在gI、gE、 11K和28K基因缺失的位置插入了能够表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的截短片段并融合猪CD40L蛋白的融合蛋白。所构建的重组病毒对猪无致病性，其免疫原性被有效保留，使用该重组猪伪狂犬病毒制备的疫苗免疫猪后可以为猪提供抵抗猪伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的免疫力。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述重组猪伪狂犬病毒的应用。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种重组猪伪狂犬病活疫苗，该疫苗由上述的重组猪伪狂犬病毒制成，其具有较好的免疫效果。

[0008] 本发明的另一目的在于提供一种制备上述重组猪伪狂犬病疫苗的方法。通过该方法制得的重组猪伪狂犬病活疫苗，具有较好的免疫效果。

[0009] 本发明是这样实现的：

[0010] 一方面，本发明提供了一种重组猪伪狂犬病毒，其保藏编号为 CGMCC No：16289。

[0011] 进一步地，所述重组伪狂犬病毒缺失如下基因：TK、gI、gE、 11K和28K。

[0012] 进一步地，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪流行性腹泻病毒S 蛋白，所述S蛋白包含猪流行性腹泻病毒受体结合结构域。

[0013] 进一步地，所述重组伪狂犬病毒能够表达猪CD40L蛋白。

[0014] 进一步地，所述重组伪狂犬病毒所表达的外源蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合结构域与猪CD40L蛋白形成的融合蛋白。

[0015] 进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0016] 本发明提供的重组猪伪狂犬病毒是在伪狂犬病毒PRV-FJ株的基础上缺失了TK、gI、gE、11K和28K基因，经过基因编辑后得到本发明的重组猪伪狂犬病毒。

[0017] 该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路 1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16289。

[0018] 使用该重组病毒经鼻腔接种1日龄仔猪，不引起仔猪发病，对猪不具有致病性，此外，采用该重组猪伪狂犬病毒毒株制成的疫苗，经免疫原性试验验证，其gE抗体检测结果为阴性，gB抗体为阳性，并能诱导较高效价的猪伪狂犬病毒中和抗体和猪流行性腹泻病毒中和抗体，均能够有效抵抗猪伪狂犬病和猪流行性腹泻的侵袭。

[0019] 另一方面，本发明提供了上述重组猪伪狂犬病毒在制备猪用疫苗中的应用。

[0020] 其中，所述猪用疫苗为用于预防猪伪狂犬病和/或猪流行性腹泻的疫苗；优选的，所述疫苗为活疫苗。

[0021] 再一方面，本发明提供了一种重组猪伪狂犬病活疫苗，其包括如上所述的重组伪狂犬病毒以及稳定剂。

[0022] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂为明胶蔗糖保护剂。

[0023] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述明胶蔗糖保护剂中含1％-3％明胶和10％蔗糖，余量为水。

[0024] 另一方面，本发明提供了一种如上所述的重组猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

[0025] 步骤(a)：将如上所述的重组猪伪狂犬病毒接种传代细胞，收获病毒液；

[0026] 步骤(b)：将收获的病毒液与稳定剂混合。

[0027] 进一步地，所述制备方法还包括：步骤(c)：将病毒液与稳定剂的混合溶液经真空冷冻干燥制成成品的猪伪狂犬病活疫苗。

[0028] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述稳定剂为明胶蔗糖保护剂。

[0029] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，按质量体积比计，所述明胶蔗糖保护剂中含1％-3％明胶(即100ml明胶蔗糖保护剂含1-3g 明胶)和10％蔗糖。

[0030] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，所述病毒液与稳定剂以等体积混合。

[0031] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述传代细胞为ST细胞、BHK21细胞、MDBK细胞、VERO细胞、MDCK细胞、PK15 细胞，293T细胞、293F细胞等，优选为BHK21细胞。

附图说明

[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0033] 图1为免疫后28日PRV gB/gE抗体以及伪狂犬病毒中和抗体测定结果，注：gB/gE抗体检测，S/N值小于0.6为阳性，大于0.7为阴性，0.6至0.7为可疑。

[0034] 图2为PRV-FJ攻毒后体温变化曲线图，注：体温超过40.5℃为发热。

[0035] 图3为免疫后14日PEDV血清中和抗体检测结果。

具体实施方式

[0036] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0037] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0038] 实施例1

[0039] 人工改造伪狂犬病毒

[0040] 1、毒株

[0041] PRV-FJ株，由畜禽传染病四川省重点实验室从2015年福建猪伪狂犬发病猪病料中分离获得；发病猪主要表现为体温升高，食欲不佳，打喷嚏等症状。PRV-FJ株以107TCID50/头的剂量感染28日龄断奶仔猪，无神经症状，攻毒后7天全部死亡。

[0042] PEDV-CV777株和SA014株由畜禽传染病四川省重点实验室保存提供。

[0043] ST细胞与293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养(Gibco公司)。

[0044] 2、重组载体构建

[0045] 人工合成SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3SEQ ID NO.4，然后将SEQ ID NO.1定向克隆到pEGFP-C1载体的AseⅠ酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI，将SEQ ID NO.2定向克隆到 pEGFP-gI的MluⅠ酶切位点处，将其命名为pEGFP-gI28K，将SEQ ID NO.3克隆到pEGFP-gI28K载体的BspEⅠ和BclⅠ酶切位点之间，构建好的载体命名为pPED-RBDCD40L。将SEQ ID NO.4定向克隆到 pUC57载体的EcoR1和HindIII酶切位点之间，将其命名为pUC-TK。

[0046] 3、基因编辑载体构建

[0047] 使用表1引物按照LentiCRISPR v2载体(Addgene公司)说明书方法构建TK和gE基因编辑的载体，分别命名为载体psgRNA-TK 和psgRNA-gE。

[0048] gI、gE、11K和28K四个基因相邻，因此使用psgRNA-gE和相应的同源序列可以同时缺失4个基因。

[0049] 表1 gRNA构建引物信息

[0050]

[0051] 4、重组病毒构建

[0052] 按照常规方法提取PRV-FJ株基因组DNA；将PRV-FJ基因组 DNA(3μg)、pUC-TK质粒(5μg)和psgRNA-TK质粒(5μg) 混合后参照Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种BHK21细胞，挑选单个病毒嗜斑。取挑选的病毒嗜斑接种BHK21细胞，收获病毒液，按照常规方法提取病毒DNA，使用引物TKF：CATCCTCCGGATCTACCTCGACGGC和TKR： CACACCCCCATCTCCGACGTGAAGG参照Lyophilized HS Taq PCR Master Mix(TAKARA)试剂盒说明书进行PCR扩增，选择扩增片段约为680bp的样品进行序列测定。将序列测定后纯化病毒 rPRV-FJ-delTK。

[0053] 按照常规方法提取rPRV-FJ-delTK基因组，取提取的基因组DNA (3μg)、pPED-RBDCD40L质粒(5μg)和psgRNA-gE参照 Lipofectamine 3000(Thermo fisher scientific)说明书转染生长状态良好的293T细胞，转染后37℃培养至出现细胞病变。取病毒上清接种 ST细胞，挑取绿色荧光嗜斑，进行三轮嗜斑纯化，将纯化病毒命名为rPRV-TIE18(RBD)。

[0054] pPED-RBDCD40L质粒含有gE和28K基因同源臂，并在同源臂中间有CMV启动子，编码PEDV S截短蛋白和CD40L融合蛋白的编码序列以及poly A信号序列。因此该质粒重组到伪狂犬病毒上以后可以表达出PEDV S蛋白和CD40L蛋白融合蛋白。

[0055] 5、重组病毒的保存

[0056] 将鉴定后的rPRV-TIE18(RBD)病毒按照常规方法接种BHK21细胞，培养至出现CPE后收获病毒上清，分装后-80℃保存。

[0057] 该毒株于2018年08月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路 1号院3号的中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名：猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；保藏编号：CGMCC NO.16289。

[0058] 实施例2

[0059] rPRV-TIE18(RBD)的致病性

[0060] 取1～3日龄PRV抗体阴性仔猪20头，随机分为4组分别标记为 A、B、C、D组，按照下表进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日。

[0061] 表2 rPRV-TIE18(RBD)和PRV-FJ对初生仔猪的致病性试验

[0062]组别 攻毒毒株 攻毒剂量 接种方式 备注
A rPRV-TIE18(RBD) 108TICD50 滴鼻  
B rPRV-TIE18(RBD) 107TICD50 滴鼻  
C DMEM培养液 2.0ml 滴鼻 空白对照
D PRV-FJ 107TICD50 滴鼻  

[0063] 攻毒后每日观察并测定仔猪体温，观察是否出现伪狂犬病临床症状和死亡。结果如下表3所示rPRV-TIE18(RBD)滴鼻后均未出现体温升高和其他临床症状，而滴鼻接种PRV-FJ的仔猪在攻毒后第二天有仔猪出现体温升高(见图2)、腹泻、呕吐症状和神经症状，攻毒后第3天仔猪死亡，在攻毒后第4天全部死亡。空白对照组未出现任何临床症状，试验整个过程中均正常。

[0064] 表3 PRV-TIE18(RBD)和PRV-FJ对初生仔猪致病性试验结果统计

[0065] 组别 发热 腹泻呕吐 神经症状 死亡数量A 0/5 0/5 0/5 0/5
B 0/5 0/5 0/5 0/5
C 0/5 0/5 0/5 0/5
D 5/5 4/5 4/5 5/5

[0066] 实施例3

[0067] 猪伪狂犬病活疫苗rPRV-TIE18(RBD)的制备和检验

[0068] 将rPRV-TIE18(RBD)接种BHK细胞，待90％以上细胞病变时收获病毒液。将收获病毒液2倍稀释后与明胶蔗糖保护剂(含2％明胶和10％蔗糖)等体积混合后，按2ml/瓶分装进行冷冻真空干燥。按照《中国兽药店》附录检验无细菌与支原体污染，无外源病毒污染。培养病毒液效价为108.0TCID50/ml，冻干疫苗恢复成原体积病毒含量分别为107.25TCID50/ml。

[0069] 实施例4

[0070] 猪伪狂犬病活疫苗rPRV-TIE18(RBD)的免疫原性

[0071] (1)PRV-TIE18(RBD)对PRV免疫原性试验

[0072] 选取3-4周龄猪伪狂犬病抗原抗体阴性仔猪15头，随机均分为 A、B、C共3组，按表4进行肌肉注射接种。疫苗接种后28日，所有试验猪采血分离血清，进行gB抗体(IDEXX)、gE抗体(IDEXX)、以及血清中和抗体(PRV-FJ中和)检测。免后28日采血结束，所有试验猪滴鼻接种PRV-FJ(107TICD50/头)进行攻毒保护试验。

[0073] 表4 PRV-TIE18(RBD)对PRV免疫原性试验分组

[0074]组别 毒株 动物日龄 免疫剂量 攻毒毒株 攻毒剂量
A PRV-TIE18(RBD) 3-4周龄 105.0TICD50 PRV-FJ 107TICD50
B PRV-Bartha K61 3-4周龄 105.5TICD50 PRV-FJ 107TICD50
C DMEM 3-4周龄 2.0ml PRV-FJ 107TICD50

[0075] 免疫后28日，2个免疫组与对照组的gE抗体检测结果均0/5阳性；PRV-TIE18(RBD)与PRV-Bartha K61共2个免疫组gB抗体均5/5 阳性，对照组gB抗体0/5阳性；PRV-TIE18(RBD)免疫组对PRV-FJ 的血清中和抗体(均值61)比PRV-Bartha K61免疫组(均值36)更高，对照组无PRV-FJ中和抗体。试验数据见图1，图1中：gB/gE 抗体检测，S/N值小于0.6为阳性，大于0.7为阴性，0.6至0.7为可疑。

[0076] PRV攻毒保护试验结果见表5。PRV-FJ攻毒后，PRV-TIE18(RBD) 免疫组均未出现发热与精神食欲不振，连续观察14日全部存活，5/5 保护；PRV-Bartha K61免疫组1/5出现发热与精神食欲减退，观察期内全部存活，1/5发病，4/5保护；对照组全部发热，全部出现精神食欲减退，观察期内死亡2头，5/5发病，2/5死亡。

[0077] 表5 PRV-TIE18对PRV免疫原性攻毒保护试验结果统计

[0078]

[0079]

[0080] (2)PRV-TIE18(RBD)对PEDV免疫原性试验

[0081] 选取3日龄猪流行性腹泻病毒抗原抗体阴性仔猪15头，随机均分为A、B、C共3组，按表6进行肌肉注射接种。疫苗接种后14 日，所有试验猪采血分离血清，进行血清中和抗体检测。免后14日采血结束，所有试验猪口服接种PEDV-SA014(106.0TICD50/头)进行攻毒保护试验。

[0082] 表6 PRV-TIE18(RBD)对PEDV免疫原性试验分组

[0083] 组别 毒株 动物日龄 免疫剂量 攻毒毒株 攻毒剂量D PEDV-CV777 3日龄 105.0TICD50 PEDV-SA014 106.0TICD50
E PRV-TIE18(RBD) 3日龄 105.0TICD50 PEDV-SA014 106.0TICD50
6.0
F DMEM 3日龄 2.0ml PEDV-SA014 10 TICD50

[0084] 免疫后14日采血进行PEDV中和抗体检测，PRV-TIE18(RBD) 免疫组血清中和抗体均值为1：36；PEDV-CV777免疫组中和抗体均值1：33，略高于PRV-TIE18(RBD)免疫组。试验数据见图3。

[0085] 以PEDV SA014攻毒后，PRV-TIE18(RBD)免疫组与 PEDV-CV777免疫组均未出现腹泻症状，连续观察7日，所有试验猪存活，均5/5保护；对照组全部出现腹泻症状，有3头出现精神、食欲不振，5/5发病。

[0086] 表7 PRV-TIE18(RBD)对PEDV免疫原性攻毒保护试验结果统计

[0087]组别 腹泻 呕吐 精神食欲不振 死亡数量 结果
A 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5保护
B 0/5 0/5 0/5 0/5 5/5保护
C 5/5 0/5 3/5 0/5 5/5发病

[0088] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。