香叶木素在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及香叶木素在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用。香叶木素单用或者香叶木素与别嘌呤醇两药联用，在降低高尿酸血症肾病小鼠的血清尿酸的同时，还能显著降低其血清尿素氮和肌酐水平，同时能够降低由高尿酸血症引起的小鼠肾指数的上升，脾指数也明显升高，说明两药联用在降低高尿酸血症肾病小鼠尿酸的同时能够逆转由血清尿酸升高导致的小鼠肾脏功能的损害，进而保护高尿酸血症小鼠的肾脏功能，并且对其免疫系统具有保护作用。

权利要求

1.一种药物组合物，该药物组合物的活性组分为香叶木素和别嘌呤醇；所述药物组合物的剂型为注射剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

3.权利要求1-2中任意一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用。

说明书

香叶木素在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及香叶木素在制备治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用，活性组分为单用的香叶木素或者香叶木素和别嘌呤醇的药物组合物，以及香叶木素和别嘌呤醇联合用药在制备治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，无症状高尿酸血症以及高尿酸血症肾病的发病率显著增高。人体产生的尿酸约有2/3经肾脏随尿液排出，因此，高尿酸血症可导致肾功能的减退。尿酸性肾病是指大量尿酸盐结晶短时间沉积于肾脏集合管、肾盂及输尿管并堵塞肾小管，引起肾小管近端扩张，导致肾功能急性、严重损伤，引发急性肾功能衰竭。目前治疗高尿酸血症肾病的药物主要以西药为主，主要有黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如：别嘌呤醇、非布司他等；或者促进尿酸排泄的药物，例如：丙磺舒、苯溴马隆等。但是上述药物都有严重的副作用，例如：肾毒性、过敏反应、心血管毒性、肝肾毒性等，从而导致这些药物在临床上的使用受到了严重的限制。近年来，由于中药毒副作用小，疗效确切，显示较强优势，因此中药治疗尿酸性肾病得到广泛重视。

发明内容

[0003] 本发明针对现有治疗高尿酸血症肾病的药物毒副作用大、患者不易耐受、临床使用受到限制的缺陷，旨在开发出高效、低毒的抗高尿酸血症肾病的药物，以解决目前临床上使用药物的毒性问题，提高患者的耐受性和顺应性。本发明首次提出黄酮化合物香叶木素能够治疗高尿酸血症肾病，而且香叶木素与别嘌呤醇具有协同降尿酸作用，并具有恢复肾功能的作用，注射给药途径比灌胃给药途径疗效更好。

[0004] 为了实现上述目的，本发明的第一方面提供香叶木素或其药学上可接受的盐、溶剂合物在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用。

[0005] 优选地，所述药物的剂型为注射剂。

[0006] 优选地，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

[0007] 本发明的第二方面提供一种药物组合物，该药物组合物的活性组分为香叶木素和别嘌呤醇。

[0008] 优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。

[0009] 优选地，所述药物组合物的剂型为注射剂。

[0010] 本发明中，所述“药物组合物”是指其含有两种活性组分，并不限制两种活性组分的使用方式，可以将两种活性组分混合后制备为药物，也可以将两种活性组分分别制备为药物再联合用药。

[0011] 以上药物或药物组合物中，所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂或抗氧化剂。所述药学上可接受的载体还可以包括香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。

[0012] 所述药学上可接受的载体可以选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、大豆磷脂、维生素C、维生素E、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁。

[0013] 本发明的第三方面提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗高尿酸血症肾病的药物中的应用。

[0014] 别嘌呤醇是次黄嘌呤的异构体，是XOD的自杀性底物，能够与XOD底物竞争性结合XOD的活性位点钼蝶呤从而阻止次黄嘌呤代谢为尿酸，因此成为临床应用广泛的一线抑制尿酸生成类药物。通过体外实验测定香叶木素对黄嘌呤氧化酶影响的结果可知，香叶木素在体外能够显著抑制剂黄嘌呤氧化酶的活性，且半数抑制浓度小于阳性药别嘌呤醇，即体外香叶木素抑制黄嘌呤氧化酶活性作用更强；经抑制类型实验的测定，显示香叶木素对黄嘌呤氧化酶的抑制类型是竞争性抑制。因此，香叶木素是一种高效黄嘌呤氧化酶的天然抑制剂。近年来已有文献报道香叶木素可以改善肾缺血/再灌注后的肾损伤，但未见其对尿酸作用及尿酸性肾病的研究报道。本发明研究结果表明，经过腹腔给药香叶木素后，能够显著降低高尿酸血症肾病小鼠的血清尿酸水平，并且能显著降低血清尿素氮、肌酐水平，说明香叶木素能够逆转由高尿酸导致的小鼠肾脏功能的损害，进而保护高尿酸血症小鼠的肾脏功能。并且香叶木素腹腔注射低、中剂量组能降低由于高尿酸血症引起的小鼠肾脏指数上升，对小鼠肾脏具有保护作用，同时脾指数升高，说明香叶木素对高尿酸血症小鼠的免疫系统具有保护作用。

[0015] 香叶木素与别嘌呤醇两药联用，在降低高尿酸血症肾病小鼠的血清尿酸的同时，还能显著降低其血清尿素氮和肌酐水平，同时能够降低由高尿酸血症引起的小鼠肾指数的上升，脾指数也明显升高，说明两药联用在降低高尿酸血症肾病小鼠尿酸的同时能够逆转由血清尿酸升高导致的小鼠肾脏功能的损害，进而保护高尿酸血症小鼠的肾脏功能，并且对其免疫系统具有保护作用。香叶木素给药对小鼠的肝指数、胸腺指数、体重均无明显影响，表明香叶木素是一种低毒性的化合物。

[0016] 本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

[0017] 通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

[0018] 图1示出了香叶木素的Lineweaver-Burk双倒数方程图。

具体实施方式

[0019] 下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

[0020] 本发明采用体外和体内的方法进行研究。

[0021] 1、香叶木素体外对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

[0022] 1.1材料

[0023] 1.1.1药品与试剂

[0024] 香叶木素(纯度≥97％)，批号D17081604，购自南京狄尔格医药科技有限公司；磷酸氢二钾(分析纯)，购自天津天力化学试剂有限公司；无水磷酸二氢钾(分析纯)，购自天津市光复精细化工研究所；EDTA-2Na(分析纯)，购自Biosharp公司；黄嘌呤(纯度98％，批号：D1606030)，购自阿拉丁试剂有限公司；黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)，批号：
L04M8Y30480，购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。

[0025] 1.1.2实验仪器

[0026] AL204电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；XH-C涡旋混合器(金坛市医疗仪器厂)；pHS-3C型酸度计(奥豪斯仪器有限公司)；EnSpire酶标仪(PerkinElmer公司)。

[0027] 1.2方法

[0028] 1.2.1抑制率的测定

[0029] 采用改良紫外分光光度计法测定香叶木素体外对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用(朱深银，周远大，刘庆山等。黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用[J]。中国药学杂志，2007，42(3):187-190)。香叶木素和别嘌呤醇分别采用DMSO溶解，并用磷酸缓冲液(pH＝7.4)稀释至200μmol/L，100μmol/L，50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，6.25μmol/L的浓度备用。底物黄嘌呤先用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶解，然后用稀盐酸调pH到7.4左右，最后用磷酸缓冲液(pH＝7.4)稀释至所需。黄嘌呤氧化酶用pH＝7.4的磷酸缓冲液配制成所需浓度的溶液备用。

[0030] 将样品及空白溶液(空白为PBS)100μL，酶溶液(4U/mL)50μL，依次加入96孔板中，每个浓度4复孔，在酶标仪37℃孵化3min，加入底物黄嘌呤(0.12μmol/L)50μL启动酶促反应，香叶木素和别嘌呤醇的终浓度均为100μmol/L，50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，6.25μmol/L，3.625μmol/L。在吸光波长295nm处，每隔20s读数一次，记录吸光度A，共10min。以吸光度与时间进行线性回归，得出回归曲线的斜率即为黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤生成尿酸的反应速率。药物对XOD的抑制率用下列公式计算：抑制率(％)＝[1-(b/a)]×100％，a为空白对照组的反应速率，b为药物组的反应速率。以抑制率和浓度做回归曲线，最后用软件GraphPad Prism 6计算出IC50。

[0031] 1.2.2抑制率类型的测定

[0032] 固定酶的浓度(1U/mL)，底物设置5个浓度梯度：1.92μmol/L、0.96μmol/L、0.48μmol/L、0.24μmol/L、0.12μmol/L。方法同1.2.1，分别测定不同浓度香叶木素(50μmol/L、3.625μmol/L)在不同底物浓度下的反应速率。以底物浓度和反应速率进行Lineweaver-Burk双倒数方程作图，判断香叶木素的抑制类型。

[0033] 1.3结果

[0034] 1.3.1香叶木素对XOD的抑制作用

[0035] 由表1可知，随着香叶木素和别嘌呤醇浓度的增大，其抑制率均逐渐增大，XOD活性逐渐降低。香叶木素和别嘌呤醇的IC50分别为5.83μmol/L、49.60μmol/L，表明香叶木素对XOD的抑制作用明显强于别嘌呤醇。

[0036] 表1香叶木素对XOD的抑制作用

[0037]

[0038] 3.2香叶木素对XOD抑制类型分析

[0039] 如图1所示，根据Lineweaver-Burk双倒数方程1/V＝Km/(Vmax*[S])+1/Vmax作图，不同浓度的香叶木素和空白组的Lineweaver-Burk双倒数曲线几乎相交在Y轴同一点，表明Vmax不变，即香叶木素的存在没有引起黄嘌呤氧化酶最大反应速率Vmax的改变；随着香叶木素浓度的增加，曲线斜率增大，表明米氏常数Km增大，显示香叶木素对黄嘌呤氧化酶的抑制类型为竞争性抑制。

[0040] 2、香叶木素对高尿酸性肾损害小鼠的保护作用

[0041] 2.1实验材料

[0042] 2.1.1实验动物

[0043] SPF级昆明小鼠，雄性，体重20～22g，华中科技大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK(鄂)2016-0009。

[0044] 2.1.2药品与试剂

[0045] 别嘌呤醇(批号Y27O8C46913)，购于上海源叶生物科技有限公司；香叶木素(纯度≥97％，批号D17081604)，购自南京狄尔格医药科技有限公司；氧嗪酸钾盐(批号P137112)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母膏(批号20170802)，购于北京奥博星生物技术责任公司；尿酸测定试剂盒(批号20181017)、黄嘌呤氧化酶测试盒(批号20180920)、尿素氮试剂盒(批号20181024)、肌酐试剂盒(批号20181022)、考马斯亮蓝试剂盒(批号20180921)均购自南京建成生物工程研究所；DMSO(批号20161109)，购于国药集团化学试剂有限公司。

[0046] 2.1.3实验仪器

[0047] AL204电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；SPS2001F电子天平(奥豪斯公司)；TGL-16C台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；UV-2000紫外分光光度计(尤尼柯)；FSH-2A可调高速匀浆机(金坛市医疗仪器厂)。

[0048] 2.2方法

[0049] 2.2.1动物分组与给药

[0050] 雄性昆明小鼠80只，适应性喂养2d后，按体重随机分为8组，每组10只。分为正常组，模型组，别嘌呤醇组(5mg/kg)，香叶木素腹腔注射低剂量组、中剂量组、高剂量组(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)、香叶木素灌胃组(20mg/kg)、香叶木素(20mg/kg)+别嘌呤醇(5mg/kg)组。第1d开始上午定时腹腔注射给药，正常组和模型组注射生理盐水，香叶木素低、高剂量组腹腔注射相应药物，香叶木素中剂量分为腹腔注射组和灌胃给药组，分别给予相应剂量药物，连续15d，别嘌呤醇组前6d灌胃0.5％CMC-Na，最后9d灌胃相应剂量别嘌呤醇。腹腔注射给药容积为0.15ml/10g，灌胃给药容积为0.2ml/10g。

[0051] 2.2.2高尿酸血症肾损害动物模型的建立

[0052] 采用酵母膏灌胃联合氧嗪酸钾腹腔注射建立小鼠高尿酸血症肾损害模型。除正常组外，其余各组小鼠每天灌胃30g/kg酵母膏，连续15d，最后1d腹腔注射300mg/kg氧嗪酸钾，除别嘌呤醇组外，其余各组灌胃体积为0.2ml/10g，腹腔注射体积为0.15ml/10g，别嘌呤醇组灌胃体积为0.1ml/10g。腹腔注射香叶木素后1h，除正常组外，其余各组灌胃酵母溶液，最后1d酵母膏灌胃后腹腔注射氧嗪酸钾溶液。

[0053] 2.2.3药物溶液的配制

[0054] 将香叶木素溶解于DMSO中，用生理盐水稀释配置成0.67mg/mL、1.33mg/mL、2.67mg/mL香叶木素混悬液(含5％DMSO)。

[0055] 用0.5％CMC-Na做溶媒，分别配制0.5mg/mL别嘌呤醇混悬液、3g/mL酵母膏混悬液、1.5g/mL酵母混悬液、20mg/mL氧嗪酸钾混悬液。

[0056] 2.2.4生化指标测定

[0057] 每天观察小鼠的一般情况并称重，计算每只小鼠的体重相对变化率(％)＝(每次称量体重/实验开始时体重)×100。给药第15d，下午造模后1h，正常组、模型组、别嘌呤醇组、香叶木素各剂量组小鼠眼球取血，3500r/min离心10min，取上清液，冻存于-20℃，用于测定血清尿酸、BUN、Cr水平，颈椎脱臼处死小鼠，称量全肾、肝脏、胸腺、脾脏重量，计算脏器指数。

[0058] 2.3结果

[0059] 2.3.1香叶木素对高尿酸血症小鼠肾功能的影响

[0060] 实验结果见表2。由表2可知，与正常组比较，模型组小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平均极显著升高(P<0.01)，说明用酵母膏联合氧嗪酸钾能够造成小鼠高尿酸血症，并对肾脏有损害；与模型组比较，阳性药组小鼠血清尿酸水平极显著降低(P<0.01)，说明别嘌呤醇能够降低小鼠血清尿酸，但小鼠血清尿素氮和肌酐水平无统计学意义(P>0.05)，说明别嘌呤醇对肾脏无保护作用；腹腔注射香叶木素低剂量能够极显著降低小鼠血清尿酸(P<0.01)，腹腔注射香叶木素中剂量和高剂量能够明显降低小鼠血清尿酸水平(P<0.05)，同时腹腔注射香叶木素低、中、高剂量小鼠血清尿素氮、肌酐水平均极显著降低(P<0.01)，说明通过腹腔注射香叶木素，能够在降低高尿酸血症小鼠尿酸的同时，对其肾脏也有一定保护作用；灌胃给予香叶木素能够极显著降低小鼠血清尿酸(P<0.01)，但小鼠血清尿素氮、肌酐水平均无统计学意义(P>0.05)，说明通过灌胃给药能够降低高尿酸血症小鼠血清尿酸但对肾脏无保护作用；香叶木素与别嘌呤醇两药联用，其血清尿酸、尿素氮水平均极显著降低(P<0.01)，血清肌酐水平明显降低(P<0.05)，说明两药联用能够在降低小鼠尿酸的同时对其肾脏也有一定的保护作用。

[0061] 表2香叶木素对高尿酸血症小鼠血清尿酸、尿素氮、肌酐水平的影响(n＝10)[0062]

[0063] 与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。ig：灌胃；ip：腹腔注射。

[0064] 2.3.2香叶木素对高尿酸血症肾损害小鼠脏器指数的影响

[0065] 实验结果见表3。由表3可知，与正常组比较，模型组的肾指数明显增大(P<0.05)，说明高尿酸血症小鼠肾脏增大，此造模方式对肾脏有一定损伤。与模型组相比，阳性药组小鼠肾指数无统计学差异(P>0.05)，说明别嘌呤醇对高尿酸血症小鼠肾损伤无保护作用；香叶木素低剂量组小鼠肾指数明显降低(P<0.05)，香叶木素中剂量组小鼠肾指数极显著降低(P<0.01)，说明香叶木素对高尿酸血症小鼠肾损害有一定保护作用。香叶木素与别嘌呤醇两药联用，小鼠肾指数极显著降低(P<0.01)，说明两药联用能够对高尿酸血症小鼠肾脏起保护作用。与正常组比较，香叶木素低剂量、中剂量以及香叶木素与别嘌呤醇两药联用的肾指数无统计学差异(P>0.05)，说明香叶木素低剂量、中剂量以及两药联用能使尿酸诱导的小鼠肾指数升高恢复至正常小鼠水平。与正常组比较，模型组的脾指数明显降低(P<0.05)，说明此造模方式对小鼠免疫系统有损伤。与模型组比较，香叶木素低剂量和高剂量的脾指数极显著升高(P<0.01)，中剂量明显升高(P<0.05)，说明香叶木素对高尿酸血症小鼠免疫系统起保护作用；香叶木素与别嘌呤醇两药联用，小鼠脾指数极显著升高(P<0.01)，说明两药联用对高尿酸血症小鼠免疫系统起保护作用；与正常组比较，香叶木素低、中、高剂量组以及香叶木素与别嘌呤醇两药联用组脾指数均无统计学差异(P>0.05)，说明香叶木素能够使高尿酸血症肾损害小鼠的脾指数恢复至正常小鼠水平。香叶木素灌胃其肾指数、脾指数与模型组相比均无统计学差异(P>0.05)，说明灌胃给药对高尿酸血症小鼠肾损害无保护作用，同时对其免疫系统也无作用。

[0066] 表3香叶木素对小鼠脏器指数的影响(n＝10)

[0067]

[0068]

[0069] 与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。ig：灌胃；ip：腹腔注射。

[0070] 2.3.3香叶木素对高尿酸血症肾损害小鼠XOD活性的影响

[0071] 实验结果见表4。由表4可知，与正常组比较，模型组XOD活性明显升高(P<0.05)，说明高尿酸血症小鼠能够升高XOD的活性。与模型组比较，阳性药组、腹腔注射香叶木素低、中、高剂量组、灌胃香叶木素组、香叶木素与别嘌呤醇联用组，其XOD活性均有降低趋势，但无统计学差异(P>0.05)。

[0072] 表4香叶木素对小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响(n＝10)

[0073]

[0074]

[0075] 与正常组比较，#P<0.05。ig：灌胃；ip：腹腔注射。

[0076] 2.3.4香叶木素对高尿酸血症肾损害小鼠体重的影响

[0077] 由表5可知，与正常组小鼠比较，模型组小鼠相对体重呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。香叶木素低、中、高剂量组、香叶木素灌胃组、香叶木素+别嘌呤醇联用组小鼠相对体重与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

[0078] 表5香叶木素对高尿酸血症小鼠体重的影响(n＝10)

[0079]

[0080] ig：灌胃；ip：腹腔注射。

[0081] 以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。