一种纤维素酶的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种纤维素酶的制备方法及其应用，所述制备方法是先将里氏木霉Rut‑C30静置发酵24~72h，再接入草酸青霉16继续发酵3~10d，制备得到纤维素酶；所述纤维素酶的培养底料制备方法是通过将农业废弃物和营养液按质量比为1:1~5充分混匀，再控制温度为100~145℃灭菌0.5~2h得到；所述农业废弃物为稻草和麸皮，所述营养液包括KH2PO4、(NH4)2SO4、尿素、MgSO4、CaCl2和孟德尔盐溶液。本发明利用响应曲面法确定在试验范围内的任何试验点的预测值，根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数，从而寻求最佳工艺参数。本发明提供的纤维素酶的制备方法及其应用，为真核微生物高水平生产木质纤维素酶用于乙醇发酵提供了快捷适用的技术，为进一步研究农业废弃物的乙醇生产提供了科学依据。

权利要求

1.一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：先将里氏木霉Rut-C30接入底料中静置发酵

24～72h，再接入草酸青霉16继续发酵3～10d，制备得到纤维素酶；所述纤维素酶的培养底料的制备方法为：先将农业废弃物和营养液按质量比为1:1～5充分混匀，再控制温度为100～145℃灭菌0.5～2h；所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的湿度控制在55％～

85％之间；所述农业废弃物为稻草和麸皮，所述稻草和麸皮的重量比为2:3～5。

2.根据权利要求1所述的一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述营养液包括KH2PO4、(NH4)2SO4、尿素、MgSO4、CaCl2和孟德尔盐溶液。

3.根据权利要求2所述的一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述KH2PO4的浓度为

0.6％，所述(NH4)2SO4的浓度为0.6％，所述尿素的浓度为0.1％，所述MgSO4的浓度为0.1％，所述CaCl2的浓度为0.1％，所述孟德尔盐溶液的浓度为2‰(v/v)。

4.根据权利要求2所述的一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述营养液中还包括微晶纤维素和花生饼粉，所述微晶纤维素、所述花生饼粉和所述农业废弃物的重量比为0.6～1.0:0.2～0.4:5～7。

5.根据权利要求1～4中任意一项权利要求所述的一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的温度控制在25℃～35℃之间。

6.根据权利要求1～4中任意一项权利要求所述的一种纤维素酶的制备方法，其特征在于：所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的pH控制在4.5～6之间。

7.一种纤维素酶的应用，其特征在于：按照权利要求1～6中任一项的方法制备得到的纤维素酶可用于降解农业废弃物生产单糖，或用于酒精微生物发酵工业生产乙醇。

说明书

一种纤维素酶的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水解酶和乙醇生产技术领域，尤其涉及一种纤维素酶的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 传统化石能源不但在储量上面临枯竭的问题，而且由于化石燃料所造成的环境污染也日益严重，大量温室气体排放,使气候变暖,给环境带来破坏。据国际能源专家预言，适合于经济开采的石油和天然气资源只能再开采30～50年，煤炭储量也仅够开采300年。因此，寻找新的清洁的可再生替代能源已迫在眉睫。生物质是一种很好的可再生能源。例如，美国卡内基-梅隆大学化学工程专家成功设计出一种新工艺，可以大幅提高以玉米为原料生产乙醇的效率。这一成果有助于推广使用新型燃料乙醇汽油。然而以玉米等粮食用来生产第一代乙醇存在很大的局限性。

[0003] 研究发现，用废弃物，例如农业废弃物、工业废弃物等木质纤维素进行糖化后再进行乙醇发酵是最理想的可再生新型能源来源。但是，利用这种生物质进行乙醇转化还有待继续探索，因为它具有生物顽固性。因此，直接单独采用某种微生物进行酶水解的效率不高，大多数废弃物进行糖化之前需先被预处理或者提高酶使用量，或者提高酶活等。

[0004] 因此，亟需研究开发一种利用农业废弃物制备纤维素酶的方法。

[0005] 本发明所用到的草酸青霉16(CCTCC AF 2015017)已公开并发表(Zhao XH,Wang W,Tong B,et al.A newly isolated Penicillium oxalicum 16cellulase with high efficient synergism and high tolerance of monosaccharide[J].Applied biochemistry and biotechnology,2016,178(1):173-183)。

发明内容

[0006] 为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种纤维素酶的制备方法，先将里氏木霉Rut-C30静置发酵24～72h，再接入草酸青霉16继续发酵3～10d，制备得到纤维素酶。

[0007] 其中，所述纤维素酶的培养底料的制备方法为：先将农业废弃物和营养液按质量比为1:1～5充分混匀，再控制温度为100～145℃灭菌0.5～2h。

[0008] 优选地，农业废弃物和营养液按质量比为1:3充分混匀，再控制温度为121℃灭菌1h。

[0009] 其中，所述农业废弃物为稻草和麸皮，所述稻草和麸皮的重量比为2:3～5。

[0010] 优选地，所述稻草和麸皮的重量比为2:4。

[0011] 其中，所述营养液包括KH2PO4、(NH4)2SO4、尿素、MgSO4、CaCl2和孟德尔盐溶液。

[0012] 其中，所述KH2PO4的浓度为0.6％，所述(NH4)2SO4的浓度为0.6％，所述尿素的浓度为0.1％，所述MgSO4的浓度为0.1％，所述CaCl2的浓度为0.1％，所述孟德尔盐溶液的浓度为2‰(v/v)。

[0013] 其中，所述营养液中还包括微晶纤维素和花生饼粉，所述微晶纤维素、所述花生饼粉和所述农业废弃物的重量比为0.6～1.0:0.2～0.4:5～7。

[0014] 优选地，所述微晶纤维素、所述花生饼粉和所述农业废弃物的重量比为0.84:0.3:6。

[0015] 其中，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的湿度控制在55％～85％之间。

[0016] 优选地，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的湿度控制在70％。

[0017] 其中，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的温度控制在25℃～35℃之间。

[0018] 优选地，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的温度控制在30℃。

[0019] 其中，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的pH控制在4.5～6之间。

[0020] 优选地，所述里氏木霉Rut-C30和所述草酸青霉16发酵的pH控制在5。

[0021] 本发明第二方面提供了一种纤维素酶的应用，所述纤维素酶通过本发明第一方面提供的制备方法制备得到，可用于降解农业废弃物生产单糖，或用于酒精微生物发酵工业生产乙醇。

[0022] 采用纤维素酶水解未预处理的麸皮，通过非等温半同时糖化和发酵方法生产工业乙醇，具体为：加入20FPU酶量，酶使用量为20FPU，未预处理麸皮为100g/L，糖化时间为48h并且糖化温度为45℃，然后再接入酿酒酵母UV-20发酵生产工业乙醇，发酵时间为48h并且发酵温度35℃。

[0023] 未预处理麸皮的糖化率和乙醇转化率最高可达98.41％，乙醇浓度达26.8g/L。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 本发明提供的一种纤维素酶的制备方法及其应用，由于草酸青霉和里氏木霉是常见的能分泌纤维素酶和半纤维素酶的丝状真菌，里氏木霉Rut-C30能高水平生产纤维素外切酶和纤维素内切酶，但是β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、半纤维素酶等水解酶分泌不足。而草酸青霉16能够大量表达β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、半纤维素酶(主要是木聚糖酶)等水解酶，而纤维素内切酶和外切酶分泌相对较少。本发明提供的制备方法规避它们各自的缺点，采取固体共发酵的方式混合培养以上两种真菌，以生产各酶产量比例都很好的木质纤维素酶。

[0026] 另外，由于真菌发酵产酶的过程中常常会受到诸多因素的影响，本发明利用响应曲面法(Response Surface Methodology，简称RSM)在产酶过程中的栽培条件，确定在试验范围内的任何试验点的预测值，根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数，从而寻求最佳工艺参数。

[0027] 本发明提供的纤维素酶的制备方法及其应用，为真核微生物高水平生产木质纤维素酶用于乙醇发酵提供了快捷适用的技术，为进一步研究农业废弃物的乙醇生产提供了科学依据。

附图说明

[0028] 为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施方式中需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对应本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0029] 图1是本发明实施例提供的纤维素酶的制备方法及其应用的工艺流程图。

具体实施方式

[0030] 以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

[0031] 实施例1

[0032] 称取5g麸皮和稻草以3：2的比例混合作为未优化之前的底料，按照1：3的比例加入营养液，充分混匀后，121℃灭菌1h。所述的营养液包括0.6％浓度的KH2PO4，0.6％浓度的(NH4)2SO4，0.1％浓度的尿素，0.1％浓度的MgSO4，0.1％浓度的CaCl2，2‰(v/v)孟德尔盐溶液，额外补充0.84g微晶纤维素和0.4g花生饼粉。

[0033] 首先，接入终浓度为2×107个孢子/mL的里氏木霉RUT-C30，静置发酵24h后，再接入草酸青霉16，继续发酵7d，控制湿度为60％，温度为25℃，pH值为4.5。

[0034] 将发酵了7天的霉曲以1：3的比例，用pH5.0的柠檬酸缓冲液洗脱三次，得到的木质纤维素酶液用于水解未预处理的麸皮生产工业乙醇。

[0035] 实施例2

[0036] 称取5g麸皮和稻草以3：2的比例混合作为未优化之前的底料，按照1：3的比例加入营养液，充分混匀后，121℃灭菌1h。所述的营养液包括0.6％浓度的KH2PO4，0.6％浓度的(NH4)2SO4，0.1％浓度的尿素，0.1％浓度的MgSO4，0.1％浓度的CaCl2，2‰(v/v)孟德尔盐溶液，额外补充0.84g微晶纤维素和0.4g花生饼粉。

[0037] 首先，接入终浓度为2×107个孢子/mL的里氏木霉RUT-C30，静置发酵48h后，再接入草酸青霉16，继续发酵7d，控制湿度为70％，温度为25℃，pH值为5。

[0038] 将发酵了7天的霉曲以1：3的比例，用pH5.0的柠檬酸缓冲液洗脱三次，得到的木质纤维素酶液用于水解未预处理的麸皮生产工业乙醇。

[0039] 实施例3

[0040] 称取5g麸皮和稻草以3：2的比例混合作为未优化之前的底料，按照1：3的比例加入营养液，充分混匀后，121℃灭菌1h。所述的营养液包括0.6％浓度的KH2PO4，0.6％浓度的(NH4)2SO4，0.1％浓度的尿素，0.1％浓度的MgSO4，0.1％浓度的CaCl2，2‰(v/v)孟德尔盐溶液，额外补充0.84g微晶纤维素和0.4g花生饼粉。

[0041] 首先，接入终浓度为2×107个孢子/mL的里氏木霉RUT-C30，静置发酵72h后，再接入草酸青霉16，继续发酵7d，控制湿度为80％，温度为30℃，pH值为5。

[0042] 将发酵了7天的霉曲以1：3的比例，用pH5.0的柠檬酸缓冲液洗脱三次，得到的木质纤维素酶液用于水解未预处理的麸皮生产工业乙醇。

[0043] 实施例4

[0044] 称取5g麸皮和稻草以4：2的比例混合作为未优化之前的底料，按照1：3的比例加入营养液，充分混匀后，121℃灭菌1h。所述的营养液包括0.6％浓度的KH2PO4，0.6％浓度的(NH4)2SO4，0.1％浓度的尿素，0.1％浓度的MgSO4，0.1％浓度的CaCl2，2‰(v/v)孟德尔盐溶液，额外补充0.84g微晶纤维素和0.3g花生饼粉。

[0045] 首先，接入终浓度为2×107个孢子/mL的里氏木霉RUT-C30，静置发酵72h后，再接入草酸青霉16，继续发酵7d，控制湿度为65％，温度为30℃，pH值为5.5。

[0046] 将发酵了7天的霉曲以1：3的比例，用pH5.0的柠檬酸缓冲液洗脱三次，得到的木质纤维素酶液用于水解未预处理的麸皮生产工业乙醇。

[0047] 实施例5

[0048] 称取5g麸皮和稻草以5：2的比例混合作为未优化之前的底料，按照1：3的比例加入营养液，充分混匀后，121℃灭菌1h。所述的营养液包括0.6％浓度的KH2PO4，0.6％浓度的(NH4)2SO4，0.1％浓度的尿素，0.1％浓度的MgSO4，0.1％浓度的CaCl2，2‰(v/v)孟德尔盐溶液，额外补充0.84g微晶纤维素和0.3g花生饼粉。

[0049] 首先，接入终浓度为2×107个孢子/mL的里氏木霉RUT-C30，静置发酵72h后，再接入草酸青霉16，继续发酵7d，控制湿度为75％，温度为33℃，pH值为5。

[0050] 将发酵了7天的霉曲以1：3的比例，用pH5.0的柠檬酸缓冲液洗脱三次，得到的木质纤维素酶液用于水解未预处理的麸皮生产工业乙醇。

[0051] 利用相应曲面法(Plackett-Burman设计和Central Composite设计)优化工艺条件，基于以上响应面方法得出这两种丝状真菌发酵木质纤维素酶的最佳条件为：花生饼粉0.3g，起始含水量70％，温度30℃，pH 5，稻草2g，麸皮4g。

[0052] 最高水平的滤纸酶产量为38.0IU/gds，相比于未优化之前的产量提升了4.2倍。

[0053] 再将最佳培养条件下固态共发酵的木质纤维素酶用于水解未预处理的麸皮，通过非等温半同时糖化和发酵方法生产工业乙醇，具体为：加入20FPU酶量，酶使用量为20FPU，未预处理麸皮为100g/L，糖化时间为48h并且糖化温度为45℃，然后再接入酿酒酵母UV-20发酵生产工业乙醇，发酵时间为48h并且发酵温度35℃。

[0054] 未预处理麸皮的糖化率和乙醇转化率最高可达98.41％，乙醇浓度达26.8g/L。

[0055] 以上实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。