一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用，属于工业发酵微生物固态培养发酵领域。本发明用于微生物固态通量发酵的培养基为片状，所述培养基包括下述重量百分比的组分：麸皮10％‑82.5％，豆粕10％‑80％，小麦5％‑70％，玉米淀粉1％‑5％，麦芽糊精粉0.5％‑1.5％。本发明的培养基用于固态通量培养时，可将这些培养基直接放入孔板不同的孔中进行后续处理，既能保证不同孔之间培养基的分装速度，同时也能保证培养基重量的一致性，从而实现固态通量培养装置的更高应用效率；并且，本发明的培养基易成型、不易破碎、崩解效果好且同批次培养基间误差小。

权利要求

1.一种培养基在用于微生物固态通量发酵中的应用，其特征在于，所述培养基为片状，所述培养基由下述重量百分比的组分组成：麸皮10％-82.5％，豆粕10％-80％，小麦5％-

70％，玉米淀粉1％-5％，麦芽糊精粉0.5％-1.5％；所述应用包括以下步骤：(a)将培养基置于固态通量培养装置中，加入水，润湿处理后，将培养基混匀；

(b)灭菌并冷却后，将微生物接入培养基中，进行发酵培养。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米淀粉在所述培养基中的重量百分比为2％，所述麦芽糊精粉在所述培养基中的重量百分比为1％。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述麸皮、豆粕和小麦的细度均为40-80目，所述玉米淀粉和麦芽糊精粉的细度均为80目以上。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，每片所述培养基的质量为0.4-0.9g。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基为圆片状。

6.如权利要求1或5所述的应用，其特征在于，所述培养基的直径为6-15mm，厚度为5-

10mm。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基的制备方法包括以下步骤：按比例称取所述培养基中的各组分，混合均匀后，进行压片处理，得到所述培养基。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

说明书

一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种培养基及其制备方法与应用，具体涉及一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 固态发酵是工业发酵微生物进行酶制剂、次级代谢产物工业化生产的常用方式。目前对于工业发酵微生物的固态发酵研究，主要集中在底物优化和菌种选育。底物优化是对固态发酵的工艺进行优化改造，以获得产品质量的提升；菌种选育是通过对生产菌株进行自然、化学、物理等方式进行诱变，以获得能够在固态发酵中提升产品质量的优良性状的目标菌株。但由于菌株突变的随机性以及后续筛选过程繁琐，往往导致菌种选育研究难度要远超过底物优化。传统的丝状真菌菌株选育过程，往往要经历多个步骤完成，在前期筛选阶段主要借助固体琼脂平板以及结合显色底物和透明圈的方式，进行菌株初步筛选。在后期的复筛过程，基本都是模拟正常工业生产培养基进行发酵应用和验证，在这个过程中通常采用三角瓶固态曲料进行发酵分析，同时在固态培养过程中为了保证曲料充分混匀发酵，还要定时的进行多次三角瓶摇曲操作；在后期进行固态发酵产物分析时，需要将曲料进行称重取出，浸提，并单独进行产物分析，整个过程工作量大、操作繁琐，不能实现工业发酵微生物的培养和筛选通量化。而且三角瓶的固态发酵过程中还不能实现通气和湿度的可控，往往会造成三角瓶的发酵结果与实际固体的结果存在较大的偏差，不能有效的指导实际生产应用。

[0003] 为了解决这一问题，发明人开发了一种固态通量培养装置及其应用(CN107446804A)，该装置能够实现工业发酵微生物丝状真菌的通量筛选。但在后续长期的应用中，发明人发现，在丝状真菌固态培养过程中进行多孔板培养基的无菌分装操作严重影响固态通量培养装置的应用效率。由于多孔板每个孔是连在一起的整体，每个孔都需要单独称料，同时孔的装载量也较小，因此在培养基分装过程中需要十分谨慎小心才能保证每孔分装培养基的一致性以及防止污染杂菌，该方面的操作极大影响固态通量培养装置使用效率。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用，采用该培养基进行固态通量发酵可以提高固态通量培养装置的使用效率，且发酵结果更为稳定。

[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于微生物固态通量发酵的培养基，所述培养基为片状，所述培养基包括下述重量百分比的组分：麸皮10％-82.5％，豆粕10％-80％，小麦5％-70％，玉米淀粉1％-5％，麦芽糊精粉0.5％-1.5％。

[0006] 本发明将培养基制成片状，这样当培养基用于固态通量培养时，可将这些培养基直接放入孔板不同的孔中进行后续处理，既能保证不同孔之间培养基的分装速度，也能保证培养基及重量的一致性，还能从源头杜绝培养基分装过程中杂菌污染，从而实现固态通量培养装置的更高效应用。

[0007] 本发明的培养基以玉米淀粉和麦芽糊精粉作为填充剂。研究表明，填充剂的类型以及用量影响培养基是否压片成型、是否容易破碎、崩解效果以及同批次培养基间误差的大小。发明人发现：单独以麸皮、豆粕和小麦作为原料进行培养基压片，无法成型，添加一定的填充剂才能辅助成型。若仅以玉米淀粉作为填充剂，玉米淀粉的用量过低，则培养基成型效果不佳，相同批次的培养基成片片间误差较大，且培养基易破碎；随着玉米淀粉用量的增加，培养基成型较好，但是若玉米淀粉的用量过高，则培养基的崩解效果较差。

[0008] 单独以玉米淀粉作为填充剂，难以得到满足要求的培养基。发明人以玉米淀粉和麦芽糊精粉同时作为填充剂，且选用本发明特定的用量，这样所得培养基易成型、不易破碎、崩解效果好(即向培养基中加入培养基重量40％-100％的水，静止放置2分钟能快速实现片状培养基的崩解、松散)且同批次培养基间误差小。

[0009] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述玉米淀粉在所述培养基中的重量百分比为2％，所述麦芽糊精粉在所述培养基中的重量百分比为1％。麦芽糊精粉在培养基中的含量若低于1％，同批次培养基间误差的稍高；麦芽糊精粉在培养基中的含量若高于1％，培养基在水中的崩解速度会有所降低，尤其当麦芽糊精粉在培养基中的含量达到2％时，培养基在水中的崩解速度降低较多。发明人发现，麦芽糊精粉在所述培养基中的重量百分比为1％，所得培养基不仅易成型、不易破碎，且在水中的崩解效果好，同批次培养基间的误差低于3％。

[0010] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述麸皮、豆粕和小麦的细度均为40-80目，所述玉米淀粉和麦芽糊精粉的细度均为80目以上。培养基中组分的细度影响培养基压片的质量，各组分只有在所述细度范围内才能进行有效的压片操作。

[0011] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，每片所述培养基的质量为0.4-0.9g。当每片培养基的质量为0.4-0.9g时，培养基在孔板进行微生物发酵培养的过程中才能够保证有效、稳定的通气、散热和保湿。

[0012] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述培养基为圆片状。

[0013] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述培养基的直径为6-15mm，厚度为5-10mm。

[0014] 另外，本发明提供了上述用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法，其包括以下步骤：按比例称取所述培养基中各组分，混合均匀后，进行压片处理，得到所述培养基。

[0015] 需说明的是，在压片过程中，最好保证每批次压片培养基的重量RSD偏差不超过3％，以保证培养基在用于孔板微生物培养的过程中孔间差异的稳定性，以及微生物发酵数据的稳定性和可靠性。

[0016] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法的优选实施方式，所述压片处理时，压片机的压力为15-60kn。压片机的压力是需要随着压片培养基成分的改变而进行，这样才能达到培养基压片的最适条件，保证得到的压片稳定性(RSD<3％)；因为不同原料的密度不同，在配比过程中需要根据培养基的重量需求进行直径以及培养基厚度的调整，达到最适重量要求。

[0017] 作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法的优选实施方式，称取所述培养基中的各组分前还包括以下步骤：干燥培养基中的各组分至各组分中的含水量不高于10％。这样，以保证培养基整体物料的含水量不超过10％。

[0018] 最后，本发明还提供了上述培养基在用于微生物固态通量发酵中的应用。

[0019] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：

[0020] (a)将培养基置于固态通量培养装置中，加入水，润湿处理后，将培养基混匀；

[0021] (b)灭菌并冷却后，将微生物接入培养基中，进行发酵培养。

[0022] 作为本发明所述应用的更优选实施方式，所述应用包括以下步骤：

[0023] (a)将培养基置于固态通量培养装置中，加入水，润湿处理0.5-3小时后，将培养基混匀；其中，所述水与培养基的重量比为0.3～1.5:1；

[0024] (b)于115-121℃灭菌15-60min，再冷却后，将微生物接入培养基中，于28-37℃进行发酵培养24-96小时。

[0025] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述固态通量培养装置为公开号为CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。具体地，所述固态通量培养装置包括培养板和设于所述培养板上的板盖；所述培养板包括培养板本体，所述培养板本体上设有多个培养孔，各个所述培养孔的内底部均设有与培养孔尺寸相匹配的多层纱布；各个所述培养孔的底部中间还开设有第一通孔，所述第一通孔内穿插有与第一通孔相匹配的鲁尔接头，所述鲁尔接头的接口位于所述培养板本体的外部；所述板盖上设有多个第二通孔，所述第二通孔的分布位置与所述培养孔相一致。

[0026] 作为本发明所述应用的优选实施方式，所述微生物为米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0028] (1)本发明的培养基为片状，应用于工业发酵微生物的孔板固态通量培养不仅节省培养基的孔板分装时间，进一步提高固态孔板培养的高通量筛选效率，同时采用统一压片制作的培养基，减少培养基称量过程中人为导致的培养基分装操作误差，以及减少蒸煮后培养基分装过程中染菌的风险，提高孔板固态高通量发酵培养的稳定性和平行性。

[0029] (2)本发明的培养基采用了特定的填充剂，它易成型、不易破碎、向培养基中加入培养基重量40％-100％的水，静止放置2分钟能快速实现片状培养基的崩解、松散，且同批次培养基间误差的小。进一步地，本发明培养基同批次，不同片状培养基之间的重量误差不超过3％。

附图说明

[0030] 图1为本发明用于微生物固态通量发酵的培养基的照片图。

具体实施方式

[0031] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

[0032] 下述实施例中，所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、小麦、玉米淀粉、和麦芽糊精粉，所述原料均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库，在使用前对每个物料进行烘干处理，每个物料的含水量不能超过10％；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目-80目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。

[0033] 使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，能够满足压片压力需要在15-60kn之间(包含15kn，60kn)，压片直径在6-15mm之间(包含6mm，15mm)，压片厚度在5-
10mm之间(包括5mm，10mm)，压片重量在0.4-0.9g之间(包括0.4g，0.9g)。

[0034] 压片质量是根据培养基需要满足的条件进行设置，从能否压片成型、稳定性，同批次压制成片之间的质量相对标准偏差(RSD)、以及能否快速崩解是作为评价标准。

[0035] 实施例1～5

[0036] 实施例1～5用于微生物固态通量发酵的培养基均为圆片状，培养基的组成组分及各组分在培养基中的重量百分比如表1所示。其中，麸皮、豆粕和小麦的细度均为40-80目，玉米淀粉和麦芽糊精粉的细度均为80目以上；每片培养基的质量为0.4-0.9g，培养基的直径为6-15mm，培养基的压片厚度为5-10mm。

[0037] 实施例1～5用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法为：

[0038] (1)烘干培养基中的各组分至各组分中的含水量不高于10％；同时，将麸皮、豆粕和小麦粉碎至其细度为40-80目，玉米淀粉和麦芽糊精粉粉碎至其细度为80目以上。

[0039] (2)按比例称取烘干后的培养基中各组分，混合均匀后，进行压片处理，得到所述培养基；其中，压片处理时，压片机的压力为15-60kn。

[0040] 表1

[0041]  实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
麸皮/％ 10 14 50 12 82.5
豆粕/％ 36.5 10 41.5 80 10
小麦/％ 52 70 5 5 5
玉米淀粉/％ 1 5 2 2 2
麦芽糊精粉/％ 0.5 1 1.5 1 0.5

[0042] 实施例1～5用于微生物固态通量发酵的培养基的照片图如图1所示。

[0043] 实施例6不同的原料配比对培养基成片的影响

[0044] 本实施例按照实施例1～5培养基的制备方法，采用不同配比的原料制备了培养基，并比较了原料配比对培养基成片的影响，其结果如表2所示。

[0045] 从表2的1号配方可以看出单独以麸皮、豆粕、小麦作为原料进行培养基压片，是无法成型，因此需要添加一定的填充剂进行辅助成型。但是为了不影响填充剂对固态发酵培养基成分的影响，选择玉米淀粉作为首选的填充剂。但是通过后面的2-6号培养基分析结果可以看出，添加1％的玉米淀粉可以改善培养基压片成型，但还有50％的压片培养基不能成型；添加2％的玉米淀粉可以解决培养基压片成型问题且崩解效果好，但是同批次压片之间的误差RSD超过20％；添加3％的玉米淀粉可以解决培养基压片成型问题且崩解效果好，但是同批次压片之间的误差RSD超过10％；添加4％的玉米淀粉可以解决培养基压片成型问题，但是同批次压片之间的误差RSD超过5％并且崩解效果差，不适用孔板固态发酵培养基的使用；添加5％的玉米淀粉可以解决培养基压片成型问题，同时同批次压片之间的误差RSD小于3％，但崩解效果差，不适用孔板固态发酵培养基的使用。从上述结果可以看出单独使用玉米淀粉作为填充剂是无法解决固态发酵培养基压片成片的问题，需要添加另外一种填充剂进行辅助成型。本专利选择麦芽糊精作为辅助填充剂进行压片成型，考虑到玉米淀粉的含量对固态发酵培养基的影响，在后面的优化试验中是在含有2％玉米淀粉培养基的基础上进行优化处理。通过后续的麦芽糊精添加实验可以看出，麦芽糊精添加量达到1％以上均能达到稳定性压片、压片间RSD误差小于3％的效果，但是麦芽糊精的添加量过大同样会造成压片培养基崩解效果差。综上所述能满足固态压片培养基的配方是，麸皮：豆粕：小麦：玉米淀粉：麦芽糊精粉＝10％-82.5％：10％-80％：5％-70％：2％：1％，各原料的重量百分比之和为100％。其中，所示的百分比均为各原料占培养基的重量百分比。

[0046] 表2原料配比对培养基成片的影响

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051] 实施例7本发明培养基在米曲霉中的应用

[0052] 1、多孔发酵装置

[0053] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0054] 2、实验材料与方法

[0055] 2.1、培养基成分与制作方法

[0056] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮23％；豆粕56％；小麦21％。

[0057] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮25％；豆粕55％；小麦20％。

[0058] 培养基3组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮22％；豆粕58％；小麦20％。

[0059] 培养基4组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮22％；豆粕55％；小麦23％。

[0060] 培养基5组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮22％；豆粕55％；小麦20％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0061] 培养基1～5为非压片培养基，其是按原料配比混匀得到。

[0062] 培养基6的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基5比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为25kn，压片直径为10mm，压片厚度为6mm，压片重量0.5g(RSD<3％)，压片得到的培养基如图1所示。

[0063] 2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式

[0064] 培养基6的应用方式：将压片成0.5g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入0.7ml水，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌20min。

[0065] 培养基1，2，3，4，5的应用方式：将培养基按原料配比混匀后，拌水为140％(按质量比，例如1g需要拌水1.4ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌的20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.5g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0066] 培养条件：将在豆汁培养基上培养3天的沪酿3.042菌种(海天保藏)使用无菌生理7
盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在10个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间44小时。本次试验的通气流量控制为：在11小时之前通气量为0.3m3/h，在11小时到17小时之间通气量为
0.8m3/h，在17小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0067] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0068] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵蛋白酶活检测方法是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行30倍稀释。

[0069] 2.3、实验结果分析

[0070] 6种培养基小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到曲料的形态曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表3所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为2744.32U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为2740.18U/g，培养基3的平均中性蛋白酶酶活为2743.25U/g，培养基4的平均中性蛋白酶酶活为2742.12U/g，培养基5的平均中性蛋白酶酶活为2743.96U/g，从这些中性蛋白酶的数据可以看出，即使麸皮、豆粕、小麦的原料配比出现小范围的波动，对发酵酶活的结果影响不大。压片培养基6的平均中性蛋白酶酶活为2744.58U/g，与培养基5的中性蛋白酶活几乎相同，同时培养基5的中性蛋白酶活力的RSD值为3.58％，而培养基6的RSD值为1.85％，低于培养基5、4、3、2、1，这说明通过压片方法获得培养基更能获得稳定的发酵结果。

[0071] 表3米曲霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0072]

[0073] 实施例8本发明培养基在黑曲霉中的应用

[0074] 1、多孔发酵装置

[0075] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0076] 2、实验材料与方法

[0077] 2.1、培养基成分与制作方法

[0078] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮80％；豆粕10％；小麦10％。

[0079] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮80％；豆粕10％；小麦7％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0080] 培养基2的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基2比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为35kn，压片直径为10mm，培养基厚度为6mm，压片重量0.8g(RSD<3％)。

[0081] 2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式

[0082] 压片培养基2的应用方式：将压片成0.8g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入1.2ml的水后，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min。

[0083] 非压片培养基1：将培养基按原料配比混匀后，拌水为100％(按质量比，例如1g需要拌水1ml)，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.6干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0084] 培养条件：将在PDA培养基上培养3天的黑曲霉AS3.350菌种(海天保藏)使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间40小时。本次试验的通气流量控制为：在11小时之前通气量为0.3m3/h，在11小时到17小时之间通气量为0.8m3/h，在17小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0085] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板的进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0086] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵蛋白酶活检测方法是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行10倍稀释。

[0087] 2.3、实验结果分析

[0088] 小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料形态曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表4所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为938.45U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为939.21U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.32％，而培养基2的RSD值为1.52％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。

[0089] 表4黑曲霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0090]

[0091] 实施例9本发明培养基在毛霉中的应用

[0092] 1、多孔发酵装置

[0093] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0094] 2、实验材料与方法

[0095] 2.1、培养基成分与制作方法

[0096] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮10％；豆粕80％；小麦10％。

[0097] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮10％；豆粕80％；小麦7％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0098] 培养基2的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基2比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为25kn，压片直径在10mm，培养基厚度为6mm，压片重量0.6g(RSD<3％)。

[0099] 2.2培养基的多孔发酵装置中的应用方式

[0100] 压片培养基2的应用方式：将压片成0.5g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入0.5ml的水后，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min。

[0101] 非压片培养基1：将培养基按原料配比混匀后，拌水为100％(按质量比，例如1g需要拌水1ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.6干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0102] 培养条件：将在PDA培养基上培养5天的毛霉ZG701(GDMCC NO：60183)菌种使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间60小时。本次试验的通气流量控制为：在14小时之前通气量为0.3m3/h，在14小时到24小时之间通气量为0.8m3/h，在24小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0103] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0104] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵蛋白酶活检测方法是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行10倍稀释。

[0105] 2.3、实验结果分析

[0106] 小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态及曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，如表5所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为1150.38U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为1148.95U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.86％，而培养基2的RSD值为1.81％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。

[0107] 表5毛霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0108]

[0109] 实施例10本发明培养基在根霉中的应用

[0110] 1、多孔发酵装置

[0111] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0112] 2、实验材料与方法

[0113] 2.1、培养基成分与制作方法

[0114] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮10％；豆粕20％；小麦70％。

[0115] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮7％；豆粕20％；小麦70％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0116] 培养基2的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基2比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为25kn，压片直径为10mm，培养基厚度为6mm，压片重量0.5g(RSD<3％)。

[0117] 2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式

[0118] 压片培养基2的应用方式：将压片成0.5g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入0.3ml的水后，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min。

[0119] 非压片培养基1：将培养基按原料配比混匀后，拌水为60％(按质量比，例如1g需要拌水0.6ml)，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.5干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0120] 培养条件：将在PDA培养基上培养4天的根霉ZH805(GDMCC NO：60200，海天保藏)菌7
种使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在10个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间
48小时。本次试验的通气流量控制为：在16小时之前通气量为0.3m3/h，在16小时到24小时之间通气量为0.8m3/h，在24小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0121] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0122] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵蛋白酶活检测方法是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行10倍稀释。

[0123] 2.3、实验结果分析

[0124] 小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态及曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，如表6所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为1580.33U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为1583.87U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.39％，而培养基2的RSD值为2.31％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。

[0125] 表6根霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0126]

[0127] 实施例11本发明培养基在芽孢杆菌固态发酵中的应用

[0128] 1、多孔发酵装置

[0129] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0130] 2、实验材料与方法

[0131] 2.1、培养基成分与制作方法

[0132] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮10％；豆粕20％；小麦70％。

[0133] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮7％；豆粕20％；小麦70％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0134] 培养基2的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基2比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为25kn，压片直径为10mm，培养基厚度为6mm，压片重量0.5g(RSD<3％)。

[0135] 2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式

[0136] 压片培养基2的应用方式：将压片成0.5g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入0.3ml的水后，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌20min。

[0137] 非压片培养基1：将培养基按原料配比混匀后，拌水为150％(按质量比，例如1g需要拌水1.5ml)，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.5干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0138] 培养条件：使用LB液态培养基培养枯草芽孢杆菌AS1398，30℃条件下200rpm培养24小时后，离心收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤菌体后并重悬，接种到固态曲料培养基，
8
接种量控制在10个细胞/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间36小时。本次试验的通气流量控制为：在8小时之前通气量为
0.3m3/h，在8小时到16小时之间通气量为0.8m3/h，在16小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0139] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板的进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提1小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0140] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵蛋白酶活检测方法是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。同时酶活测定都需要对获得发酵浸提酶液进行50倍稀释。

[0141] 2.3、实验结果分析

[0142] 小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，如表7所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为3843.21U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为3843.69U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为3.92％，而培养基2的RSD值为1.84％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。

[0143] 表7枯草芽孢杆菌不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0144]

[0145] 实施例12压片培养基在酵母菌菌固态发酵中的应用

[0146] 1、多孔发酵装置

[0147] 参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。

[0148] 2、实验材料与方法

[0149] 2.1、培养基成分与制作方法

[0150] 培养基1组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮40％；豆粕40％；小麦20％。

[0151] 培养基2组成是由以下原料按重量百分比组成：麸皮40％；豆粕40％；小麦17％；玉米淀粉2％；麦芽糊精粉1％。

[0152] 培养基2的制作方法：麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到60目的细度，其中玉米淀粉和麦芽糊精需要达到80目以上的细度。按照培养基2比例混匀后进行圆形压片。使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，压片压力为30kn，压片直径为10mm，培养基厚度为6mm，压片重量0.5g(RSD<3％)。

[0153] 2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式

[0154] 压片培养基2的应用方式：将压片成0.5g圆片质量的培养基分装到CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置中，每孔用排枪加入0.4ml的水后，并用排枪拌料，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌20min。

[0155] 非压片培养基1：将培养基按原料配比混匀后，拌水为80％(按质量比，例如1g需要拌水0.8ml)，拌料混匀后静止放置2小时，121℃高压灭菌20min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.5干料/孔在无菌条件下进行称重分装。

[0156] 培养条件：使用麦芽汁液态培养基培养鲁氏酵母HT.Y309，30℃条件下200rpm培养24小时后，离心收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤菌体后并重悬，接种到固态曲料培养基，接种量控制在108个细胞/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间48小时。本次试验的通气流量控制为：在14小时之前通气量为
0.3m3/h，在14小时到26小时之间通气量为0.8m3/h，在26小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。

[0157] 小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提1小时，4000rpm离心20min，收集上清。

[0158] 中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵同样是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行蛋白酶测定，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行10倍稀释。

[0159] 2.3、实验结果分析

[0160] 小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，如表8所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为369.31U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为370.56U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为2.75％，而培养基2的RSD值为1.56％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。

[0161] 表8酵母菌在不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较

[0162]

[0163] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。