本发明属于林业分子生物学技术领域，具体涉及了一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选和甄别近缘种的方法。基于山茶属物种叶绿体DNA序列微卫星位点相对一致性，针对种间存在变异的特定微卫星位点设计cpSSR引物；提取不同山茶属物种的DNA，与引物混合、扩增、电泳检测；最终获得山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物16对。甄别近缘种的方法包括：提取浙江红山茶及其近缘种的DNA，采用多态性引物进行毛细管电泳分离，按PCR产物片段分离甄别近缘种。本发明提供的引物筛选方法快速高效，广泛适用于其他具有叶绿体基因组序列信息的植物种属，获得的多态性cpSSR标记可用于山茶属植物的系统分类、近缘种的甄别及遗传多样性分析等研究。
1.一种山茶属叶绿体微卫星分子标记的多态性引物的组合物，其特征在于，包括9对山茶属cpSSR分子标记的多态性引物，其引物信息为：Cc_cpSSR-04的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示，Cc_cpSSR-04的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
Cc_cpSSR-06的正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示，Cc_cpSSR-06的反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
Cc_cpSSR-12的正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示，Cc_cpSSR-12的反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
Cc_cpSSR-15的正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示，Cc_cpSSR-15的反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
Cc_cpSSR-40的正向引物如序列表中SEQ ID NO.19所示，Cc_cpSSR-40的反向引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
Cc_cpSSR-49的正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示，Cc_cpSSR-49的反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
Cc_cpSSR-71的正向引物如序列表中SEQ ID NO.27所示，Cc_cpSSR-71的反向引物如序列表中SEQ ID NO.28所示；
Cc_cpSSR-74的正向引物如序列表中SEQ ID NO.29所示，Cc_cpSSR-74的反向引物如序列表中SEQ ID NO.30所示；
Cc_cpSSR-75的正向引物如序列表中SEQ ID NO.31所示，Cc_cpSSR-75的反向引物如序列表中SEQ ID NO.32所示。
2.根据权利要求1所述的一种山茶属叶绿体微卫星分子标记的多态性引物的组合物，其特征在于，所述多态性引物的PCR扩增的体系为：50ng DNA模板，1.0μL 10X PCR Buffer，
2.5mmol/L MgCl2，0.25mmol/L dNTP，上下游引物各0.5ng/μL，0.5U Taq DNA聚合酶，所述PCR扩增的体系的总体积为10μl；所述多态性引物的PCR扩增的程序为：94℃，预变性5min；
94℃，变性30s，52～63℃，退火30s，72℃，延伸30s，25个循环；72℃，延伸7min，4℃保存。
3.一种甄别浙江红山茶及其近缘种的山茶属cpSSR的多态性引物的组合物，其特征在于，包括8对山茶属cpSSR分子标记的多态性引物，所述8对引物的编号分别为Cc_cpSSR-04、Cc_cpSSR-12、Cc_cpSSR-15、Cc_cpSSR-40、Cc_cpSSR-49、Cc_cpSSR-71、Cc_cpSSR-74、Cc_cpSSR-75，其引物信息为：Cc_cpSSR-04的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示，Cc_cpSSR-04的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
Cc_cpSSR-12的正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示，Cc_cpSSR-12的反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；
Cc_cpSSR-15的正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示，Cc_cpSSR-15的反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；
Cc_cpSSR-40的正向引物如序列表中SEQ ID NO.19所示，Cc_cpSSR-40的反向引物如序列表中SEQ ID NO.20所示；
Cc_cpSSR-49的正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示，Cc_cpSSR-49的反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；
Cc_cpSSR-71的正向引物如序列表中SEQ ID NO.27所示，Cc_cpSSR-71的反向引物如序列表中SEQ ID NO.28所示；
Cc_cpSSR-74的正向引物如序列表中SEQ ID NO.29所示，Cc_cpSSR-74的反向引物如序列表中SEQ ID NO.30所示；
Cc_cpSSR-75的正向引物如序列表中SEQ ID NO.31所示，Cc_cpSSR-75的反向引物如序列表中SEQ ID NO.32所示。
4.一种利用权利要求3所述山茶属cpSSR的多态性引物的组合物甄别浙江红山茶及其近缘种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取浙江红山茶及其近缘种的厚叶红山茶、闪光红山茶、全缘红山茶、南山茶的细胞核DNA；
(2)将所述山茶属cpSSR分子标记的多态性引物中的8对引物和所述浙江红山茶及其近缘种的DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；所述8对引物的编号分别为Cc_cpSSR-04、Cc_cpSSR-12、Cc_cpSSR-15、Cc_cpSSR-40、Cc_cpSSR-49、Cc_cpSSR-71、Cc_cpSSR-74、Cc_cpSSR-75，且经5’FAM修饰后进行PCR扩增，红色标记；
(3)对PCR扩增产物采用毛细管电泳，进行PCR产物长度多态性检测；
(4)获取毛细管电泳结果的方法为：利用PeakScanner Software1.0软件分析毛细管电泳结果，根据峰图确定所述扩增产物的条带长度；按不同单倍型统计数据，采用popgene软件计算Nei遗传相似性系数；再利用NTSYS2.2软件中的SAHN程序中的UPGMA，构建遗传关系聚类图；
(5)将毛细管电泳结果与表1的鉴定结果对比，完成物种甄别；
引物编号 厚叶红山茶 闪光红山茶 浙江红山茶 全缘红山茶 南山茶Cc_cpSSR-04 293 289，292，293 292，293，296，299 293，299 292，295Cc_cpSSR-12 381 380，381，383 380，381，382，383 380，381 378，379Cc_cpSSR-15 262 267，268 258，268，269 268 257，268Cc_cpSSR-40 301 301，302 300，301 301 301，311Cc_cpSSR-49 334 322，334 322，334 322，334 322，334Cc_cpSSR-71 409 409，410 409，410 409，410 409Cc_cpSSR-74 386，387 385，386 385，386 386 382，386Cc_cpSSR-75 326 316，326 316，326 316，326 316，326。
一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选
和甄别近缘种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及林业分子生物技术领域，特别涉及一种山茶属叶绿体微卫星分子标记的多态性引物及其筛选方法、甄别近缘种的方法。
背景技术
[0002] 山茶属(Camellia L.)是山茶科内最大的属，属内多个物种具有重要的经济价值，如茶组中的茶(C.sinensis)是世界三大饮料之一；而油茶组多个物种的种子含油量很高且可供食用，其中最著名的是称之为东方橄榄树的油茶(C.oleifera)；此外，红山茶组诸多物种具有巨大观赏价值，如国际上著名的山茶花(C.japonica)，同时还有观赏和油用兼具的物种如浙江红山茶(C.chekiangoleosa)。山茶属各物种间关系复杂，树种形态变异丰富多样，同时多倍化现象较为集中普遍，国内对该类树种的分类主要依据形态特征，还存在较大的分歧。该属系统发育研究是目前国内的研究热点。
[0003] 叶绿体基因组(Chloroplast genome DNA，cpDNA)中广泛分布着微卫星序列(Chloroplast simple sequence repeats，cpSSR)可开发成分子标记，其不仅具有SSR标记共显性、高多态性、分布广泛性等诸多优点，同时还继承了叶绿体基因组单性遗传、结构简单、相对保守的特点，目前广泛应用于种质资源鉴定、亲本分析、群体进化及系统发育分析研究，尤其在更高分类水平和自然植物群体间基因漂移研究上应用价值巨大。cpSSR分子标记的开发方式一般有三种方法：1)利用基因库查找已知cpDNA序列，结合PCR技术开发cpSSR；2)通过测序获得cpDNA序列，结合PCR技术开发cpSSR；3)利用标记的通用性，从已知亲缘关系较近的物种的cpSSR中筛选。方法三获得的为近缘物种的通用性cpSSR标记，往往容易出现假阳性扩增；而方法一与二开发获得的cpSSR标记真实可靠，但需要物种自身的cpDNA序列作为标记开发基础。近年来，随着测序技术的提升而测序价格的大幅降低，叶绿体基因组测序的工作大量开展，山茶属叶绿体全基因组数据库也日渐充实，在cpDNA序列基础上开发cpSSR标记成为可能，目前此方面研究未见报道。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
[0005] 传统的cpSSR标记开发，遵循利用cpDNA序列检索微卫星位点，设计引物再通过PCR试验筛选多态性引物的一般路线，其中多态性引物筛选环节，由于具多态性的微卫星位点需要通过在近缘种间通过PCR扩增试验进行比较获得，耗时费力。
发明内容
[0006] 本发明的目的是针对目前可在山茶属近缘种间通用的多态性cpSSR引物较少的现状，利用比较叶绿体基因组学的方法，在近缘物种叶绿体序列中的相同微卫星位点上通过分析微卫星位点的变异来快速筛选获得具有多态性的cpSSR标记。本发明的另一目的是解决浙江红山茶假苗充斥市场影响其育苗生产环节问题，利用部分cpSSR多态性引物对浙江红山茶及其近缘种进行甄别。浙江红山茶种植面积在油茶树种据全国第四，具有较大的经济价值，占据市场的主导地位，但其与近缘种间幼苗期的外观差异较小，使用传统方法难以分辨，因此具有十分重要的现实意义。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0008] 本发明提供16对山茶属cpSSR分子标记的多态性引物，其引物序列如表4所示：
[0009] 表4山茶属cpSSR的多态性引物
[0010]
[0011]
[0012] cpSSR分子标记体系的特征包括：PCR反应体系和PCR反应程序；
[0013] PCR反应体系：10μl中包括50ng DNA模板，1.0μL 10X PCR Buffer，2.5mmol/L Mgcl2，0.25mmol/L dNTP，上下游引物各0.5ng/μL，0.5U Taq DNA聚合酶；
[0014] PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃，30s，Tm，30s，72℃，30s，25个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。各引物对应的退火温度详见表2。8％聚丙烯酰胺凝胶检测PCR扩增产物。
[0015] 本发明还提供了一种山茶属叶绿体微卫星分子标记的多态性引物的筛选方法：
[0016] (1)通过Miq250测序技术获得浙江红山茶的叶绿体全基因组序列，结合Genbank数据库已有山茶属植物的叶绿体全基因组，利用比较叶绿体基因组学方法，分析山茶属各物种cpSSR在叶绿体基因组分布特征呈现较为一致的规律；
[0017] (2)以浙江红山茶的叶绿体全基因组序列为参考标准，通过blast比对不同近缘种叶绿体基因组序列上相同微卫星位点的变异情况，快速筛选具有多态性的微卫星位点，并开发对应的cpSSR标记引物；
[0018] (3)提取不同山茶属物种的DNA，与cpSSR标记引物混合并进行扩增、电泳检测；获得山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物16对，从而快速有效的开发在山茶属近缘种内通用且具有一定多态性的cpSSR标记。
[0019] 本发明还提供一种利用多态性引物甄别浙江红山茶及其近缘种的方法，所述方法包括以下步骤：
[0020] 1)提取浙江红山茶及其近缘种的厚叶红山茶(C.crassissima)、闪光红山茶(C.lucidissima)、全缘红山茶(C.subintegra)、南山茶(C.semiserrata)的细胞核DNA；
[0021] 2)将所述山茶属cpSSR分子标记的多态性引物中的8对引物和所述浙江红山茶及其近缘种的DNA混合并进行PCR扩增，得到扩增产物；所述8对引物的编号分别为Cc_cpSSR-04、Cc_cpSSR-12、Cc_cpSSR-15、Cc_cpSSR-40、Cc_cpSSR-49、Cc_cpSSR-71、Cc_cpSSR-74、Cc_cpSSR-75，且经5’FAM修饰后进行PCR扩增，红色标记，片段大小依次为70bp、80bp、
100bp、120bp、160bp、180bp、200bp、240bp、280bp、320bp、360bp、400bp、450bp、490bp、
500bp；
[0022] (3)对PCR扩增产物采用毛细管电泳，进行PCR产物长度多态性检测；
[0023] (4)获取毛细管电泳结果的方法为：利用PeakScanner Software 1.0软件分析毛细管电泳结果，根据峰图确定所述扩增产物的条带长度(bp)。按不同单倍型统计数据，采用popgene软件计算Nei遗传相似性系数；再利用NTSYS2.2软件(http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html)中的SAHN程序中的UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic means，非加权组平均法)，构建遗传关系聚类图；
[0024] (5)将毛细管电泳结果与表1的鉴定结果对比，完成物种甄别；
[0025] 表1浙江红山茶及其近缘种的鉴定结果(单位bp)
[0026]
[0027]
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用生物信息学分析比较山茶属各物种cpSSR在叶绿体基因组分布特征呈现较为一致的规律，通过进一步比较不同物种相同微卫星位点上的变异情况，可以快速筛选获得具多态性的cpSSR标记。故而本发明提供一种快速筛选山茶属cpSSR多态性引物方法，同时获得的多态性cpSSR标记可应用于遗传多样性分析、种质资源鉴定、亲本鉴定、系统发育等相关研究领域。此外，本研究提供的cpSSR多态性引物可用于甄别浙江红山茶及其近缘种，大大避免苗木市场上“鱼目混珠”的现象，具有十分重要的意义。
附图说明
[0029] 图1为Cc_cpSSR-04与Cc_cpSSR-06对部分山茶属物种的PCR扩增的银染PAGE图；
[0030] 图2为Cc_cpSSR-12对浙江红山茶及其近缘种的毛细管电泳检测图；
[0031] 图3为利用ntsys2.2软件计算Nei遗传相似度系数矩阵，再用UPGMA构建的系统发育树图。
具体实施方式
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
[0033] 实施例1
[0034] 一、山茶属cpSSR分子标记的多态性引物的筛选
[0035] 1、叶绿体微卫星分子标记的挖掘与筛选
[0036] (1)浙江红山茶cpDNA序列的获得及预处理
[0037] 首先通过Chloroplast DNA Isolation kit获取叶绿体悬浮液，再利用DNeasy Plant Mini Kit提取浙江红山茶叶绿体DNA，构建测序文库，经Illumina Miseq250高通量测序反应获得叶绿体全基因组序列。测序数据经筛选去掉低质量序列后使用SOAPdenovo进行骨架拼接(最优Kmer为31)，同时利用Newbler，MITObim辅助组装，最后利用GapCloser补洞，最后获得完整的浙江红山茶叶绿体全基因序列(MG431968)。
[0038] (2)cpSSR多态性引物的筛选
[0039] 从GenBank公共数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载山茶属金花茶组凹脉金花茶(C.impressinervis，KF156835)、糙果茶组红皮糙果茶(C.crapnelliana，KF753632)、连蕊茶组尖连蕊茶(C.cuspidata，KF156833)、秃茶组丹寨秃茶(C.danzaiensis，KF156834)、小黄花茶组小黄花茶(C.luteoflora，KY626042)、油茶组油茶(C.oleifera，JQ975031)、实果茶组五柱滇山茶(C.yunnanensis，KF156838)和茶组茶(C.sinensis，KC143082)的叶绿体全基因组序列。使用MISA(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)(Sahu J，Sarmah R，Dehury B，et al.Mining for SSRs and FDMs from expressed sequence tags of Camellia sinensis[J].Bioinformation，2012，8(6)：260.)对所述山茶属植物的叶绿体全基因组进行cpSSR挖掘，检索微卫星重复基序的参数设定为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别为10、4、3、3、3、3，检索标准包括完美型(perfect)和复合型(compond)cpSSR。对不同植物叶绿体基因组中获得的cpSSR序列进行blast比对分析，挑选在物种间存在差异的cpSSR分子标记用于cpSSR多态性引物的设计与合成。
[0040] 2、山茶属cpSSR多态性引物的设计与合成
[0041] 基于上述获得的叶绿体微卫星分子序列，采用引物设计软件Primer Premier 5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)对上述筛选所得的cpSSR位点两侧翼保守序列进行引物设计。引物设计的主要参数为：引物长度为16～24bp，GC含量30％～60％，引物退火温度40～60℃，上下游引物退火温度差在2℃以内，预期产物长度100～
500bp，尽量避免二级结构。利用山茶属植物叶绿体全基因组挖掘并开发的cpSSR引物共80对，按Cc_cpSSR1-80进行编号，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0042] 采用多个山茶属近缘种总基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离：采用8％聚丙烯酰胺凝胶(10mL灌胶液中含4.2g尿素，1.25ml 10×TBE，70μl APS，10μl TEMED，2.0ml 40％胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺＝39∶1(w/w))，在垂直电泳槽(DYCZ-32型电泳槽(北京六一))中进行电泳分离，50bp Marker(天根)作为标准分子量，电泳产物经银染后对各位点进行数据判读。银染检测步骤为：10μl PCR产物加4μl 6×上样缓冲液，点样孔上样1μl，150V恒压电泳1～2h；电泳完毕，使用固定液(10％乙醇，0.5％乙酸(v/v)，溶剂为去离子水)固定10min，用去离子水漂洗2次，每次1min；再用银染液(0.15％硝酸银溶液(w/v))染色8min，去离子水漂洗2次，每次2min；最后用显影液(1.5％NaOH，0.00756％NaBO4，0.75％甲醛(w/v))显影至条带清晰，数码照相记录。比较验证扩增产物的差异从而筛选出在山茶属近缘种中具有多态性的cpSSR引物16对。部分检测结果见图1(注：
M：50bp DNA Ladder；1～18：部分山茶属物种PCR扩增，1号为白花浙江红山茶，2号离蕊红山茶，3号为毛蕊红山茶，4号为大果红山茶，5号为毛籽红山茶，6号为假多齿红山茶，7号为滇山茶，8号为山茶，9号为香港红山茶，10号为白花南山茶，11号为长尾红山茶，12号为厚叶红山茶，13号为多齿红山茶，14号为浙江红山茶，15号为杜鹃红山茶，16号为全缘红山茶，17号为南山茶，18号为油茶)。
[0043] 本发明提供的16对山茶属cpSSR分子标记的多态性引物具体参见表2：
[0044] 表2山茶属cpSSR的多态性引物的退火温度
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] (注：其中F表示正向，R表示反向。)
[0049] 二、山茶属cpSSR分子标记的多态性引物鉴定山茶属植物亲缘关系及甄别浙江红山茶及其近缘种
[0050] 在利用山茶属cpSSR分子标记的多态性引物甄别浙江红山茶及其近缘种的同时，可根据其结果鉴定其亲缘关系，其中样品具体来源信息如表3所示。
[0051] 表3山茶属5个近缘种的样品信息
[0052]
[0053] 近缘种甄别及亲缘关系鉴定的过程如下：
[0054] (1)PCR扩增：采用ABI9700(Applied Biosystems，Carlsbad，California，USA)执行PCR程序。经优化筛选，构建一个在山茶属物种中较为广谱的cpSSR标记体系。PCR反应体系：10μl中包括50ng DNA模板，1.0μL 10X PCR Buffer，2.5mmol/L Mgcl2，0.25mmol/L dNTP，上下游引物各0.5ng/μL，0.5U Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃，30s，Tm，30s，72℃，30s，25个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。各引物对应的退火温度详见表2。
[0055] (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初选出具多态性的8对引物，Cc_cpSSR-04、Cc_cpSSR-12、Cc_cpSSR-15、Cc_cpSSR-40、Cc_cpSSR-49、Cc_cpSSR-71、Cc_cpSSR-74、Cc_cpSSR-75。
[0056] (3)进一步进行毛细管电泳验证。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，使用5’FAM修饰，型号为ROX-500-ILS，红色标记，片段大小分别为70bp、80bp、100bp、120160bp、180bp、200bp、240bp、280bp、320bp、360bp、400bp、450bp、490bp、500，用ABI 3730分析仪进行PCR产物长度多态性检测。部分检测结果见图2。
[0057] (4)数据处理：毛细管电泳后，使用Peak Scanner Software V1.0(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4381867)读取结果，将所述cpSSR分子标记多态性引物在每个物种中扩增片段的范围记录下来，用A-B的形式表示，数字为扩增条带的长度，单位为bp。依据毛细管电泳结果对照表1提供的鉴定结果，即可完成浙江红山茶及其近缘种的鉴定。
[0058] 表1浙江红山茶及其近缘种的鉴定结果(单位bp)
[0059]
[0060]
[0061] (5)按不同单倍型统计数据，采用popgene软件计算Nei遗传相似性系数；再利用NTSYS2.2软件(http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html)中的SAHN程序中的UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic means，非加权组平均法)，构建遗传关系聚类图，见图3。
[0062] 结果表明：
[0063] 1)毛细管电泳检测，8对cpSSR分子标记的多态性引物在浙江红山茶及其近缘种DNA样品中扩增获得清晰的多态性条带，且在浙江红山茶不同地理群体的样本中均获得了多态性扩增，统计扩增片段大小，Cc_cpSSR-12可在378-379bp处一次性鉴别南山茶，Cc_cpSSR-15可在262bp处一次性鉴别厚叶红山茶，另8个标记两两组合可以将全缘红山茶与浙江红山茶区分出来。
[0064] 2)基于UPGMA的聚类图表明(图3)，供试的浙江红山茶、闪光红山茶、厚叶红山茶、全缘红山茶、南山茶之间亲缘关系存在差别，在Nei遗传相似性系数0.72处，5个物种可分为两大类，即光果茶亚组(浙江红山茶、闪光红山茶、厚叶红山茶、全缘红山茶)和滇山茶亚组(南山茶)。此外，根据Nei遗传相似性系数，表明5个物种的亲缘关系由远及近以此为：南山茶＞全缘红山茶＞厚叶红山茶＞浙江红山茶/闪光红山茶，其中浙江红山茶与闪光红山茶亲缘关系极近，符合前人研究将二者归并为浙江红山茶一种的论断。
[0065] 本发明利用山茶属cpSSR分子标记的多态性引物进行山茶属植物亲缘关系的鉴定，并利用cpSSR分子标记具有细胞核DNA微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，且具有叶绿体的单亲遗传、相对保守的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，进而使得本发明提供的山茶属植物亲缘关系鉴定的方法能够较为全面地反应山茶属植物之间的亲缘关系。此外，还可将cpSSR与细胞核SSR分子标记综合运用，能够更进一步全面、准确、客观反映物种细胞质和细胞核内的亲缘关系。
