一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌

摘要

本发明公开了一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。本发明提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。本发明提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。本发明对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

权利要求

1.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；

所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌；所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌为大肠杆菌。

5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述出发载体为pBAD/HisB载体。

7.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

8.一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

9.权利要求8所述重组菌在制备葡萄糖醛酸中的应用。

10.功能蛋白在制备葡萄糖醛酸中的应用；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

说明书

一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。

背景技术

[0002] 葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)是葡萄糖C-6位的羟基被氧化成羧基所形成的糖醛酸，其分子式为C6H10O7，分子量为194.14。葡萄糖醛酸是白色针状结晶或粉末，熔点155℃-157℃，其结构示意图见图1。葡萄糖醛酸广泛存在于植物、动物中，很少以游离形式存在于自然界。葡萄糖醛酸不仅是传统的肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，而且是合成许多医药的重要中间体，常用作功能性饮料、减肥药、化妆品等的添加剂。

[0003] 肌醇(myo-inositol)，又称环己六醇(cyclohexanhexol)，分子式为C6H12O6，分子量为180，其结构示意图见图2。几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。目前肌醇的生产方法有水解法，微生物法、化学合成法以及离子交换法。水解法是生产肌醇最主要的方法，主要以米糠、玉米糠等为原材料提取得到。

[0004] 目前，葡萄糖醛酸的生产主要主要有以下几种方法：

[0005] ①生物发酵法：利用相关的生物菌株进行发酵，从而合成葡萄糖醛酸。人类羊膜中存在UDP-葡萄糖脱氢酶，可以催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，UDP-葡萄糖醛酸在相关酶的作用下进一步合成葡萄糖醛酸。

[0006] ②多糖水解法：通过水解含糖醛酸的多糖，从而得到葡萄糖醛酸。主要包括水解太阳花膜的半纤维素，碱法水解棉花和纤维素，热水萃取半纤维素等方法。

[0007] ③化学氧化法：目前生产葡萄糖醛酸的主要方法，主要包括无机氧化法和催化氧化法两种。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。

[0008] 综上所述，本领域迫切需要开发一种新的高效生产葡萄糖醛酸的方法。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。

[0010] 本发明提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。

[0011] 所述工程菌为胞内表达功能蛋白的重组菌。

[0012] 所述出发菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BW25113。

[0013] 所述功能基因具体通过重组质粒导入出发菌。所述重组质粒可为将所述功能基因插入出发载体得到的重组质粒。所述出发载体可为载体pBAD/HisB。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。

[0014] 所述方法甲中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

[0015] 所述方法甲中，反应温度为37℃、反应pH为8.5。

[0016] 所述方法甲中，反应时间可为8-12小时。

[0017] 所述方法甲中，反应时间可为10小时。

[0018] 所述方法甲中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌。所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。

[0019] 所述方法甲包括如下步骤：培养所述工程菌并在培养过程中进行L-阿拉伯糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体和肌醇，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇
18g/L。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。

[0020] 所述方法甲具体包括如下步骤：在含50μg/mL链霉素的液体LB培养基中培养所述工程菌至OD600nm＝0.6-0.8，然后加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、肌醇和TritonX-100，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇18g/L、TritonX-100 0.1％(体积百分含量)。
菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。

[0021] 本发明提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。

[0022] 所述方法乙中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。

[0023] 所述方法乙中，反应温度为37℃、反应pH为8.0。

[0024] 所述方法乙中，反应时间可为20-40min。

[0025] 所述方法乙中，反应时间可为30min。

[0026] 所述方法乙包括如下步骤：在缓冲体系中加入功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物，进行反应，得到葡萄糖醛酸。功能蛋白和肌醇的配比为：1×105μg功能蛋白：20mmol肌醇。功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物的配比为：1×105μg功能蛋白：
2mmolL-半胱氨酸：20mmol肌醇：1mmol二价铁化合物。反应体系中，各组分的初始浓度如下：
功能蛋白100μg/mL，L-半胱氨酸2mmol/L，肌醇20mmol/L，Fe2+1mmol/L。所述二价铁化合物具体为硫酸亚铁。所述缓冲体系为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。

[0027] 本发明还保护一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。

[0028] 本发明还保护所述重组菌在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。

[0029] 本发明还保护功能蛋白在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。

[0030] 以上任一所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

[0031] (a1)序列表的序列3所示的蛋白质；

[0032] (a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0033] (a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

[0034] 以上任一所述功能基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

[0035] (b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

[0036] (b2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；

[0037] (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子；

[0038] (b4)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子。

[0039] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

[0040] 本发明提供了功能蛋白的新用途，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。相应的，本发明提供了表达所述功能蛋白的重组菌，该重组菌可以以全细胞的方式，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。本发明对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

附图说明

[0041] 图1为葡萄糖醛酸的结构示意图。

[0042] 图2为肌醇的结构示意图。

[0043] 图3为肌醇标准品和葡萄糖醛酸标准品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

[0044] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的硼酸盐缓冲液均为50mM的硼酸盐缓冲液。对于同一条件参数下的色谱图来说，待测样本中与标准品保留时间相同(±0.1min)，的峰可认定为目标峰。

[0045] 大肠杆菌BW25113：购自NBRP E.coli strain，产品目录号：ME9062(https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/resource/strainGeneMutant/list)。载体pBAD/HisB：Invitrogen公司，产品目录号V430-01。肌醇标准品：Aladdin公司，产品目录号I108336。葡萄糖醛酸标准品：Aladdin公司，产品目录号G105701。

[0046] 实施例1、重组菌的构建

[0047] 1、将DNA分子甲(DNA分子甲为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列2所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子甲。DNA分子甲与载体上的部分核苷酸形成融合基因甲，表达融合蛋白甲。

[0048] 2、将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子乙。DNA分子乙与载体上的部分核苷酸形成融合基因乙，表达融合蛋白乙。融合基因乙如序列表的序列8所示，融合蛋白乙如序列表的序列7所示。

[0049] 3、将DNA分子丙(DNA分子丙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列6所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒丙。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：在载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入了DNA分子丙。DNA分子丙与载体上的部分核苷酸形成融合基因丙，表达融合蛋白丙。

[0050] 4、将步骤1得到的重组质粒甲导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅰ。

[0051] 5、将步骤2得到的重组质粒乙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅱ。

[0052] 6、将步骤3得到的重组质粒丙导入大肠杆菌BW25113，得到重组菌Ⅲ。

[0053] 实施例2、蛋白的制备

[0054] 试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ或重组菌Ⅲ。

[0055] 1、取试验菌株的单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6～0.8。

[0056] 2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时。

[0057] 3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

[0058] 4、取步骤3得到的菌体沉淀，用缓冲液A重悬并进行超声破碎，然后10000rpm离心30min，收集上清液。

[0059] 缓冲液A(pH8.0)：含50mmol/L Tris-HCl和100mmol/LNaCl，余量为水。

[0060] 5、取步骤4得到的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液，进行Ni-NTA柱纯化。

[0061] 柱子参数：HisTrap HP柱子(1×5ml)为GE Healthcare公司的产品目录号为17-5248-01的产品。

[0062] 纯化程序：①用50ml缓冲液A充分平衡柱子；②上样30ml滤液；③用50ml含50mmol/L咪唑的缓冲液A洗涤；④用15ml含300mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱并收集过柱后溶液。

[0063] 6、取步骤5得到的过柱后溶液，进行脱盐并将缓冲体系置换为缓冲液B，得到蛋白溶液。

[0064] 缓冲液B(pH8.0)：含50mmol/L Tris-HCl，余量为水。

[0065] 重组菌Ⅰ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅰ(含有融合蛋白甲)。

[0066] 重组菌Ⅱ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅱ(含有融合蛋白乙)。

[0067] 重组菌Ⅲ进行上述步骤得到的蛋白溶液，命名为蛋白溶液Ⅲ(含有融合蛋白丙)。

[0068] 实施例3、蛋白的酶活测定

[0069] 待测蛋白溶液为实施例2制备的蛋白溶液Ⅰ、蛋白溶液Ⅱ或蛋白溶液Ⅲ。

[0070] 1、检测待测蛋白溶液的蛋白浓度。

[0071] 2、检测待测蛋白溶液的酶活

[0072] 反应体系由待测蛋白溶液、L-半胱氨酸、肌醇、硫酸亚铁(提供Fe2+)和缓冲液组成。缓冲液为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。反应体系中，蛋白浓度为100μg/mL(蛋白的唯一来
2+
源为待测蛋白溶液)，L-半胱氨酸的浓度为2mmol/L，Fe 的浓度为1mmol/L，肌醇的浓度为
20mmol/L。

[0073] 反应条件：37℃静置反应30min。

[0074] 反应结束后，取样，用蒸馏水稀释至10倍体积，然后通过HPLC检测葡萄糖醛酸的含量。

[0075] HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)；

[0076] 流动相：硫酸水溶液(5mmol/L)。

[0077] 流速：0.5mL/min；

[0078] 温度：30℃；

[0079] 检测器：RID。

[0080] 将肌醇标准品和葡萄糖醛酸标准品进行上述HPLC检测，图谱见图3。葡萄糖醛酸的保留时间为9.193min，肌醇的保留时间为10.163min。葡萄糖醛酸的标准曲线为：y＝20192x+817.7，R2＝0.998(其中x为峰面积，y为葡萄糖醛酸的含量，单位为mmol/L)。

[0081] 酶活定义：1个酶活单位(U)定义为每小时反应生成1μmol产物葡萄糖醛酸所需的酶量。

[0082] 3、根据蛋白浓度与酶活计算待测蛋白的比活力，结果见表1。

[0083] 表1

[0084]   反应结束后，反应体系中的葡萄糖醛酸浓度(mmol/L) 比活力(U/mg)融合蛋白甲 4.34±0.38 1.45±0.13融合蛋白乙 10.88±1.15 4.42±0.40
融合蛋白丙 2.20±0.30 0.74±0.10

[0085] 实施例4、应用重组菌制备葡萄糖醛酸

[0086] 试验菌株分别为：实施例1制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ或重组菌Ⅲ。

[0087] 1、取试验菌株的单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6～0.8。

[0088] 2、完成步骤1后，在培养体系中加入L-阿拉伯糖并使其浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时。

[0089] 3、完成步骤2后，取整个培养体系，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

[0090] 4、制备葡萄糖醛酸

[0091] 反应体系的组成：步骤3得到的菌体沉淀、肌醇、TritonX-100和硼酸盐缓冲液。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体浓度10g(湿重)/L、肌醇18g/L、TritonX-1000.1％(体积百分含量)。

[0092] 反应条件：37℃静置反应10小时。

[0093] 反应过程中采用5M NaOH水溶液控制反应体系的pH为8.5。

[0094] 反应结束后，取样，用蒸馏水稀释10倍，然后通过HPLC检测葡萄糖醛酸的含量。

[0095] HPLC检测方法见实施例3的步骤2。

[0096] 结果见表2。

[0097] 表2

[0098]  反应结束后，反应体系中的葡萄糖醛酸浓度 转化率
重组菌Ⅰ 9.7g/L 49.9％
重组菌Ⅱ 17.7g/L 91.1％
重组菌Ⅲ 11.8g/L 60.7％