穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用、药物组合物及应用

摘要

本发明提供了穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用，属于医药技术领域，所述穗花杉双黄酮能够修复神经细胞，改善神经功能在保护和/或修复神经细胞中，具有疗效确切、作用稳定和毒副作用小等特点。

权利要求

1.一种药物组合物，其特征在于，包括以下重量份数的原料：穗花杉双黄酮40～80份、垫状卷柏双黄酮5～25份、芹菜素5～20份和槲皮素5～15份。

2.权利要求1所述的药物组合物在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用。

3.一种片剂，包括权利要求1所述的药物组合物和润滑剂。

4.根据权利要求3所述片剂，其特征在于，所述润滑剂包括微粉硅胶和/或硬脂酸镁。

5.一种胶囊剂，包括权利要求1所述的药物组合物和润滑剂。

6.根据权利要求5所述胶囊剂，其特征在于，所述润滑剂包括微粉硅胶和/或硬脂酸镁。

7.一种滴丸剂，包括权利要求1所述的药物组合物和水溶性基质。

8.根据权利要求7所述的滴丸剂，其特征在于，所述水溶性基质包括聚乙二醇和/或甘油明胶。

9.一种散剂，包括权利要求1所述的药物组合物、粘合剂和润滑剂。

说明书

穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用、

药物组合物及应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用、药物组合物及应用。

背景技术

[0002] 目前临床常用的修复神经细胞，改善神经功能的药物包括：(1)胆碱酯酶抑制剂：又称为抗胆碱酯酶药，通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制，达到使乙酰胆碱(Ach)在突触处的积累，延长并且增加了乙酰胆碱的作用。中枢神经系统胆碱能通路是记忆及认知信息处理、存储中心，增强胆碱能递质系统功能是治疗AD的重要方法，此类药物对延缓疾病进程、改善临床症状有明确效果，目前是AD的首选药物，同时也适用于血管性痴呆、路易体痴呆、帕金森病痴呆及脑外伤痴呆等。①多奈哌齐：具有高度选择性、可逆性乙酰胆碱酯酶的抑制作用，长期服用可改善AD和VaD患者认知状况及日常生活能力。②卡巴拉汀：可双重抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，临床应用取得良好疗效，目前为AD治疗常用药，临床应用时需逐渐加量。③加兰他敏：有抑制乙酰胆碱酯酶和调节胆碱受体的作用，对改善轻、中度AD 和VaD患者认知功能及日常生活能力有效。④石杉碱甲是由我国科研人员首先从石杉科植物千层塔中提取获得的一种生物碱，为可逆的、选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，可改善痴呆患者症状。(2)钙拮抗剂：尼莫地平是慢通道电压依赖性Ca2+拮抗剂，用于治疗AD、VaD及混合性痴呆，能改善患者的临床总体评价及认知功能，延缓VaD患者认知功能障碍的发展、降低血管性不良事件的发生。其他如氟桂利嗪、脑益嗪等。(3)兴奋性氨基酸拮抗剂：如谷氨酸受体拮抗剂盐酸美金刚(易倍申)可拮抗N-甲基-D-门冬氨酸受体，阻止谷氨酸盐释放，减少兴奋性毒性作用，可用于中晚期AD患者治疗。(4) 麦角碱类：通过拮抗肾上腺素作用增加脑血流量及能量代谢，可能改善AD 及VaD患者认知、情感及生活自理能力。(5)吡咯脘类药物：可改善脑微循环，有助能量代谢，增加学习记忆能力，长期服用副作用小。(6)促智剂：如γ-氨基丁酸类(吡拉西坦)。其他如抗氧化剂(维生素E、维生素C 和丙炔苯丙胺等)、非甾体抗炎药(阿司匹林、布洛芬等)、多肽类促智剂 (脑复活)、雌激素替代疗法等有资料表明可以降低认知障碍患病风险，但是有关的随机对照临床试验证据不充分，有待进一步研究确认。

[0003] 穗花杉双黄酮为两个芹菜素通过碳碳键相连形成的一个双黄酮结构，已有文献资料表明，穗花杉双黄酮具有抗炎、抗氧化、抗真菌、降血糖、降血脂和抗溃疡的作用，但现有技术中并未有穗花杉双黄酮具有修复神经细胞，改善神经功能作用的报道。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用，所述穗花杉双黄酮能够修复神经细胞，改善神经功能疗效确切，将所述穗花杉双黄酮制备成药物组合物后，利用本发明的药物组合物能够修复神经细胞，改善神经功能疗效确切、作用稳定而且毒副作用小。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用。

[0007] 本发明提供了一种药物组合物，包括以下重量份数的原料：

[0008] 穗花杉双黄酮40～80份、垫状卷柏双黄酮5～25份、芹菜素5～20份和槲皮素5～15份。

[0009] 本发明还提供了所述药物组合物在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用。

[0010] 本发明还提供了一种片剂，包括上述技术方案所述药物组合物和润滑剂。

[0011] 优选地，所述润滑剂包括微粉硅胶和/或硬脂酸镁。

[0012] 本发明还提供了一种胶囊剂，包括上述技术方案所述药物组合物和润滑剂。

[0013] 优选地，所述润滑剂包括微粉硅胶和/或硬脂酸镁。

[0014] 本发明还提供了一种滴丸剂，包括上述技术方案所述药物组合物和水溶性基质。

[0015] 优选地，所述水溶性基质包括聚乙二醇和/或甘油明胶。

[0016] 本发明还提供了一种散剂，包括上述技术方案所述药物组合物、粘合剂和润滑剂。

[0017] 本发明的穗花杉双黄酮具有修复神经细胞和改善神经功能的作用，本发明将其制备成药物组合物后，能够修复神经细胞，改善神经功能，疗效确切、作用稳定而且毒副作用小。

具体实施方式

[0018] 本发明提供了穗花杉双黄酮在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用。

[0019] 本发明对所述穗花杉双黄酮的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，在本发明实施例中，所述穗花杉双黄酮的制备方法优选包括以下步骤：

[0020] (1)将卷柏经70％～90％乙醇溶液回流提取，得到提取液；

[0021] (2)将所述步骤(1)中得到的的提取液经大孔吸附树脂和聚酰胺树脂柱洗脱，得到洗脱液；

[0022] (3)将所述步骤(2)中得到的洗脱液浓缩干燥，得到卷柏总黄酮；

[0023] (4)将所述步骤(3)中得到的卷柏总黄酮、90-95％乙醇和硅胶G混匀，干燥后加入装好的硅胶柱；

[0024] (5)以异丙醇-浓氨试液-水为流动相洗脱上述步骤(4)所述硅胶柱，得到穗花杉双黄酮收集液；

[0025] (6)将所述步骤(5)中的穗花杉双黄酮收集液减压回收、干燥和重结晶，即得穗花杉双黄酮。

[0026] 本发明将所述卷柏经70％～90％乙醇溶液回流提取，得到提取液。本发明对所述卷柏的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0027] 在本发明中，所述乙醇溶液的体积分数为70％～90％，优选80％。

[0028] 在本发明中，所述乙醇溶液回流提取的次数为1～4次，优选为2～3次。

[0029] 在本发明中，所述乙醇溶液回流提取的时间为0.5～3h，优选为1～2h，更优选为1.5h。

[0030] 本发明将所述提取液经大孔吸附树脂和聚酰胺树脂柱洗脱，得到洗脱液。本发明对大孔吸附树脂的种类和来源没有特殊限定，优选为AB-8，采用常规市售产品即可。

[0031] 本发明对所述聚酰胺树脂柱的种类和来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0032] 本发明所述洗脱液浓缩干燥，得到卷柏总黄酮。本发明对所述洗脱液浓缩干燥的方法没有特殊限定，采用常规洗脱液浓缩干燥的方法即可。

[0033] 本发明将所述卷柏总黄酮、90-95％乙醇和硅胶G混匀，自然干燥，加入装好的硅胶柱。

[0034] 在本发明中，乙醇用量以卷柏总黄酮重量计优选为1～8倍量，更优选为 5倍量。

[0035] 本发明对所述硅胶G的种类和来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0036] 本发明对所述硅胶柱的种类和来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0037] 本发明对所述异丙醇-浓氨试液-水为流动相洗脱上述所述硅胶柱，得到穗花杉双黄酮收集液。

[0038] 在本发明中，所述流动相异丙醇-浓氨试液-水的体积比优选为13:1:1。

[0039] 本发明将所述穗花杉双黄酮收集液减压回收、干燥和重结晶，即得穗花杉双黄酮。本发明对所述减压回收、干燥和重结晶的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，所述重结晶的次数优选为2次。

[0040] 本发明还提供了一种药物组合物，包括以下重量份数的原料：

[0041] 穗花杉双黄酮40～80份、垫状卷柏双黄酮5～25份、芹菜素5～20份和槲皮素5～15份。

[0042] 本发明提供的药物组合物包括重量份数为40～80份穗花杉双黄酮，优选为50～70份，更优选为60份。本发明对所述穗花杉双黄酮的来源没有特殊限定，采用常规制备方法制备得到的穗花杉双黄酮或采用常规的市售产品均可。本发明的穗花杉双黄酮具有修复神经细胞和改善神经功能的作用。

[0043] 本发明提供的药物组合物包括重量份数为5～25份垫状卷柏双黄酮，优选为10～20份，更优选为15份。本发明对所述垫状卷柏双黄酮的来源没有特殊限定，采用常规制备方法制备得到的垫状卷柏双黄酮或采用常规的市售产品均可。本发明所述的垫状卷柏双黄酮具有抑制黄嘌呤氧化酶，促进穗花杉双黄酮修复神经细胞和改善神经功能的作用。

[0044] 本发明提供的药物组合物包括重量份数为5～20份芹菜素，优选为8～16 份，更优选为15份。本发明对所述芹菜素的来源没有特殊限定，采用常规制备方法制备得到的芹菜素或采用常规的市售产品均可。本发明所述的芹菜素具有抗氧化，抑制黄嘌呤氧化酶并促进穗花杉双黄酮保护神经细胞的作用。

[0045] 本发明提供的药物组合物包括重量份数为5～15份槲皮素，优选为8～12 份，更优选为10份。本发明对所述槲皮素的来源没有特殊限定，采用常规制备方法制备得到的槲皮素或采用常规市售的产品均可。本发明的槲皮素具有调控PI3K/Akt信号通路，促进穗花杉双黄酮对神经细胞的保护作用。

[0046] 本发明还提供了所述药物组合物在制备保护和/或修复神经细胞药物中的应用。

[0047] 本发明还提供了一种片剂，包括所述药物组合物和润滑剂。本发明对所述片剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备片剂的制备方法即可。

[0048] 本发明对所述润滑剂的种类和来源没有特殊限定，优选为微粉硅胶和/ 或硬脂酸镁，采用常规市售产品即可。

[0049] 本发明还提供了一种胶囊剂，包括所述药物组合物和润滑剂。本发明对所述胶囊剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备胶囊剂的制备方法即可。

[0050] 本发明对所述润滑剂的种类和来源没有特殊限定，优选为微粉硅胶和/ 或硬脂酸镁，采用常规市售产品即可

[0051] 本发明还提供了一种滴丸剂，包括所述药物组合物和水溶性基质。本发明对所述滴丸剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备滴丸剂的制备方法即可。

[0052] 本发明对所述水溶性基质的种类和来源没有特殊限定，优选为聚乙二醇和/或甘油明胶，采用常规市售产品即可。

[0053] 本发明还提供了一种散剂，包括上述技术方案所述药物组合物、粘合剂和润滑剂。本发明对所述散剂的制备方法没有特殊限定，采用常规制备散剂的制备方法即可。

[0054] 本发明对所述粘合剂的种类和来源没有特殊限定，优选为糊精，采用常规市售产品即可。

[0055] 本发明对所述润滑剂的种类和来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0056] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明提供的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0057] 实施例1

[0058] 穗花杉双黄酮120g、垫状卷柏双黄酮30g、芹菜素30g和槲皮素20g混匀，即得药物组合物；将上述药物组合物200g、糊精100g，混匀，采用常规湿法制粒，干燥，加硬脂酸镁1.5g，混匀，压制成1000片，每片中含有穗花杉双黄酮0.12g。

[0059] 实施例2

[0060] 穗花杉双黄酮160g、垫状卷柏双黄酮10g、芹菜素10g和槲皮素20g混匀，即得药物组合物；将上述药物组合物加淀粉80g混匀，加入微粉硅胶20g、硬脂酸镁2g混匀，按照常规制备胶囊的制备方法制备胶囊1000粒，每粒胶囊中含有穗花杉双黄酮0.16g。

[0061] 实施例3

[0062] 穗花杉双黄酮90g、垫状卷柏双黄酮10g、芹菜素10g和槲皮素5g混匀，即得药物组合物，在上述药物组合物中加聚乙二醇6000500g，置滴丸机中，加热，采用常规制备滴丸的制备方法制备滴丸5000粒，每粒滴丸剂含穗花杉双黄酮0.018g。

[0063] 实施例4

[0064] 穗花杉双黄酮145g、垫状卷柏双黄酮20g，、芹菜素20g和槲皮素15g 混匀，即得药物组合物，在上述药物组合物中加糊精800g、硬脂酸镁2g混匀，采用制备散剂的常规制备方法制备散剂，每袋以1g计，每袋散剂中含有穗花杉双黄酮0.145g。

[0065] 实施例5

[0066] 穗花杉双黄酮的制备方法：将卷柏药材5000g经80％乙醇回流3次，提取3h，得到提取液，分别经过AB-8及聚酰胺树脂柱，收集洗脱液，浓缩干燥即得卷柏总黄酮。取卷柏总黄酮50g，90％乙醇250ml溶解，拌入硅胶G 50g 混匀，自然干燥，加入装好的硅胶柱，以异丙醇-浓氨试液-水(13:1:1)为流动相洗脱，收集穗花杉双黄酮，减压回收，干燥，重结晶2次，即得穗花杉双黄酮单体10g。

[0067] 取按照上述制备方法制备得到的穗花杉双黄酮5g加入50ml的水中，制备成浓度为0.1g/ml的穗花杉双黄酮溶液。取20只受试小鼠(雌雄各半)，按40mL/kg每日灌胃给药1次，连续给药14天，无动物死亡；给药后观察全部受试动物毛色、状态、自主活动、呼吸、口鼻分泌物、饮食和尿便均未见异常反应；14天后处死动物，解剖脏器均未见异常，体重逐渐增长。

[0068] 给予东莨菪碱、亚硝酸钠和45％乙醇造成的认知障碍模型小鼠各20只，对照组10只，实验组10只，其中，实验组给予50mg/kg剂量的穗花杉双黄酮；观察小鼠的错误反应时间和跳台错误次数。结果如下表所示：

[0069] 表1穗花杉双黄酮对东莨菪碱小鼠认知障碍的错误反应时间和跳台错误次数的影响

[0070] 组别 错误反应时间(秒) 跳台错误次数(次)对照组 190±13 6±0.9
实验组 80±9 2±0.2

[0071] 上述实施例的结果表明：穗花杉双黄酮对记忆功能障碍小鼠错误反应潜伏期延长和跳台错误次数减少，进而在病理组织学观察到，穗花杉双黄酮对三种致病因素导致的小鼠海马皮质细胞排列紊乱、稀疏和细胞数量明显减少的形态学改变有较好的改善和修复作用；在光镜下可以看到治疗后的小鼠海马区细胞数量增多，细胞排列整齐、致密，海马区的组织形态趋于完整。

[0072] 实施例6

[0073] 第一步，细胞培养；培养细胞为人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，使用含10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的低糖型培养基，在37℃、5％ CO2培养箱中进行培养；

[0074] 第二步，实施例1制备的组合物片剂对正常细胞作用；当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，加入终浓度为10、40、80μg/ml 的实施例1组合物片剂，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；吸走上清液，加入150μL DMSO，充分溶解结晶，酶标仪490nm，测定各孔吸收值A，计算细胞存活率，细胞存活率如以下表2所示；

[0075] 第三步，配制冈田酸、Aβ25-35溶液，分装，-20℃保存备用；

[0076] 第四步，建立受损细胞模型；当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，样品孔分别加入终浓度为420μmol/L 过氧化氢、终浓度为35nmol/L冈田酸、终浓度为40μmol/LAβ25-35，在37℃， 5％CO2培养箱中培养24h，细胞存活率为50％；

[0077] 第五步，组合物片剂对损伤细胞的保护；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为5
1.0×10 ，接种至96孔板，细胞与终浓度为10、40、80μg/ml的实施例1组合物片剂预先孵育
12小时后，加入损伤因子终浓度为420μmol/L 过氧化氢，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表2 所示；该结果反映组合物片剂对损伤神经细胞的保护作用；

[0078] 第六步，组合物片剂对损伤细胞的修复；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为5
1.0×10 ，接种至96孔板，细胞加入终浓度为420μmol/L过氧化氢，培养12h，弃去上清液，加入终浓度为10、40、80μg/ml的实施例1组合物片剂，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表2 所示；该结果反映组合物片剂对损伤神经细胞的修复作用；

[0079] 所述细胞SH-SY5Y为人神经母细胞瘤细胞，(购自中国科学院细胞库)；

[0080] 所述的培养基为低糖DMEM培养基。

[0081] 表2实施例1不同浓度组合物片剂对细胞存活率的影响

[0082]

[0083]

[0084] 实施例7

[0085] 第一步，细胞培养；培养细胞为人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，使用含10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的低糖型培养基，在37℃、5％ CO2培养箱中进行培养；

[0086] 第二步，实施例2制备的组合物胶囊对正常细胞作用；当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，加入终浓度为10、40、80μg/ml 的实施例2组合物胶囊，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；吸走上清液，加入150μLDMSO，充分溶解结晶，酶标仪490nm，测定各孔吸收值A，计算细胞存活率，细胞存活率如以下表3所示；

[0087] 第三步，配制冈田酸、Aβ25-35溶液，分装，-20℃保存备用；

[0088] 第四步，建立受损细胞模型；当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，样品孔分别加入终浓度为420μmol/L 过氧化氢、终浓度为35nmol/L冈田酸、终浓度为40μmol/LAβ25-35，在37℃， 5％CO2培养箱中培养24h，细胞存活率为50％；

[0089] 第五步，实施例2制备的组合物胶囊对损伤细胞的保护；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，细胞与终浓度为10、 40、80μg/ml的实施例2组合物胶囊预先孵育12小时后，加入损伤因子终浓度为35nmol/L冈田酸，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表3所示；该结果反映组合物胶囊对损伤神经细胞的保护作用；

[0090] 第六步，实施例2制备的组合物胶囊对损伤细胞的修复；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，细胞加入终浓度为35 nmol/L冈田酸，培养12h，弃去上清液，加入终浓度为10、40、80μg/ml的实施例2组合物胶囊，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表3所示；该结果反映组合物胶囊对损伤神经细胞的修复作用；

[0091] 所述细胞SH-SY5Y为人神经母细胞瘤细胞，(购自中国科学院细胞库)；

[0092] 所述的培养基为低糖DMEM培养基。

[0093] 表3实施例2不同浓度组合物胶囊对细胞存活率的影响

[0094]

[0095] 实施例8

[0096] 第一步，细胞培养；培养细胞为人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，使用含10％胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的低糖型培养基，在37℃、5％ CO2培养箱中进行培养；

[0097] 第二步，实施例3制备的组合物滴丸剂对正常细胞作用；当SH-SY5Y 细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，加入终浓度为10、40、80 μg/ml的实施例3组合物滴丸，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h；吸走上清液，加入150μLDMSO，充分溶解结晶，酶标仪490nm，测定各孔吸收值A，计算细胞存活率，细胞存活率如以下表4所示；

[0098] 第三步，配制冈田酸、Aβ25-35溶液，分装，-20℃保存备用；

[0099] 第四步，建立受损细胞模型；当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，样品孔分别加入终浓度为420μmol/L 过氧化氢、终浓度为35nmol/L冈田酸、终浓度为40μmol/LAβ25-35，在37℃， 5％CO2培养箱中培养24h，细胞存活率为50％；

[0100] 第五步，实施例3制备的组合物滴丸对损伤细胞的保护；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，细胞与终浓度为10、 40、80μg/ml的实施例3组合物滴丸预先孵育12小时后，加入损伤因子终浓度为40μmol/LAβ25-35冈田酸，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表4所示；该结果反映组合物滴丸对损伤神经细胞的保护作用；

[0101] 第六步，实施例3制备的组合物滴丸对损伤细胞的修复；当细胞处于对数生长期时，细胞浓度为1.0×105，接种至96孔板，细胞加入终浓度为40 μmol/LAβ25-35，培养12h，弃去上清液，加入终浓度为10、40、80μg/ml 的实施例3组合物滴丸，继续培养24h，MTT法测定细胞存活率，细胞存活率如以下表4所示；该结果反映组合物滴丸对损伤神经细胞的修复作用；

[0102] 所述细胞SH-SY5Y为人神经母细胞瘤细胞，(购自中国科学院细胞库)；

[0103] 所述的培养基为低糖DMEM培养基。

[0104] 表4实施例3不同浓度组合物滴丸对细胞存活率的影响

[0105]

[0106] 由以上实施例可以看出，本发明提供的穗花杉双黄酮能够修复神经细胞，改善神经功能疗效确切，作用稳定而且毒副作用小；将所述穗花杉双黄酮制备成药物组合物后，利用本发明的药物组合物能够修复神经细胞，改善神经功能疗效确切。

[0107] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。