产麦角硫因的菌株及其筛选方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株猴头菌(Hericium erinaceus)HT‑3，保藏编号为CCTCC No：M 2018567。本发明还涉及猴头菌(Hericium erinaceus)HT‑3的筛选方法，所述筛选方法包含猴头菌组织块的纯化菌种，菌种发酵培养，发酵液菌丝体的细胞内浸提麦角硫因，发酵液麦角硫因含量检测等步骤；本发明筛选的猴头菌菌株麦角硫因的产量高，所采用的筛选方法工艺简单，操作简便，生产成本低。

权利要求

1.一株猴头菌(Hericium erinaceus)，其中，其保藏编号为CCTCC No：M 2018567。

2.如权利要求1所述的猴头菌，其18s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的猴头菌，其ITS序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种组合物，其包括猴头菌(Hericium erinaceus)和发酵液，所述发酵液包含麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度为41mg/L以上，用于生产发酵液的发酵培养基包含：碳源、氮源、无机盐和维生素，所述猴头菌是权利要求1～3中任一项所述的猴头菌。

说明书

产麦角硫因的菌株及其筛选方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3及其筛选方法。

背景技术

[0002] 麦角硫因学名为2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，是天然的2-硫代咪唑氨基酸，溶解状态下存在硫醇和硫酮两种结构的互变异构体，在生理pH条件下主要以硫酮形式存在。麦角硫因最初是在1909年由Tanret C从麦角(寄生在禾本科植物黑麦上的一种真菌所成的菌核)中分离得到，纯品为白色晶体，具有良好的水溶性，室温下溶解上限为0.9mol/L，在生理pH和强碱条件下相当稳定。

[0003] 麦角硫因在抗氧化、清除自由基、螯合金属离子、防紫外辐射损伤、抑制癌症等方面具有独特的生理功能，并且在某些方面具有比谷胱甘肽等天然抗氧化剂更优越的生理功能。

[0004] 麦角硫因存在于很多动植物体内，但动物机体自身不能合成，只能从食物中摄取。许多微生物如真菌和放线菌都能够合成麦角硫因，但在细菌体内不能合成这种化合物。迄今为止关于利用真菌生产麦角硫因的研究较多。

[0005] 中国专利申请CN103184246A“麦角硫因的生物合成制备方法”，采用大型真菌(花脸香蘑、肺形侧耳和野生紫孢侧耳)的菌丝接种发酵合成麦角硫因，其中，花脸香蘑发酵液中麦角硫因的最高含量为51mg/L，肺形侧耳为48 mg/L，野生紫孢侧耳为37mg/L，麦角硫因的产量仍然不高，且生长周期长。

[0006] 中国专利申请CN103734022A“生产麦角硫因的菌种及制备麦角硫因的方法”，公布了糙皮侧耳发酵合成麦角硫因和从菌丝体细胞内浸提麦角硫因的步骤，但未公布糙皮侧耳菌株的筛选方法。

[0007] 中国专利申请CN102978121A“一种微生物转化法生产麦角硫因的方法”，公布了白香蘑菌通过微生物转化制备麦角硫因。但生物转化会影响菌体细胞活力，转化效率低。

[0008] 猴头菌(Hericium erinaceus)，又叫猴头菇，外形酷似猴头，因而得名。猴头菌菌丝细胞壁薄，具横隔，有锁状联合，子实体呈块状、扁半球形或头形，菌伞表面长有毛茸状肉刺，新鲜时呈白色，干燥后由浅黄至浅褐色，基部狭窄或略有短柄，上部膨大，直径3.5～10厘米，远远望去似金丝猴头，故称“猴头菇”。猴头菌是鲜美无比的山珍，菌肉鲜嫩，香醇可口，有“素中荤”之称。猴头菌不仅味道鲜美，还含有多种氨基酸，其中人体所需的占8 种，另外还富含多糖、各种维生素、无机盐、多肽类及不饱和脂肪酸。猴头菌易于发酵培养，且长速快，周期短，产量高。

发明内容

[0009] 为解决现有技术中的问题，本发明提供一株猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3，已于2018年8月23日在中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 2018567。本发明还提供一种包含猴头菌和发酵液的组合物，以及一种猴头菌的筛选方法。本发明技术方案如下:

[0010] 1.一株猴头菌(Hericium erinaceus)，其中，其保藏编号为CCTCC No：  M 2018567。

[0011] 2.如项1所述的猴头菌，其18s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1 (TTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTT GATGGTACCTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACAT GCAATTAAGCCCCGACTTCCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAAC CAACGCGGCTCGCCGCTCCTTTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCG CATGGCCTTGTGCCGGCGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTATCAACTT TCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAAT AAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCC AAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGG TAGTGACAATAAATAACAATATAGGGCTCTTTTGGGTCTTATAATTGGAA TGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCT GGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTT GTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCAGGCCTGGCCGGGCGGT CTGCCTAACGGTATGTACTGTCTGGCCGGGCCTTACCTCCTGGTGAGCC GGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCTTGA GAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCCCGAATACATTAGCATGG AATAATAAAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGAATCGCC GTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTGCGTTGCTAGAG GTGAAATTCTTGGATTTACGCAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCC AAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGA TCAGATACCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACTATGCCGACTAGGGATCGG GCGACCTCAATTTAATGTGTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTC TTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAAT TGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTC AACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAACTAGGATTGACAGATT GATAGCTCTTTCTTGATTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT GGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTAACC TGCTAAATAGCCCGGCCGGCTTTTGCTGGTCGCTGGCTTCTTAGAGGG) 所示。

[0012] 3.如项1所述的猴头菌，其ITS序列如SEQ ID NO:2 (TGCGGAAGGATCATTAATGAATTTGAAAGGAGTTGTTGCTGGCCTGA AACCCAGGCATGTGCACGCTCCAATCTCATCCATCTTACACCTGTGCAC CCTTGCGTGGGTCCGTCGGCTTTGCGGTCGATGGGCTTGCGTTTTTCAT AAACTCTTATGTATGTAACAGAATGTCATAATGCTATAAACGCATCTTAT ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA ATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCACGCCTGT TCGAGTGTCGTGAAATTCTCAACTCAATCCTCTTGTTATGAGAGGGCTG GGCTTGGACTTGGAGGTCTTGCCGGTGCTCCCTCGGGAAGTCGGCTCC TCTTGAATGCATGAGTGGATCCCTTTTGTAGGGTTTGCCCTTGGTGTGAT AATTATCTACGCCGCGGGTAGCCTTGCGTTGGTCTGCTTCTAACCGTCTT CGGACAACTTTCATCTCAACTTGACCTCGAATCAGGCGGGACTACCCG CTGAACTTAAGCATATCA)所示。

[0013] 4.如项1所述的猴头菌，其能够在发酵液中产生麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度为41mg/L以上，其中，用于生产发酵液的发酵培养基包含：碳源、氮源、无机盐和维生素。

[0014] 5.一种组合物，其包括猴头菌和发酵液，所述发酵液包含麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度为41mg/L以上，用于生产发酵液的发酵培养基包含：碳源、氮源、无机盐和维生素。

[0015] 6.根据项5所述的组合物，所述猴头菌是项1～4中任一项所述的猴头菌。

[0016] 7.一种猴头菌的筛选方法，其包含以下步骤：

[0017] (1)将猴头菌组织块，置于含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上， 23～28℃条件下，培养5～12天，得到猴头菌菌丝；将猴头菌菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，23～28℃条件下，培养5～12天，获得的猴头菌菌种；

[0018] (2)将步骤(1)得到的猴头菌菌种接种至发酵培养基，在23～26℃条件下，培养12～20天，其中在培养进行的第7～10天补充前体物质，得到发酵液；

[0019] (3)将发酵液离心，取上清液，过滤，检测滤液的麦角硫因含量，筛选产麦角硫因的菌株；

[0020] 优选地，所述筛选方法在上述(2)步骤之后，进一步包含将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外的步骤。

[0021] 8.根据项7所述的筛选方法，所述将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外的步骤为：

[0022] 将菌丝体发酵液先均质，后加热，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外；或者[0023] 将菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体悬液，先均质，后加热，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外。

[0024] 9.如项7所述猴头菌的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的抗生素包含：青霉素、链霉素、氯霉素中的任一种或二种以上的组合。

[0025] 10.如项7所述猴头菌的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述前体物质包含：半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸中的任一种或二种以上的组合；

[0026] 11.如项7所述猴头菌的筛选方法，其特征在于，每升所述的发酵培养基包含：碳源20～60g、氮源10～30g、无机盐2～5g、维生素0.001～0.005g。

[0027] 本发明的优势在于：本发明所提供的猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3 CCTCC No：M 2018567，容易培养，麦角硫因产量高；

[0028] 本发明所提供的猴头菌菌株的筛选方法，工艺简单，操作简便，成本低，可以大规模筛选菌种，容易筛选出高产量的菌种。

附图说明

[0029] 图1是猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC NO：M 2018567的菌落形态特征的照片。

[0030] 图2是猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC NO：M 2018567菌丝体的显微照片。

[0031] 图3是猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC NO：M 2018567的18s rRNA基因序列测定结果。

[0032] 图4是猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC NO：M 2018567的ITS 序列测定结果。

[0033] 图5是猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC NO：M 2018567发酵液中麦角硫因含量测定的HPLC图谱。

具体实施方式

[0034] 本发明的以下实施方式仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。

[0035] 下述所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。

[0036] 下述所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0037] 作为本发明的一种具体实施方式，猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3 CCTCC No：M 2018567在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(即PDA固体培养基)上生长较快，于25℃条件下生长
8天，菌落直径达到50～55mm，呈白色，线绒状，向四周做放射状延伸；背部呈浅褐色；其菌落形态特征参见图1。该菌株菌丝粗壮，由管状细胞组成，壁薄，有横隔和分枝，也有锁状联合，参见图2。

[0038] 猴菇菌为真菌类担子菌纲多孔菌目齿菌科猴头菌Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.，是一种腐生菌，也是一种著名的食用菌。全形似刺猬或猴头，故俗称猴头菇或猴菇。其中，猴头菌优选为猴头菌(Hericium erinaceus)CCTCC No：M 2018567，已于2018年8月23日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏。

[0039] 该猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC No：M 2018567的18s rRNA 基因序列为SEQ ID NO:1，参见图3。

[0040] 该猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3CCTCC No：M 2018567的ITS序列为SEQ ID NO:2，参见图4。

[0041] 作为本发明的一种具体实施方式，利用猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3 产麦角硫因的猴头菌菌株的方法包括：

[0042] (1)切取约0.5×0.5cm的猴头菌组织块，置于含抗生素的PDA固体培养基上，23～28℃条件下，优选为24℃；培养5～12天，优选为7～10天，得到猴头菌菌丝；将猴头菌菌丝转接到PDA固体培养基上，23～28℃条件下，优选为24℃；培养5～12天，优选为8天，获得的猴头菌菌种；

[0043] 其中PDA固体培养基为一种常用的固体培养基，其为半合成培养基，配方如下：马铃薯200g制成浸出液，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000 mL，不调节pH。

[0044] (2)将步骤(1)得到的猴头菌菌种接种至发酵培养基，在23～26℃条件下，优选为24℃；培养12～20天，优选为15天，其中在培养进行的第7～10天补充前体物质，得到发酵液；

[0045] (3)将发酵液进行离心，离心速度为8000～10000rpm，优选为8000rpm，离心时间10～20min，优选为20min，取上清液，过0.22μm微孔滤器过滤，检测滤液的麦角硫因含量，筛选产麦角硫因的菌株。所述步骤(1)的猴头菌组织块指菌盖、菌盖和菌柄相接处、菌柄中部、菌柄基部，优选菌盖。

[0046] 所述步骤(1)的抗生素包含：青霉素、链霉素、氯霉素中的任一种或二种以上的组合，优选为链霉素。

[0047] 所述抗生素的浓度为0.01～0.1g/L。

[0048] 所述步骤(2)前体物质包含：半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸中的任一种或二种以上的组合；

[0049] 所述步骤(2)前体物质的浓度分别为1～3mM。

[0050] 所述步骤(3)滤液麦角硫因含量的检测，采用高效液相色谱法进行测定， HPLC条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-水(3∶97)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。

[0051] 在一个具体的实施方式中，所述筛选方法在上述(2)步骤之后，进一步包含将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外的步骤。在一个具体的实施方式中，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外的步骤为：将菌丝体发酵液在 1000～6000rpm条件下，优选为4000rpm，均质20～100min，优选为60min，然后将发酵液升温至60～100℃，优选为80℃，加热20～100min，优选为50 min，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外。

[0052] 在一个具体的实施方式中，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外的步骤为：将菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体悬液，在1000～6000rpm条件下，优选为4000rpm，均质20～100min，优选为 60min，然后将发酵液升温至60～100℃，优选为80℃，加热20～100min，优选为60min，将麦角硫因从菌丝体的细胞浸提到细胞外。

[0053] 所述的发酵培养基每升包含：碳源20～60g、氮源10～30g、无机盐2～5 g、维生素0.001～0.005g。

[0054] 进一步地，所述发酵培养基的碳源包含可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米粉的任意一种或至少两种的组合物；

[0055] 优选地，所述发酵培养基的碳源包含：葡萄糖、麦芽糖的任意一种或两种的组合物。

[0056] 所述发酵培养基的氮源包含胰蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、麸皮、大豆肽粉、小麦蛋白胨、酪蛋白胨、玉米浆、、牛肉膏、硫酸铵的任意一种或至少两种的组合物；

[0057] 优选地，所述发酵培养基的氮源包含：牛肉膏、胰蛋白胨的任意一种或两种的组合物。

[0058] 所述发酵培养基的无机盐包含NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4的任意一种或至少两种的组合物；

[0059] 优选地，所述发酵培养基的无机盐为NaH2PO4。

[0060] 所述发酵培养基的维生素包含：维生素B1、维生素B2、烟酸、泛酸、维生素B6、维生素H、维生素B12的任意一种或至少两种的组合物；

[0061] 优选地，所述发酵培养基的维生素包含：维生素B1、烟酸的任意一种或两种的组合物。

[0062] 本发明还涉及含猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3发酵液的组合物，所述组合物含麦角硫因，其中麦角硫因在发酵液中的浓度至少为41mg/L，优选至少为60mg/L，进一步优选至少为70mg/L，再进一步优选至少为80mg/L，最优选为90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L 或150mg/L。所述猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3为本发明的猴头菌 (Hericium erinaceus)HT-3CCTCC No：M 2018567。

[0063] 实施例

[0064] 实施例1

[0065] 产麦角硫因猴头菌菌株的筛选

[0066] (1)在不同产地的猴头菌子实体菌盖处分别切取约0.5×0.5cm的内部组织块，置于含抗生素的PDA固体培养基上，24℃培养，将得到的菌丝转接到PDA固体培养基上进行纯化培养，纯化后的菌种接种于PDA斜面，3～4℃保藏备用；

[0067] (2)将步骤(1)得到的固体菌种接种至发酵培养基，在24℃培养16d，得到菌丝体发酵液，发酵培养基组成为蔗糖35g/L，玉米浆20g/L，KH2PO4 3 g/L，维生素B1 3mg/L，其余为水。发酵10d补充前体氨基酸半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，浓度分别为2mM。

[0068] (3)在发酵结束后，将菌丝体发酵液以4000rpm均质60min，再将均质后的发酵液升温至80℃加热50min，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中，8000rpm离心20min，取上清，过0.22μm微孔滤器过滤，筛选滤液中麦角硫因含量最高的菌株命名为猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3。

[0069] 实施例2

[0070] 猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3的形态学观察

[0071] 该猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3 CCTCC NO：M 2018567在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养基上生长较快，紧贴培养基表面匍匐蔓延，于25℃条件下生长8天，菌落直径50～55mm，呈白色，线绒状，向四周做放射状延伸；背部呈浅褐色；其菌落形态特征参见图1。
该菌株菌丝粗壮，由管状细胞组成，细胞壁薄，有横隔和分枝，也有锁状联合，参见图2。

[0072] 实施例3

[0073] 猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3的鉴定分类

[0074] 该猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3由上海生工生物工程(上海)股份有限公司对其基因组进行测序鉴定，该菌种被鉴定为猴头菌，其分类学为:真菌，双核菌亚界，担子菌门，伞菌亚门，伞菌纲，红菇目，猴头菌科，猴头菌属，其18s rRNA基因序列测定结果见图3，ITS序列测定结果见图4。

[0075] 实施例4

[0076] 麦角硫因的检测

[0077] 以实施例1中的HT-3发酵液为试验样品，采用高效液相色谱法进行麦角硫因含量测定，HPLC条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-水(3∶97)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。色谱图如图4所示，其中a)为标准品(麦角硫因含量浓度为9.4μg/mL)，b)为HT-3发酵液。

[0078] 实施例5

[0079] 对于发酵培养基的优化

[0080] 本实施例中，选择5种不同组分、含量和pH值的发酵培养基进行试验。每种发酵培养基组成及pH值如下述表1所示。

[0081] (1)将猴头菌(Hericium erinaceus)CCTCC NO：M 2018567菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中，15～30℃、100～300rpm培养5～10d。

[0082] 液体种子培养基：4％(w/v)的蔗糖、1.5％(w/v)的豆饼粉、0.2％(w/v)的磷酸二氢钠，0.1％(w/v)的硫酸钠，其余为水。

[0083] (2)将步骤(1)获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质，15～30℃、100～300rpm培养7～15d，发酵至终点，获得发酵液发酵10d 补充前体氨基酸半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸，浓度分别为2mM。

[0084] (3)在发酵结束后，将菌丝体发酵液以4000rpm均质60min，再将均质后的发酵液升温至80℃加热50min，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中，8000rpm离心20min，取上清液，过0.22μm微孔滤器过滤，测滤液中麦角硫因含量。

[0085] 选用5种不同的发酵培养基，最终滤液中测得的麦角硫因含量如表1所示。

[0086] 表1

[0087]

[0088] 目前，还有一些其它生物发酵制备的麦角硫因的方法，例如，利用液态深层培养方式进行杏鲍菇菌丝体培养生产麦角硫因，最终发酵产量可到 62.20mg/L；用香菇菌丝体液态深层发酵生产麦角硫因，产率可达23.6mg/L；花脸香蘑液态发酵生产麦角硫因，最高产量为51mg/L；肺形侧耳液态发酵生产麦角硫因，最高产量为48mg/L；野生紫孢侧耳液态发酵生产麦角硫因，最高产量为37mg/L。可以看出，这些生物发酵法制备的麦角硫因的产量普遍不高，利用本发明涉及的菌株在稍微优化培养基的条件下即可以获得较高产量的麦角硫因。