一种混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法

摘要

本发明公开了一种混合发酵生产L‑哌啶甲酸的方法，以产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株作为发酵菌株生产L‑哌啶甲酸，其中，所述的赖氨酸环化脱氨酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以葡萄糖为底物，通过两个菌株共同发酵生产L‑哌啶甲酸。

权利要求

1.一种混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，以产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株共同作为发酵菌株发酵生产L-哌啶甲酸；

其中，

所述产赖氨酸的菌株为导入了氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的CCTCC NO. M 2013239菌株；

所述过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株的构建方法如下：将赖氨酸环化脱氨酶基因克隆到表达质粒中，得到重组质粒，将重组质粒与pGro7质粒共同转化宿主菌，得到过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株，所述表达质粒为pET28a，所述的宿主菌为E.coliBL21(DE3)，所述的赖氨酸环化脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，所述发酵生产L-哌啶甲酸，其发酵培养基包括如下组分：葡萄糖1 50g/L、硫酸铵1 10g/L、硫酸亚铁0 2g/L，酵母粉1 3g/L、蛋白胨3 10g/L、氯~ ~ ~ ~ ~化钾0.1 1.0g/L、七水硫酸镁0.5 2.0g/L、维生素B1 30 100mg/L。

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3.根据权利要求1所述混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，所述产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株的DCW比例为3:1 1:3。

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4.根据权利要求1所述混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，发酵生产L-哌啶甲酸的方法包括如下步骤：(1) 分别活化产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株，将产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株按照DCW比例为3:1 1:3接种到发酵培养基中；

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(2) 加入诱导剂，诱导赖氨酸环化脱氨酶表达；诱导条件为18 30°C，100 400rpm；

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(3) 发酵生产L-哌啶甲酸，发酵条件为25-47°C，100 400rpm。

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说明书

一种混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，属于发酵技术领域。

背景技术

[0002] 哌啶甲酸是一种手性分子，是多种杂环聚酮类手性药物生产合成的重要前体。如雷帕霉素，FK506及FK520等。它们有潜在的免疫抑制剂活性，神经营养活性和抗真菌活性。当前雷帕霉素及其类似物在临床上可用于预防器官移植后的免疫排斥、治疗晚期肾癌、作为皮肤病学及心脏病学领域的药物。哌啶甲酸衍生物则负责构成这类化合物的共同核心结构特征：FKBP12结合基序，这个结构基序可参与它们与FKBP12的结合。哌啶甲酸对于这类化合物的生物合成是必不可少的，哌啶甲酸的供给是影响其产量的重要因素。1997年，Lee M.S.等人的报道认为增量供给L-赖氨酸时，L-哌啶甲酸的水平得到了提高，从而使雷帕霉素产量也得到了提高。在2013年，Xia等人的报道中，提高FK506生产菌株中的哌啶甲酸合成基因的表达水平后，FK506的产量也增加了。另外，哌啶甲酸还参与合成抗肿瘤药物VX710、苦马豆碱等，抗生素山卓霉素、万可霉素等，在医学及生理学等领域具有非常高的应用价值。哌啶甲酸可以作为这些重要药物的前体之外，也有很多关于L-哌啶甲酸自身的生物活性及临床应用的报道。

[0003] 在2001年以前，L-哌啶甲酸主要通过化学合成来生产。然而，对于手性化合物来说使用化学合成相对较为困难，往往步骤繁杂，并且会污染环境。随着最近二三十年中对人们生产哌啶甲酸的酶的认识的进步，生物合成法也逐渐发展起来。2002年，Fuji及其同事偶然发现了一个来自大肠杆菌中的由proC编码的P5C还原酶可还原哌啶-6-羧酸，而P5C还原酶与L-赖氨酸ε-转氨酶共同作用可将L-赖氨酸转化为L-哌啶甲酸。他们构建了过表达这两种酶的工程菌株，经159h的培养发酵，成功生产了3.9g/L的L-哌啶甲酸；2015年，Yasushi Tani及其同事，在大肠杆菌中构建了来自日本鲭鱼(Scomber japonicus)的L-赖氨酸α-氧化酶，以及来自恶臭假单胞菌的P2C还原酶，发酵45h生产了45.1g/L高光学纯的L-哌啶甲酸。2016年，Fernando Pérez-García等人在一株赖氨酸高产的谷氨酸棒状杆菌构建了来自Silicibacter pomeroyi的L-赖氨酸6-脱氢酶基因LysDH及proC，首次完成了以葡萄糖为起点的L-哌啶甲酸转化，其总产率约为0.09g/g。

[0004] 尽管有多篇关于生物法合成L-哌啶甲酸的报道，但其中大多都是构建两种及以上的酶才能实现L-哌啶甲酸的转化。而使用赖氨酸环化脱氨酶(Lysine cyclodeaminase,LCD)生产L-哌啶甲酸仅需一种酶即可完成赖氨酸的脱氨、环化和还原的过程，生产哌啶甲酸。无论从初始构建成本、后续转化效率还是菌株稳定性等方面考虑都具有很大的优势。然而，天然LCD常温下转化速率相对较小，在高温(60°以上)有较高的反应速率但酶在此温度下酶活却迅速降低。2017年，Ying等人将来自S.pristinaespiralis的LCD进行了定向突变改造，获得了pipA-V61-V94，将酶活提高了约1.8倍。同年他们将带有包含pipA-V61-V94在内的五种基因、共三种重组质粒导入同一株菌中，用于从葡萄糖生产L-哌啶甲酸，其产率达到了0.13g/g。但是这种转化方法需共同表达多种蛋白，存在构建难度高、稳定性差等不利特性。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种L-哌啶甲酸的新型发酵生产方法，解决目前存在的困难，可以经济地、简便地、稳定地、大规模地生产L-哌啶甲酸。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0007] 一种混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，以产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株作为发酵菌株生产L-哌啶甲酸，其中，所述的赖氨酸环化脱氨酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述过表达赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 作为优选，所述产赖氨酸的菌株为E.coli NT1003。该菌株保存在中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC  No.M 2013239，该菌株在具体信息已经在申请号为201310285525.X的中国专利中详细公开。本发明中的实施例中，通过在E.coli NT1003菌株中导入氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，使E.coli NT1003菌株具有氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性，本发明中将其统一命名为E.coli LYS。

[0009] 本发明以来自始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis ATCC25486)的赖氨酸环化脱氨酶SpLCD为基础，经分子改造，得到SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。以E.coli BL21(DE3)为宿主菌，将含有分子伴侣基因的pGro7质粒和含赖氨酸环化脱氨酶SpLCD的质粒(pET28a-Val61-Val94-SpLCD)转化E.coli BL21(DE3)，即得到本发明中的E.coli LPA2菌株。

[0010] 作为优选，所述过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株中导入了含分子伴侣基因的质粒，导入分子伴侣能够协助赖氨酸环化脱氨酶更好地表达。

[0011] 作为优选：所述过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株的构建方法如下：

[0012] 将赖氨酸环化脱氨酶基因共同克隆到表达质粒中，得到重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，得到过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株，其中，所述表达质粒为pET28a，所述的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。

[0013] 作为优选，所述过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株的构建方法如下：

[0014] 将含有分子伴侣基因的pGro7质粒与含赖氨酸环化脱氨酶基因(SEQ ID NO.2)的重组质粒共同转化宿主菌，得到过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株，所述的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。

[0015] 作为优选，所述发酵生产L-哌啶甲酸，其发酵培养基包括如下组分：葡萄糖1～50g/L、硫酸铵1～10g/L、硫酸亚铁0-2g/L，酵母粉1～3g/L、蛋白胨3～10g/L、氯化钾0.1～
1g/L、七水硫酸镁0.5～2.0g/L、维生素B1 30～100mg/L。所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7。

[0016] 作为优选，所述产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株的DCW比例为3:1～1:3，优选1:1。

[0017] 作为优选，发酵生产L-哌啶甲酸的方法包括如下步骤：

[0018] (1)分别活化产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株，将产赖氨酸的菌株和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株按照DCW比例为3:1～1:3接种到发酵培养基中；

[0019] (2)加入诱导剂，诱导赖氨酸环化脱氨酶表达，并诱导产赖氨酸的菌株产赖氨酸；诱导条件为18～30℃，100～400rpm；

[0020] (3)发酵生产L-哌啶甲酸，发酵条件为25-47℃，100～400rpm。

[0021] 混合菌发酵生产L-哌啶甲酸的方法，具体步骤如下：

[0022] (1)将E.coli LYS接种于含氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养8～36h，作为E.coli LYS的一级种子液；

[0023] (2)将E.coli LPA2接种于含氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养8～36h，作为E.coli LPA2的一级种子液；

[0024] (3)将E.coli LYS菌株和E.coli LPA2的一级种子液按DCW比例为3:1～1:3接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中，37℃、200rpm培养2h；

[0025] (4)加入L-阿拉伯糖溶液，诱导分子伴侣表达，18～30℃、100～400rpm培养1～8h；

[0026] (5)再加入加入IPTG溶液，诱导赖氨酸环化脱氨酶表达，18～30℃、100～400rpm培养1～8h；

[0027] (6)在发酵条件下发酵生产L-哌啶甲酸，发酵条件为25-47℃、100～400rpm培养48-72h。

[0028] L-哌啶甲酸的高效液相色谱层析(HPLC)检测方法：

[0029] 一、异硫氰酸苯酯(PITC)氨基酸衍生化：

[0030] (1)配制14％三乙胺-乙腈溶液和1.25％PITC-乙腈溶液；(2)取样品400μL，再加入200μL配制好的14％三乙胺-乙腈溶液，再加入200μL 1.25％PITC-乙腈溶液，混匀，静置1h；
(3)加入己烷800μL，充分震荡后静置10min；(4)混合液分层后取下层溶液，用0.22μm滤膜过滤，用于后续分析。

[0031] 二、HPLC分析检测方法：

[0032] 色谱柱为Grace Alltima C18 5u(250mm×4.6mm)；检测器为UV检测器，检测波长254nm。运行时柱温设定为40℃，流速1mL/min，进样量5μL。流动相A为0.1mol·L-1醋酸钠水溶液与乙腈混合液，比例为93:7(v/v)；流动相B为80％乙腈；流动相比例梯度如下表。

[0033] 表1流动相比例梯度如下表

[0034]

[0035] 有益效果：

[0036] 本发明利用产赖氨酸的菌株为E.coli NT1003和过表达赖氨酸环化脱氨酶的菌株共同作为发酵菌株发酵生产L-哌啶甲酸，操作更加简便，利于大规模生产；使用葡萄糖而不是赖氨酸作为底物，更加经济；使用多种菌株混合生产的方法，使每株菌株构建更加简单，菌株负担更低，遗传性能更加稳定。

附图说明

[0037] 图1赖氨酸环化脱氨酶底物结合与产物释放结构模拟图。

[0038] 图2赖氨酸环化脱氨酶Ile61与NAD+结构模拟图。

具体实施方式

[0039] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。

[0040] 实施例1：表达赖氨酸环化脱氨酶的重组质粒的构建。

[0041] 克隆来自S.pristinaespiralis(ATCC25486)赖氨酸环化脱氨酶基因(SpLCD)(基因由思普金公司合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。)两端加上XhoI和NcoI酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pET28a相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制之下，获得了重组质粒pET28a-SpLCD。

[0042] 实施例2：赖氨酸环化脱氨酶Ile61的改造。

[0043] 通过对SpLCD结构的分析，找到了底物结合与产物释放过程中的瓶颈氨基酸位点Ile61。从图1b中可以看出，Ile61与Asp236之间的距离为整个通道中最窄的，成为了限制底物小分子赖氨酸进入活性中心的瓶颈。从图2a可以看出,Ile61与NAD+之间的距离造成了产物释放位点1较大的空间位阻，成为限制产物小分子L-哌啶甲酸离开活性中心的瓶颈。过全质粒PCR、饱和突变筛选，获得了最优突变株Val61-SpLCD与重组质粒pET28a-Val61-SpLCD。

[0044] 实施例3：赖氨酸环化脱氨酶Ile94的改造。

[0045] 通过对SpLCD结构的分析，找到了底物结合与产物释放过程中的瓶颈氨基酸位点Ile94。从图2b中可以看出,Ile94与NAD+之间的距离造成了产物释放位点2较大的空间位阻，成为限制产物小分子L-哌啶甲酸离开活性中心的瓶颈。通过全质粒PCR、饱和突变筛选，获得了最优突变株Val94-SpLCD与重组质粒pET28a-Val94-SpLCD。

[0046] 实施例4：赖氨酸环化脱氨酶Ile61与Ile94的改造。

[0047] 通过对SpLCD结构的分析，找到了底物结合与产物释放过程中的瓶颈氨基酸位点Ile94与Ile61,通过全质粒PCR、饱和突变筛选，获得了最优组合突变株Val61-Val94-SpLCD与重组质粒pET28a-Val61-Val94-SpLCD(在pET28a质粒中克隆SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

[0048] 实施例5：表达含赖氨酸环化脱氨酶突变株的重组基因工程菌株的构建。

[0049] 将pET28a-Val61-SpLCD,pET28a-Val94-SpLCD与pET28a-Val61-Val94-SpLCD通过CaCl2化学转化法转化到E.coli BL21(DE3)中，即得到表达了改造后赖氨酸环化脱氨酶的基因工程重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-SpLCD，E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val94-SpLCD与E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-Val94-SpLCD。

[0050] 实施例6：重组大肠杆菌高密度发酵获取作为催化剂的休止细胞。

[0051] 分别将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-SpLCD，E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val94-SpLCD与E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-Val94-SpLCD接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体种子培养基中。

[0052] 培养基成分具体为：蛋白胨10g/L；J、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L在37℃、200rpm条件下培养过夜后，按1％(ml/ml)接种量接种至高密度发酵液体培养基中(含同等浓度卡那霉素)培养基成分具体为：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、K2HPO4 8.7g/L；NaH2PO4 4.2g/L、(NH4)2SO4 5.5g/L；MgSO4 2.5g/L、微量营养液1.6g/L(CaCl2·2H2O10g/L、ZnSO4·7H2O 0.50g/L、CuCl2·2H2O 0.25g/L、MnSO4·H2O 2.5g/L、CoCl2·6H2O1.75g/L、H3BO3 0.125g/L、AlCl3·
6H2O 2.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 10g/L，37℃、200rpm培养至OD600为10时(约5h)，加入诱导剂0.1mM IPTG，25℃诱导表达16h后，菌液于8000rpm，4℃离心5min，弃上清，沉淀用中性缓冲溶液洗涤2-3次即为休止细胞，-20℃冰柜冻存备用。

[0053] 实施例7：赖氨酸环化脱氨酶及其突变株的酶学性质对比。

[0054] 将含赖氨酸环化脱氨酶突变株的基因工程重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-SpLCD，E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val94-SpLCD与E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-Val94-SpLCD休止细胞催化剂在37℃，1g/L赖氨酸及100mM HEPES缓冲溶液(pH＝7.2)的条件下进行了酶活力与表观动力学检测，结果如表2，相比野生型(WT-LCD，其他条件相同，但是赖氨酸环化脱氨酶未突变的大肠杆菌重组菌),所有的突变株的酶活力与催化转化数均有明显的提高，其中E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-Val94-SpLCD的酶学表现最好，酶活力相比野生型提高了约1.84倍，催化转化数相比野生型提高了约9倍。

[0055] 表2.赖氨酸环化脱氨酶野生型及其突变株的酶学性质对比

[0056]

[0057] 实施例8：E.coli LYS菌株和E.coli LPA2菌株的构建。

[0058] 将pET28a质粒和pACYC质粒转化E.coli NT1003，得到产赖氨酸同时具有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的E.coli LYS菌株。

[0059] 将pGro7质粒转化E.coli BL21(DE3)-pET28a-Val61-Val94-SpLCD菌株，得到E.coli LPA2菌株。

[0060] 实施例9：

[0061] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0062] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0063] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0064] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:3；

[0065] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0066] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为471.70mg/L。

[0067] 实施例10：

[0068] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0069] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0070] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0071] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0072] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0073] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为545.99mg/L。

[0074] 实施例11：

[0075] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0076] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0077] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0078] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:3；

[0079] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0080] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为249.84mg/L。

[0081] 实施例12：

[0082] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0083] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖40g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0084] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0085] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0086] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0087] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为343.43mg/L。

[0088] 实施例13：

[0089] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0090] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖50g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0091] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0092] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0093] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0094] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为241.54mg/L。

[0095] 实施例14：

[0096] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为200mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0097] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0098] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0099] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0100] 所述的诱导条件为18℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；

[0101] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为309.83mg/L。

[0102] 实施例15：

[0103] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0104] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0105] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0106] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0107] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为25℃，200rpm；

[0108] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为299.16mg/L。

[0109] 实施例16：

[0110] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0111] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0112] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0113] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0114] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为30℃，200rpm；

[0115] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为384.46mg/L。

[0116] 实施例17：

[0117] (1)将E.coli LYS接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养24h，作为E.coli LYS的一级种子液；(2)将E.coli LPA2接种于含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的LB培养基中置于培养条件下培养12h，作为E.coli LPA2的一级种子液；(3)将两种菌株的一级种子液接种于30mL含34mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(4)加入L-阿拉伯糖使发酵液中L-阿拉伯糖浓度为1g/L，将发酵液置于培养条件下培养1h；(5)加入IPTG使发酵液中IPTG浓度为100mg/L，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(7)将发酵液置于发酵条件下发酵48h。

[0118] 所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/L、硫酸铵10g/L、硫酸亚铁0.3g/L，酵母粉2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁1.6g/L、维生素B1 60mg/L；

[0119] 所述的发酵培养基使用MOPOS缓冲液(100mM)，调整pH值调整至7；

[0120] 所述的E.coli LYS和E.coli LPA2两种菌株的一级种子液接种于发酵培养基的DCW比例为1:1；

[0121] 所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为47℃，200rpm；

[0122] 经HPLC分析检测，L-哌啶甲酸产量为399.95mg/L。