聚-γ-谷氨酸的生产方法

摘要

本发明是一种培养由保藏编号NITE BP‑02276、保藏编号NITE BP‑02277、保藏编号NITE BP‑02278、保藏编号NITE BP‑02279、保藏编号NITE BP‑02280、或保藏编号NITE BP‑02281所规定的枯草杆菌(Bacillussubtilis)来生产聚‑γ‑谷氨酸的方法。

权利要求

1.一种生产聚-γ-谷氨酸的方法，其特征在于：培养由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281所规定的枯草杆菌(Bacillussubtilis)来生产聚-γ-谷氨酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草杆菌具有在调整为氯化钠浓度w/v为12％以上的LB培养基中能够增殖的高盐浓度耐性，且在氯化钠浓度w/v为10％的条件下培养时，具有重均分子量为300,000以上的聚-γ-谷氨酸生产能力。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在氯化钠浓度w/v为10％的条件下培养时，所述枯草杆菌生产的聚-γ-谷氨酸的重均分子量为1,000,000以上且50,000,000以下。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在氯化钠浓度w/v为10％以上的条件下培养所述枯草杆菌时，所述枯草杆菌生产聚-γ-谷氨酸0.5g/L/3天以上。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述枯草杆菌具有由序列编号7或8所示的碱基序列构成的16S rRNA基因。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述枯草杆菌表现出下述表1记载的菌学性质：表1

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用含有选自甘油、葡萄糖、麦芽糖、以及谷氨酸或其盐中至少1种作为碳源的培养基培养所述枯草杆菌。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用含有谷氨酸或其盐的培养基培养所述枯草杆菌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养基中的谷氨酸或其盐的浓度为0.005g/L以上且600g/L以下。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在不存在谷氨酸的情况下培养所述枯草杆菌。

11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中的至少1种盐的培养基培养所述枯草杆菌。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述培养基中的所述盐的浓度为0.01M以上且2.5M以下。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述盐为1价的金属盐，所述培养基中的所述盐的浓度为1.0M以上且2.0M以下。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述盐为2价的金属盐，所述培养基中的所述盐的浓度为0.1M以上且1.5M以下。

15.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述枯草杆菌的培养时间为1天以上。

16.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：培养所述枯草杆菌，以每1L培养基0.5g/3天以上生产PGA。

17.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所生产的所述聚-γ-谷氨酸的重均分子量为300,000以上且50,000,000以下。

18.一种枯草杆菌(Bacillussubtilis)，其特征在于：由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281规定。

说明书

聚-γ-谷氨酸的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种聚-γ-谷氨酸的生产方法及用于该生产方法的枯草杆菌(Bacillus subtilis)。

背景技术

[0002] 聚-γ-谷氨酸(也被称为“γ-聚谷氨酸”；以下，在本说明书中也称为“PGA”)是谷氨酸的γ位的羧基与α位的氨基经由肽键结合的高分子化合物。PGA作为纳豆菌(Bacillus subtilis var.natto)产生的粘性物质而为人所知，基于各种性质，近年来作为新的高分子原材料受到关注。

[0003] 关于高分子量的PGA表现出的性质，例如在非专利文献1中记载了与分子量为100,000的PGA相比，如分子量超过2,000,000的高分子量的PGA的抗肿瘤活性高。另外，在非专利文献2中记载了分子量为500,000和分子量更高的2,000,000的PGA具有高的脂质代谢控制活性。

[0004] 作为产生PGA的微生物，可以列举作为杆菌(Bacillus)属细菌的枯草杆菌、作为其近缘种的纳豆菌、枯草杆菌清曲酱菌(Bacillus subtilis var.chungkookjang)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨兽芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、以及作为嗜盐古细菌的嗜盐性古细菌(Natrialba aegyptiaca)。并且，已知有这些微生物产生的PGA的生产量、分子量因菌株的种类或培养条件而不同。

[0005] 例如，在专利文献1、非专利文献3中记载了具有耐盐性的枯草杆菌清曲酱菌生产1,000,000左右的PGA。并且，记载了该枯草杆菌清曲酱菌菌株在氯化钠浓度超过10％(w/v)的条件下，生产的PGA的分子量会低分子化至10,000～200,000左右。

[0006] 另外，在专利文献2记载了利用含有含氯化钠的酱油曲、酱油酿造物等的培养基培养纳豆菌菌株，生产PGA。关于专利文献2所记载的枯草芽孢杆菌菌株，在非专利文献4中记载了若培养基中所含的氯化钠浓度上升，则PGA生产能力降低。

[0007] 纳豆菌生产谷氨酸的光学异构体比(D/L比)为80/20～50/50左右的PGA。另外，含有纳豆菌的食品在日本国内以丰富的形式被食用，其安全性得到保证。因此，上述菌株之中，纳豆菌生产的PGA适合于食品、化妆品或医药品用途。

[0008] 现有技术文献

[0009] 专利文献

[0010] 专利文献1：日本特开2002-233391号公报

[0011] 专利文献2：日本特开平8-242880号公报

[0012] 非专利文献

[0013] 非专利文献1：The Chemical Record,2005,vol.5,p.352-366

[0014] 非专利文献2：J.Microbiol.Biotechnol.,2011,vol.21,p.766-775

[0015] 非专利文献3：Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001,vol.57,p.764-769

[0016] 非专利文献4：Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1997,vol.61(10),p.1684-1687

发明内容

[0017] 本发明涉及一种培养由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281所规定的枯草杆菌来生产PGA的方法。

[0018] 进而，本发明涉及一种由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281所规定的枯草杆菌。

[0019] 本发明的上述及其它特征和优势根据下述记载而更明了。

具体实施方式

[0020] 如上所述，在专利文献1和2、以及非专利文献3和4中记载的微生物能够生产PGA。然而，由于具有抗肿瘤活性或脂质代谢控制活性的分子量超过2,000,000的PGA为高粘性，因此，在芽孢杆菌属细菌或其近缘种中，难以高效地生产高分子量的PGA。

[0021] 另一方面，为了高效地生产PGA，需要减轻生产过程的负荷。这里，作为减轻生产过程的负荷的手段之一，考虑降低培养基的粘度。若粘度降低，则在培养工序中，氧和基质的扩散效率提升，从而能够期待生产效率的提升。进而，在分离回收工序中，也能够期待过滤、离心分离等的效率提升。

[0022] 作为降低培养基的粘度的方法，可以列举以高浓度含有培养基中所含的氯化钠等盐的方法。然而，如上所述，若在芽孢杆菌属细菌或其近缘种中，培养基中所含的氯化钠的浓度上升，则一般而言，所生产的PGA会低分子量化、或生产性降低。

[0023] 因此，在芽孢杆菌属细菌或其近缘种中，在高盐浓度条件下，如分子量超过300,000的PGA的生产目前仍是困难的。

[0024] 因此，本发明涉及提供一种减轻对PGA的生产过程的负荷、且能够生产高分子量的PGA的PGA的生产方法。

[0025] 另外，本发明涉及提供一种具有高盐浓度耐性、和在高盐浓度条件下的高分子量的PGA生产能力的枯草杆菌。

[0026] 本发明的发明人为了提供上述PGA的生产方法和枯草杆菌，进行了努力研究。结果发现，具有高盐浓度耐性和在高盐浓度条件下的高分子量的PGA生产能力的枯草杆菌。还发现，在高盐浓度条件下培养该枯草杆菌时，能够实现高分子量的PGA生产，并且能够减轻对PGA的生产过程的负荷。

[0027] 本发明是基于这些见解而完成的。

[0028] 本发明的枯草杆菌具有高盐浓度耐性和在高盐浓度条件下的高分子量的PGA生产能力。

[0029] 因此，通过培养本发明的枯草杆菌，能够生产高分子量的PGA。进而，通过在高盐浓度条件下培养本发明的枯草杆菌，能够不对PGA的生产过程不施加负荷而高效地生产PGA。

[0030] 在本说明书中，所谓“纳豆菌”是指根据菌学性质和16S rRNA基因的碱基序列的分析结果，能够分类为枯草杆菌、且具有PGA生产能力的微生物。

[0031] 本发明的枯草杆菌具有高盐浓度耐性和在高盐浓度条件下的高分子量的PGA生产能力。因此，本发明的枯草杆菌被分类于纳豆菌。在高盐浓度条件下，本发明的枯草杆菌生产的PGA的分子量大于现有的纳豆菌生产的PGA。进而，本发明的枯草杆菌与具有PGA生产能力的现有的纳豆菌相比，对高浓度的盐的耐性优异。

[0032] 通过在适当的条件下培养本发明的枯草杆菌，能够生产高分子量的PGA。尤其是通过在高盐浓度条件下培养本发明的枯草杆菌，能够对PGA的生产过程不施加负荷而生产高分子量的PGA。

[0033] 另外，也可以通过将所获得的PGA低分子化而调整至所期望的分子量。例如，通过在适当的条件下培养本发明的枯草杆菌，可生产高分子量的PGA，将其在酸性条件下经由加热处理、或使用PGA分解酶的处理等而将所获得的PGA低分子量化，从而将PGA的分子量调整至所期望的范围。这里，本说明书中记载的“分子量”与“重均分子量”含义相同。另外，盐浓度的标记“％(w/v)”或“M”、培养基成分浓度的标记“％(w/v)”或“(g/L)”和PGA浓度的标记“(g/L)”均为在室温下的浓度。

[0034] 以下，对本发明详细地进行说明。

[0035] 本发明的枯草杆菌是具有高盐浓度耐性的枯草杆菌，且是在将氯化钠浓度调整为12％(w/v)(相当于2.05M，室温)以上的LB培养基中能够增殖的枯草杆菌。

[0036] 如后述实施例也所示的那样，具有PGA生产能力的公知的纳豆菌不具有对高盐浓度的耐性，在氯化钠浓度12％(w/v)以上的LB培养基中无法增殖。相对于此，本发明的枯草杆菌具有高盐浓度耐性，即使在氯化钠浓度12％(w/v)以上的LB培养基中也能够增殖。关于本发明的枯草杆菌能够增殖的氯化钠浓度的上限值，在使用TSB培养基的条件下为16～17％(w/v)(相当于2.74～2.91M)，在使用LB培养基的条件下为15％(w/v)(相当于2.57M)。

[0037] 这里，所谓“在调整为氯化钠浓度12％(w/v)以上的LB培养基中能够增殖”是指所接种的细胞数在氯化钠浓度12％(w/v)以上的条件下通过培养会增加。另外，在本说明书中，关于“增殖”，能够测定培养前后的培养液的吸光度(OD600)，根据吸光度的增大而相对地算出。

[0038] 进而，本发明的枯草杆菌具有高分子量的PGA生产能力。具体而言，在氯化钠浓度10％(w/v)(相当于1.71M，室温)的高盐浓度条件下培养时，具有分子量为300,000以上的PGA生产能力。在氯化钠浓度为10％(w/v)的条件下培养时，本发明的枯草杆菌生产的PGA的分子量更优选为500,000以上，更优选为1,000,000以上，更优选为2,000,000以上，更优选为5,000,000以上，更优选为10,000,000以上。另外，其上限值通常为50,000,000。

[0039] 另外，所谓“在高盐浓度条件下具有分子量为300,000以上的PGA生产能力”，具体而言，是指在使用含有氯化钠10％(w/v)且含有增殖所需要的营养源、矿物质的培养基进行培养时，生产分子量为300,000以上的PGA至少0.1g/L/3天以上，优选为0.5g/L/3天以上，更优选为1.0g/L/3天以上，更优选为5.0g/L/3天以上。另外，在使用的培养基中，可以含有成为PGA基质的谷氨酸，也可以不含有。进而，优选在利用含有谷氨酸钠一水合物8％(w/v)(相当于1.37M)的培养基进行培养时能够生产10g/L以上的PGA，在不含有谷氨酸时能够生产0.3g/L以上的PGA。

[0040] 本发明的枯草杆菌优选具有包含序列编号7或8所示的碱基序列的16S rRNA基因。或者，本发明的枯草杆菌优选具有包含与序列编号7或8所示的碱基序列的同一性优选为
99.75％以上、更优选为99.85％以上、更优选为99.90％以上的碱基序列的16S rRNA基因。
或者，本发明的枯草杆菌优选具有包含在序列编号7或8所示的碱基序列中缺失、取代、插入或添加优选为1～3个、更优选为1个碱基的碱基序列的16S rRNA基因。

[0041] 这里，序列编号7所示的碱基序列为枯草杆菌KSM-FFA610株所具有的16S rRNA基因的碱基序列。另外，序列编号8所示的碱基序列为枯草杆菌KSM-FFB553株所具有的16S rRNA基因的碱基序列。

[0042] 这里，在本发明中，碱基序列的同一性能够使用位于公开的数据库NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)；http://www.ncbi.nlm.gov/)的菜单“Nucleotide”内的“BLAST”中的“Basic BLAST”来算出。或者，也能够通过使用Genetyx-Win(基因信息处理软件，GENETYX制造)的同源性分析程序，将单元大小(Unit size)(k-tuple)设为6进行分析，从而算出碱基序列的同源性。

[0043] 本发明的枯草杆菌优选为具有下述表1所示的菌学性质。

[0044] 表1

[0045]

[0046] 本发明的枯草杆菌优选为下述所示的枯草杆菌(1)或(2)。

[0047] (1)表现出表1记载的菌学性质、且具有16S rRNA基因的枯草杆菌，该16S rRNA基因包含：序列编号7所示的碱基序列；与序列编号7所示的碱基序列的同一性优选为99.75％以上、更优选为99.85％以上、更优选为99.90％以上的碱基序列；或在序列编号7所示的碱基序列中缺失、取代、插入或添加优选为1～3个、更优选为1个碱基的碱基序列。

[0048] (2)表现出表1记载的菌学性质、且具有16S rRNA基因的枯草杆菌，该16S rRNA基因包含：序列编号8所示的碱基序列；与序列编号8所示的碱基序列的同一性优选为99.75％以上、更优选为99.85％以上、更优选为99.90％以上的碱基序列；或在序列编号8所示的碱基序列中缺失、取代、插入或添加优选为1～3个、更优选为1个碱基的碱基序列。

[0049] 在本发明的枯草杆菌中，枯草杆菌KSM-FFA610株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02276保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFA610株，本发明的发明人在2012年6月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0050] 另外，枯草杆菌KSM-FFA631株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02277保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFA631株，本发明的发明人在2012年6月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0051] 另外，枯草杆菌KSM-FFB406株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02278保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFB406株，本发明的发明人在2013年6月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0052] 另外，枯草杆菌KSM-FFB425株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02279保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFB425株，本发明的发明人在2013年6月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0053] 另外，枯草杆菌KSM-FFB540株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02280保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFB540株，本发明的发明人在2013年7月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0054] 进而，枯草杆菌KSM-FFB553株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02281保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。关于枯草杆菌KSM-FFB553株，本发明的发明人在2013年7月左右在申请人的实验室(日本栃木县)获取。

[0055] 另外，本发明的枯草杆菌均为野生型微生物，分类为枯草杆菌，且具有作为纳豆菌特征的PGA生产能力。

[0056] 本发明的枯草杆菌能够通过以下方法、及将这些方法组合来进行，进而分离获得。

[0057] 具体而言，通过将市售的食品试样、或土壤等环境试样悬浮于生理盐水，并将其涂抹于琼脂培养基供于静置培养，能够获得出现于琼脂培养基上的微生物。另外，在医药品或食品用PGA中，优选使其分离源为食品试样。微生物的纯化可以列举如下的方法等：将琼脂培养基上的微生物画线涂抹于新的琼脂培养基、或使用生理盐水等适当的稀释液将上述悬浮试样稀释之后涂抹于琼脂培养基上，由此使单一菌落出现。

[0058] 作为高效地获得枯草杆菌的方法，可以列举：因枯草杆菌为芽孢菌而预先将上述试样进行热处理的方法、利用糖等营养源的合成代谢性的差异的方法、确认菌落周围的粘性物质的生产的方法等。另外，作为具有高盐浓度耐性的微生物的获得方法，可以列举预先利用含有高浓度的盐的琼脂培养基分离微生物的方法、利用含有高浓度的盐的液体培养基选择表现出良好的生长的微生物的方法等。

[0059] 另外，进而作为获取PGA生产中无需谷氨酸的微生物的方法，可以列举：在未添加谷氨酸的琼脂培养基中获得形成粘稠的菌落的微生物的方法；在使用未添加谷氨酸的液体培养基的培养中，在培养液中获得生产高分子量的PGA的微生物的方法等。

[0060] 本发明的PGA的生产方法使用上述本发明的枯草杆菌进行PGA的生产。

[0061] 如上所述，本发明的枯草杆菌与现有的纳豆菌相比，具有对高浓度盐的耐性。因此，为了使用本发明的枯草杆菌生产PGA，能够使用高于通常的盐浓度的培养基。

[0062] 一般而言，高分子的电解质在水溶液中成为高分子的离子，引起与抗衡离子的解离。由于因该解离产生强的静电场，故而因该静电力而使抗衡离子在周边凝集。其结果，产生抗衡离子活量的明显降低。另外，假定高分子离子单链的形态主要受静电相互作用支配，由于盐浓度的增加产生明显的收缩(川口正刚，高分子，53卷，p.716-718，2004年)。因此，在作为高分子电解质的PGA在水溶液中的行为中，也能够通过使培养基中的盐浓度上升而使水溶液的粘度降低。另外，在粘性高、流动性低的液体中，溶存的氧分子的移动效率降低，因此，为了确保好氧微生物的生长所需要的氧供给能力，必须进行更多的通气搅拌。另外，假定在伴随这样的大量的通气搅拌的使用发酵槽的培养系中，在培养液的粘度高的情况下产生发泡，使培养变得困难。另外，进而假定流动性低的液体试样在制造工序的移送效率差，其中，利用离心分离的菌体去除、微滤、或超滤等膜处理中的透过性显著降低。因此，根据本发明的PGA的生产方法，能够降低在水溶液中表现高粘性的高分子电解质即PGA的制造制程的负荷。

[0063] 在使用本发明的枯草杆菌生产PGA时，在适当的培养基中培养本发明的枯草杆菌，从培养基将生产到菌体外的PGA回收。

[0064] 作为培养基，能够使用包含甘油、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉等糖类作为用于生产PGA的碳源的培养基。另外，能够使用包含柠檬酸、乙酸等各种有机酸或其盐、以及谷氨酸或其盐等作为用于生产PGA的碳源的培养基。

[0065] 在本发明的PGA的生产方法中，作为用于生产PGA的碳源，可以使用上述碳源中的1种，也可以将2种以上组合使用。

[0066] 在本发明的PGA的生产方法所使用的培养基中，可以根据需要含有各种大豆蛋白质等天然物、氨基酸、聚蛋白胨、胰蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵或尿素等氮源等。作为本发明中能够使用的氮源，可以使用上述氮源中的1种，也可以将2种以上组合使用。

[0067] 本发明中使用的培养基可以为合成培养基，也可以为天然培养基。

[0068] 从进一步提高PGA的生产性的观点考虑，能够在上述培养基中添加谷氨酸或其盐。

[0069] 培养基中的谷氨酸或其盐的浓度能够适当设定。例如，培养基中的谷氨酸或其盐的浓度(谷氨酸换算)优选为0.005g/L以上较佳，更优选为0.05g/L以上，更优选为0.1g/L以上，更优选为0.5g/L以上。另外，关于其上限值，从避免培养基中的谷氨酸或其它培养基成分析出的观点考虑，优选为600g/L以下，更优选为500g/L以下，更优选为400g/L以下，更优选为300g/L以下。

[0070] 本发明的枯草杆菌即便在不存在谷氨酸的情况下，也能够将无机的氮源、和葡萄糖、甘油等除谷氨酸以外的物质作为碳源进行PGA的生产。

[0071] 谷氨酸能够通过以生物质为原料的发酵法进行生产，可以作为食品原材料、或饲料利用。认为这种在原料中不使用谷氨酸而能够高效地生产有用的高分子原材料即PGA的微生物从避免与粮食的竞争等观点、或工业生产成本的观点考虑也是有益的。

[0072] 因此，从不与粮食生产进行竞争、生产成本的观点考虑，优选利用不含谷氨酸而含有除谷氨酸以外的低价的氮源、及碳源的培养基培养本发明的枯草杆菌，生产PGA。

[0073] 培养基中所含的盐的种类能够适当设定。例如可以列举：作为1价的金属盐的氯化钠、氯化钾、或作为2价的金属盐的氯化钙、氯化镁、碳酸钙、碳酸镁、硫酸钙、硫酸镁等。其中，优选使用选自氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中的至少1种。

[0074] 另外，培养基中的盐浓度能够适当设定。

[0075] 例如，在1价的金属盐的情况下，优选为0.01M以上，更优选为0.1M以上，更优选为0.5M以上，更优选为1.0M以上。另外，其上限值优选为不阻碍细胞增殖或PGA生产的浓度，具体而言，更优选为2.5M以下，更优选为2.0M以下，更优选为1.75M以下。

[0076] 另外，例如，在2价的金属盐的情况下，优选为0.01M以上，更优选为0.1M以上，更优选为0.5M以上，更优选为1.0M以上。另外，其上限值优选为不阻碍细胞增殖或PGA生产的浓度，具体而言，优选为2.0M以下，更优选为1.75M以下，更优选为1.5M以下。

[0077] 另外，使用的培养基和培养后的培养液的粘度能够通过调整培养基中的盐浓度而设为所期望的范围。另外，在本发明中，培养基的粘度的测定方法能够利用适于非牛顿性液体的粘性测定的B型粘度计来进行。

[0078] 上述枯草杆菌的培养条件能够根据使用的枯草杆菌等适当选择。具体而言，最佳温度优选为20℃以上，优选为25℃以上，更优选为30℃以上。其上限值优选为50℃，更优选为45℃，更优选为40℃。最佳pH值优选为5以上，优选为5.5以上，更优选为6.5以上。其上限值优选为8，更优选为7.5，更优选为7。

[0079] 另外，培养时间为种菌接种后0.5天以上，优选为1天以上，更优选为3天以上。培养方法没有特别限制，可以列举振荡培养、搅拌培养、通气培养、静置培养等。

[0080] 将培养基中所累积的PGA回收时，需要去除生产了PGA的枯草杆菌的菌体。去除菌体的方法没有特别限制，可以列举离心分离法、使用微滤或超过滤膜的去除法、使用凝集剂的沉降去除、透析法等。另外，也可以将这些方法适当组合来使用。

[0081] 另外，从培养液分离PGA的方法也没有特别限制，能够利用将所生产的物质分离、回收时所使用的通常的方法来进行。例如，能够通过利用丙酮、甲醇、或乙醇等有机溶剂的沉淀、利用凝胶过滤管柱或离子交换管柱的层析分离、以及利用将pH值调整为PGA的等电点附近的酸沉淀的分离、电透析法等，将目标PGA分离、回收。

[0082] 本发明的枯草杆菌即便于高盐浓度的条件下也具有优异的PGA生产性，且能够生产高分子量的PGA。本发明的PGA的生产量优选为每1L培养基为0.1g/3天以上，更优选为0.5g/3天以上，更优选为1.0g/3天以上，更优选为5.0g/3天以上。

[0083] 在纳豆菌标准株中PGA的生产性降低的氯化钠浓度7.3％(w/v)(相当于1.25M)的条件下培养本发明的枯草杆菌时，在含有成为PGA基质的谷氨酸钠一水合物8％(w/v)的条件下，期望为每1L培养基为10g/3天以上的生产量。

[0084] 另外，在纳豆菌标准株中生长变得困难的氯化钠浓度10.2％(w/v)(1.75M相当)下进行培养时，在含有成为PGA基质的谷氨酸钠一水合物8％(w/v)的条件下，期望为每1L培养基为0.5g/3天以上的生产量。另外，进而在纳豆菌标准株中不期待PGA的生产的氯化钠浓度7.3％(w/v)的条件下，且在不存在成为PGA基质的谷氨酸的条件下培养本发明的枯草杆菌时，期望为每1L培养基为0.1g/3天以上的生产量。

[0085] 本发明的枯草杆菌在盐浓度未达0～10％(w/v)的条件下生产高分子量的PGA。另外，本发明的枯草杆菌即便在盐浓度为10％以上(w/v)的条件下也能够生产同等的高分子量的PGA。

[0086] 在氯化钠浓度为10％(w/v)以上的条件下培养本发明的枯草杆菌的时所生产的PGA的分子量为300,000以上，优选为500,000以上，更优选为1,000,000以上，更优选为2,000,000以上，更优选为5,000,000以上，更优选为10,000,000以上。另外，其上限值为50,
000,000，优选为40,000,000，更优选为35,000,000。

[0087] 由本发明所生产的PGA能够用于化妆品、医药品、食品、水质净化剂、保水材料、增粘剂等各种用途。

[0088] 尤其是本发明的枯草杆菌被分类于纳豆菌。并且，本发明的枯草杆菌所生产的PGA的分子量高于其它微生物生产的PGA。因此，本发明的枯草杆菌生产的PGA能够合适地用于具有抗肿瘤活性、脂质代谢控制活性的化妆品、医药品、食品等用途。

[0089] 关于上述实施方式，本发明还公开了以下方法和枯草杆菌。

[0090] ＜1＞一种培养由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281所规定的枯草杆菌来生产PGA的方法。

[0091] ＜2＞如上述＜1＞所述的方法，其中，上述枯草杆菌具有在调整为氯化钠浓度12％(w/v)(相当于2.05M，室温)以上、优选为12％(w/v)以上且16～17％(w/v)以下、更优选为12％(w/v)以上且15％(w/v)以下的LB培养基中能够增殖的高盐浓度耐性，且在氯化钠浓度10％(w/v)(相当于1.71M，室温)的条件下培养时，具有重均分子量为300,000以上的PGA生产能力。

[0092] ＜3＞如上述＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，在氯化钠浓度为10％(w/v)的条件下培养时，上述枯草杆菌生产的PGA的重均分子量为300,000以上，优选为500,000以上，更优选为1,000,000以上，更优选为2,000,000以上，更优选为5,000,000以上，更优选为10,000,000以上，且优选为50,000,000以下。

[0093] ＜4＞如上述＜1＞～＜3＞中任一项所述的方法，其中，在氯化钠浓度10％(w/v)以上的条件下培养上述枯草杆菌时，上述枯草杆菌生产PGA 0.1g/L/3天以上，优选为0.5g/L/3天以上，更优选为1.0g/L/3天以上，更优选为5.0g/L/3天以上。

[0094] ＜5＞如上述＜1＞～＜4＞中任一项所述的方法，其中，上述枯草杆菌具有16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含：序列编号7或8所示的碱基序列；与序列编号7或8所示的碱基序列的同一性优选为99.75％以上、更优选为99.85％以上、更优选为99.90％以上的碱基序列；或在序列编号7或8所示的碱基序列中缺失、取代、插入或添加优选为1～3个、更优选为1个碱基的碱基序列。

[0095] ＜6＞如上述＜1＞～＜5＞中任一项所述的方法，其中，上述枯草杆菌表现出上述表1记载的菌学性质。

[0096] ＜7＞如上述＜1＞～＜6＞中任一项所述的方法，其中，利用含有选自甘油、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉、柠檬酸或其盐、乙酸或其盐、以及谷氨酸或其盐中至少1种、优选选自甘油、葡萄糖、麦芽糖、以及谷氨酸或其盐中的至少1种作为碳源的培养基培养上述枯草杆菌。

[0097] ＜8＞如上述＜1＞～＜7＞中任一项所述的方法，其中，利用含有谷氨酸或其盐的培养基培养上述枯草杆菌。

[0098] ＜9＞如上述＜8＞所述的方法，其中，上述培养基中的谷氨酸或其盐的浓度为0.005g/L以上，优选为0.05g/L以上，更优选为0.1g/L以上，更优选为0.5g/L以上，且为
600g/L以下，优选为500g/L以下，更优选为400g/L以下，更优选为300g/L以下。

[0099] ＜10＞如上述＜1＞～＜7＞中任一项所述的方法，其在不存在谷氨酸的情况下培养上述枯草杆菌。

[0100] ＜11＞如上述＜1＞～＜10＞中任一项所述的方法，其中，利用含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、碳酸钙、碳酸镁、硫酸钙和硫酸镁中的至少1种盐、优选为选自氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中的至少1种盐的培养基培养上述枯草杆菌。

[0101] ＜12＞如上述＜11＞所述的方法，其中，上述培养基中的上述盐的浓度为0.01M以上且2.5M以下。

[0102] ＜13＞如上述＜11＞或＜12＞所述的方法，其中，上述盐为1价的金属盐，上述培养基中的上述盐的浓度为0.1M以上，更优选为0.5M以上，更优选为1.0M以上，另外，优选为2.0M以下，更优选为1.75M以下。

[0103] ＜14＞如上述＜11＞或＜12＞所述的方法，其中上述盐为2价的金属盐，上述培养基中的上述盐的浓度为0.1M以上，更优选为0.5M以上，更优选为1.0M以上，另外，优选为2.0M以下，更优选为1.75M以下，更优选为1.5M以下。

[0104] ＜15＞如上述＜1＞～＜14＞中任一项所述的方法，其中，上述枯草杆菌的培养时间为0.5天以上，优选为1天以上，更优选为3天以上。

[0105] ＜16＞如上述＜1＞～＜15＞中任一项所述的方法，其中，培养上述枯草杆菌，以每1L培养基0.1g/3天以上、优选0.5g/3天以上、更优选1.0g/3天以上、更优选5.0g/3天以上生产PGA。

[0106] ＜17＞如上述＜16＞所述的方法，其中，所生产的上述PGA的重均分子量为300,000以上，优选为500,000以上，更优选为1,000,000以上，更优选为2,000,000以上，更优选为5,000,000以上，更优选为10,000,000以上，另外，为50,000,000以下，优选为40,000,000以下，更优选为35,000,000以下。

[0107] ＜18＞一种枯草杆菌，其由保藏编号NITE BP-02276、保藏编号NITE BP-02277、保藏编号NITE BP-02278、保藏编号NITE BP-02279、保藏编号NITE BP-02280、或保藏编号NITE BP-02281规定。

[0108] ＜19＞如上述＜18＞所述的枯草杆菌，其在调整为氯化钠浓度12％(w/v)以上、优选为12％(w/v)以上且17％(w/v)以下、更优选为12％(w/v)以上且15％(w/v)以下的LB培养基中能够增殖，且在氯化钠浓度10％(w/v)的条件下培养时，具有重均分子量为300,000以上的PGA生产能力。

[0109] ＜20＞如上述＜18＞或＜19＞所述的枯草杆菌，其在氯化钠浓度为10％(w/v)的条件下培养时，生产重均分子量为300,000以上、优选为500,000以上、更优选为1,000,000以上、更优选为2,000,000以上、更优选为5,000,000以上、更优选为10,000,000以上、另外优选为50,000,000以下的PGA。

[0110] ＜21＞如上述＜18＞～＜20＞中任一项所述的枯草杆菌，其在氯化钠浓度10％(w/v)以上的条件下培养时，生产PGA 0.1g/L/3天以上，优选为0.5g/L/3天以上，更优选为1.0g/L/3天以上，更优选为5.0g/L/3天以上。

[0111] ＜22＞如上述＜18＞～＜21＞中任一项所述的枯草杆菌，其具有16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含：序列编号7或8所示的碱基序列；与序列编号7或8所示的碱基序列的同一性优选为99.75％以上、更优选为99.85％以上、最佳为99.90％以上的碱基序列；或在序列编号7或8所示的碱基序列中缺失、取代、插入或添加优选为1～3个、更优选为1个碱基的碱基序列。

[0112] ＜23＞如上述＜18＞～＜22＞中任一项所述的枯草杆菌，其表现出上述表1记载的菌学性质。

[0113] ＜24＞一种PGA的分子量调整方法，其将通过如上述＜1＞～＜17＞中任一项所述的方法所生产的PGA低分子化，调整为所期望的分子量。

[0114] 实施例

[0115] 以下，基于实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于此。另外，对于未记载制造商的试剂，能够使用通常可获取的试剂。

[0116] 这里，将本实施例所使用的引物的碱基序列示于表2。

[0117] 表2

[0118] 引物 碱基序列 序列编号27f 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1
1525r 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' 2
rE1L 5'-GTAGGAGTCTGGACCGTGT-3' 3
f2L(-) 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATA-3' 4
926f 5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3' 5
r2L' 5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3' 6

[0119] 试验例1芽孢形成微生物的获取方法

[0120] 在容积15mL的锥形管(制品编码352096，BD(Becton Dickinson)Falcon制造)中以无菌方式采集市售的腌菜、味噌、发酵调味剂、或纳豆等食品试样约5g，对该试样加入2倍重量的1％(w/v)氯化钠水溶液(杀菌处理剂)。将这些抵压于点触混合器(MT-31型，Yamato Scientific制造)的振动面，使其以均匀混合的样态悬浮，将试样在80℃下供于10分钟的加热处理。接着，将这些试样利用1％(w/v)氯化钠水溶液(杀菌处理剂)适当地阶段性稀释，分别涂抹于表3～6所示的微生物检测用培养基(LB琼脂培养基，将氯化钠调整为终浓度10％的LB琼脂培养基(LB+10％NaCl培养基)、改良GAM琼脂培养基(商品名：“NISSUI”，日水制药制造)和M+Yex琼脂培养基)。

[0121] 将这些琼脂培养基在30℃下供于2～5天的静置培养，观察琼脂培养基上的微生物的增殖和形态。接着，选择多个出现于这些各琼脂培养基上的单一菌落，在与确认了增殖的菌株相同的琼脂培养基上进行画线涂抹，将出现的单一菌落作为纯化株。进而，利用相同的琼脂培养基使该纯化株增殖，使所获得的菌体悬浮于含有20％(w/v)甘油的LB液体培养基中，在-80℃进行冷冻保存。

[0122] 表3

[0123]Luria-Bertani(LB)培养基 ％(w/v)
Bacto trypton(Becton,and Dickinson Company制造) 1.00
酵母提取液(Becton,and Dickinson Company制造) 0.50
氯化钠(和光纯药工业制造) 1.00
琼脂(和光纯药工业制造) 1.50

[0124] 表4

[0125] Luria-Bertani(LB)+10％NaCl培养基 ％(w/v)Bacto trypton(Becton,and Dickinson Company制造) 1.00
酵母提取液(Becton,and Dickinson Company制造) 0.50
氯化钠(和光纯药工业制造) 10.0
琼脂(和光纯药工业制造) 1.50

[0126] 表5

[0127] 改良GAM琼脂培养基 ％(w/v)培养基基剂混合粉末(日水制药制造) 5.67

[0128] 表6

[0129]M+Yex琼脂培养基 ％(w/v)
硫酸铵 1.00
酵母提取液(Becton,and Dickinson Company制造) 0.05
葡萄糖 1.00
硫酸镁七水合物(和光纯药工业制造) 0.05
硫酸锰五水合物(和光纯药工业制造) 0.003
磷酸氢二钾(和光纯药工业制造) 0.10
磷酸氢二钠十二水合物(和光纯药工业制造) 0.10
琼脂(和光纯药工业制造) 1.50

[0130] 试验例2枯草杆菌的选择方法(1)

[0131] 将试验例1中获得的菌株(-80℃冷冻保存试样)利用杀菌过的白金环(制品编码254410，Nunc制造)画线涂抹于LB琼脂培养基。将这些在30℃下供于1天的静置培养，利用目视确认各菌株的生长。

[0132] 接着，使用预先灭菌过的牙签将在LB琼脂培养基上生长的各菌株接种于M+Yex琼脂培养基，将其在30℃下供于1天的静置培养，利用目视进行各菌株的生长确认。

[0133] 接着，将在M+Yex琼脂培养基上生长的菌株分别接种于表7所示的M/葡萄糖合成代谢判定培养盘和表8所示的M/塔格糖合成代谢判定培养盘，在37℃下供于1～3天的静置培养。

[0134] 本试验例中，利用目视观察合成代谢判定培养盘上的生长，选择在M/葡萄糖合成代谢判定培养盘有作为生长指标的菌落形成且在M/塔格糖合成代谢判定培养盘中无菌落形成的菌株作为枯草杆菌候补株。

[0135] 表7

[0136]M/葡萄糖合成代谢判定培养盘 ％(w/v)
硫酸铵 1.00
D-葡萄糖 1.00
硫酸镁七水合物(和光纯药工业制造) 0.05
硫酸锰五水合物(和光纯药工业制造) 0.003
磷酸氢二钾(和光纯药工业制造) 0.10
磷酸氢二钠十二水合物(和光纯药工业制造) 0.10
琼脂(和光纯药工业制造) 1.50

[0137] 表8

[0138]M/塔格糖合成代谢判定培养盘 ％(w/v)
硫酸铵 1.00
D-塔格糖 1.00
硫酸镁七水合物(和光纯药工业制造) 0.05
硫酸锰五水合物(和光纯药工业制造) 0.003
磷酸氢二钾(和光纯药工业制造) 0.10
磷酸氢二钠十二水合物(和光纯药工业制造) 0.10
琼脂(和光纯药工业制造) 1.50

[0139] 试验例3枯草杆菌的选择方法(2)

[0140] 将利用1mM TE缓冲液(pH值8.0)将试验例1中制备的甘油保存试样稀释至30倍而得到的样品作为模板，使用表2所示的引物27f和引物1525r进行PCR，使16S rRNA基因区域约1.5kb的DNA片段扩增。DNA聚合酶使用TaKaRa LA Taq(TAKARA BIO制造)。在使模板DNA在95℃改性5分钟之后，以在95℃1分钟、在55℃30秒钟、在72℃2分钟作为1个循环并进行30个循环，进而在72℃保持恒温2分钟。

[0141] 对所获得的16S rRNA基因区域约1.5kb的DNA片段，使用表2所示的引物27f确定550bp的DNA碱基序列。

[0142] 另外，在序列分析试样的制备中，使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Cycle Sequencing Kit)(Applied Biosystems制造)，根据附带的操作说明(protocol)进行试样制备。在分析前的试样精制中，使用Montage SEQ kit(MILLIPORE制造)。接着，关于所制备的测序试样，使用DNA序列分析仪(商品名：ABI 3100Genetic Analyzer，Applied Biosystems制造)进行序列分析，确定碱基序列。

[0143] 序列的同源性检索使用位于公开数据库NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)；http://www.ncbi.nlm.gov/)的菜单“Nucleotide”内的“BLAST”中的“Basic BLAST”，从BLAST程序选择“nucleotide blast”。在检索对象的数据库中指定“Reference genomic sequences(refseq_genomics)”，在选择程序中指定“Highly similar sequences(megablast)”，进行同源性检索。

[0144] 根据所获得的结果，作为在本试验例中同源性最高的菌株，判定为枯草杆菌，且选择确定上述序列的550bp和与其相当的枯草杆菌标准株(Bacillus subtilis DSM 10株)的序列的同源性为98.9％以上的菌株作为枯草杆菌候补株。

[0145] 试验例4在未添加谷氨酸的条件下生产PGA的枯草杆菌的选择方法

[0146] 利用杀菌过的白金环(制品编码254410，Nunc制造)从试验例2和3中推定为枯草杆菌的冷冻保存试样采集冷冻菌体，将其接种于5mL的LB液体培养基，在30℃下供于24小时的振荡培养。将其作为种菌培养液，在30mL的未添加谷氨酸的PGA生产用培养基[培养基组成：7.5％葡萄糖、1.8％氯化铵、0.5％酵母提取液、0.035％硫酸镁七水合物、0.005％硫酸锰四～五水合物、100mM的3-吗啉基丙磺酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid，利用氢氧化钾调整为pH值7.0，同仁化学研究所制造)]上接种1％(v/v)，并将该培养基在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0147] 培养结束后，对培养液的上清液中所含的PGA利用下述测定例1所示的方法进行定量。其结果，选择在培养液上清液中检测出源自PGA的具有UV210nm的吸收的高分子物质的溶出组分的菌株作为在未添加谷氨酸的条件下能够生产PGA的枯草杆菌候补株。

[0148] 试验例5具有高盐浓度耐性的枯草杆菌的选择方法(1)

[0149] 将在试验例2和3中推定为枯草杆菌进而在试验例4中选作PGA生产枯草杆菌候补株的菌株的冷冻保存试样、和利用与试验例1相同的步骤所制备的从独立行政法人制品评价技术基盘机构获取的公知的纳豆菌标准株(NBRC 16449株、NBRC 3336株、NBRC 3936株)3 4
的冷冻保存试样，以成为1×10～1×10cell/mL的方式接种于LB+10％NaCl液体培养基，并在37℃下供于24小时的振荡培养。在该振荡培养之后，将培养液试样利用1％(w/v)氯化钠水溶液适当进行稀释，使用分光光度计(商品名：U-2900型；Hitachi High-Technologies制造)测定成为增殖指标的培养液的吸光度600nm(OD600)。

[0150] 其结果，在纳豆菌标准株中未见吸光度的增加。在本试验条件中，选择发现吸光度增加的菌株6株作为具有高盐浓度耐性和在高盐浓度条件下的高分子量的PGA生产能力的枯草杆菌株。

[0151] 试验例6枯草杆菌候补株的生长极限盐浓度的评价试验法

[0152] 将作为标准株的纳豆菌NBRC 3336株和枯草杆菌候补株利用与试验例4相同的条件，使用LB液体培养基制备种菌培养。

[0153] 接着，制备使氯化钠的终浓度为10％(w/v)、12％(w/v)、13％(w/v)、14％(w/v)、15％(w/v)和16％(w/v)的LB培养基，对其以初始吸光度成为0.05的方式接种上述种菌培养液，并在37℃下供于2天的振荡培养。在该振荡培养中经时性地采集培养液，将培养液试样利用氯化钠水溶液(与使用培养基相同浓度的氯化钠水溶液)适当进行稀释，使用分光光度计(U-2900型，Hitachi High-Technologies制造)测定成为增殖指标的培养液的吸光度
600nm(OD600)。

[0154] 试验例7选择的枯草杆菌的生长极限盐浓度的确认试验

[0155] 将具有高盐浓度耐性的枯草杆菌候补株使用LB+10％NaCl液体培养基并利用与试验例5相同的条件制备种菌培养。

[0156] 接着，对使氯化钠的终浓度为10％(w/v)、12％(w/v)、14％(w/v)、15％(w/v)、16％(w/v)、17％(w/v)、18％(w/v)、19％(w/v)或20％(w/v)的TSB培养基(Trypticase Soy broth(胰蛋白酶大豆培养液)，Becton,and Dickinson Company制造)，以初始吸光度成为0.1的方式接种上述种菌培养液，并在37℃下供于2天的振荡培养。在进行振荡培养之后，在培养开始第2天采集培养液试样，利用10％(w/v)氯化钠水溶液适当进行稀释，使用分光光度计(U-2900型，Hitachi High-Technologies制造)测定成为增殖指标的培养液的吸光度
600nm(OD600)。

[0157] 本试验例中，将直至培养第2天的培养液的吸光度成为种菌培养接种时的2倍以上的盐浓度条件判定为菌株的生长极限浓度。

[0158] 试验例8选择的枯草杆菌的生长最佳盐浓度的确认试验

[0159] 将具有高盐浓度耐性的枯草杆菌候补株使用LB+10％NaCl液体培养基并利用与试验例5相同的条件制备种菌培养。

[0160] 接着，制备不添加氯化钠且终浓度为1％(w/v)、2(w/v)、3(w/v)、4(w/v)、5(w/v)、6(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)和10％(w/v)的TSB培养基，将其在96孔圆底微板(型号3870-096，IWAKI制造)中各孔分注200μL。对其以各孔的初始吸光度成为0.05的方式接种上述种菌培养液，使用生物微板读取器(HiTS-S2型，SCINICS制造)，在37℃下供于24小时的振荡培养。

[0161] 生物微板读取器中，以150rpm进行振荡，利用干涉滤光器以30分钟间隔经时性地测定600nm的吸光度(OD600)。根据所获得的吸光度的值算出每单位时间的吸光度的增加，将其作为菌体增殖速度(ΔOD600/hr)，求出培养试验中的最大菌体增殖速度。

[0162] 本试验例中，将菌体增殖速度(ΔOD600/hr)自最大值至(最大值－0.2)的盐浓度判定为生长最佳盐浓度。

[0163] 实施例1选择的枯草杆菌的特征

[0164] 将利用试验例1～8所示的方法获得的具有高盐浓度耐性且生产PGA的枯草杆菌株(枯草杆菌KSM-FFA610株、枯草杆菌KSM-FFA631株、枯草杆菌KSM-FFB406株、枯草杆菌KSM-FFB425株、枯草杆菌KSM-FFB540株、枯草杆菌KSM-FFB553株)的生长特性示于表9～13。

[0165] 表9

[0166] 菌株编号 菌体增殖能(OD600) 备注NBRC 16449(纳豆菌标准株) 0.00 比较例
NBRC 3336(纳豆菌标准株) 0.00 比较例
NBRC 3936(纳豆菌标准株) 0.00 比较例
KSM-FFA610(枯草杆菌株) 3.32 本发明例
KSM-FFA631(枯草杆菌株) 2.44 本发明例
KSM-FFB406(枯草杆菌株) 0.78 本发明例
KSM-FFB425(枯草杆菌株) 3.09 本发明例
KSM-FFB540(枯草杆菌株) 2.76 本发明例
KSM-FFB553(枯草杆菌株) 2.95 本发明例

[0167] 表9表示试验例5的结果。

[0168] 如表9所示，在利用含有高浓度的氯化钠的LB液体培养基进行培养的情况下，作为对照的纳豆菌标准株中，吸光度成为检测极限以下，未确认到增殖。相对于此，在试验例2～4所选择的枯草杆菌株中，在试验例5所示的试验条件下发现有吸光度(OD600)超过0.5(相当于1×107cell/mL)的菌株。

[0169] 根据以上结果确认：本发明的枯草杆菌株为在纳豆菌标准株无法增殖的盐浓度下能够增殖的高盐浓度耐性株。

[0170] 表10培养第1天(24小时)的增殖度的比较

[0171]

[0172] 表11培养第2天(48小时)的增殖度的比较

[0173]

[0174] 表10和11表示试验例6的结果。

[0175] 如表10所示，在培养第1天中，在氯化钠终浓度10％(w/v)的条件下，作为对照的纳豆菌标准株(NBRC 3336株)的吸光度为约0.5，相对于此，本发明的枯草杆菌株的吸光度均显示为超过2.0的数值。

[0176] 另外，在氯化钠终浓度13％(w/v)的条件下，作为对照的纳豆菌标准株未确认到菌体增殖，相对于此，本发明的枯草杆菌株的吸光度显示为超过0.5的数值。

[0177] 根据以上结果确认：本发明的枯草杆菌候补株为具有高于纳豆菌标准株的盐浓度耐性的菌株。

[0178] 如表11所示，在培养第2天中，在氯化钠终浓度13％(w/v)的条件下，作为对照的纳豆菌标准株未确认到菌体增殖，相对于此，本发明的枯草杆菌候补株的吸光度均显示为超过1.5的数值。

[0179] 进而，本发明的枯草杆菌株在氯化钠终浓度为14％(w/v)的条件下，吸光度显示为超过0.5的数值。

[0180] 根据以上结果确认：本发明的枯草杆菌候补株为具有高于纳豆菌标准株的盐浓度耐性的菌株。

[0181] 表12选择的枯草杆菌株的增殖度(培养第2天)

[0182]

[0183] 表12表示试验例7的结果。

[0184] 如表12所示，在使用TSB培养基的高盐浓度生长试验中，关于本发明的枯草杆菌株在培养第2天的吸光度，KSM-FFA631株和KSM-FFB406株在氯化钠终浓度16％(w/v)的条件下、KSM-FFB425株、KSM-FFB540株和KSM-FFB553株在17％(w/v)的条件下、KSM-FFA610株在18％(w/v)的条件下为种菌培养接种时的2倍以上的值。

[0185] 根据以上结果确认：本发明的枯草杆菌株在使用TSB培养基的生长极限盐浓度的确认试验中，氯化钠的生长极限浓度为16～18％(w/v)。

[0186] 表13选择的枯草杆菌株的增殖速度(ΔOD600/hr)

[0187]

[0188] 表13表示试验例8的结果。

[0189] 如表13所示，本发明的枯草杆菌株在使用TSB培养基的生长最佳盐浓度的试验中，在氯化钠浓度为无添加～终浓度6％(w/v)(室温)的添加条件下，菌体增殖速度(ΔOD600/hr)为0.3～0.5的值。

[0190] 根据以上结果确认：在本发明的枯草杆菌株使用TSB培养基选择的枯草杆菌的生长最佳盐浓度的确认试验中，关于氯化钠的生长最佳浓度，枯草杆菌KSM-FFA610株中为0～5％(w/v)，枯草杆菌KSM-FFA631株中为0～4％(w/v)，枯草杆菌KSM-FFB406株中为0～5％(w/v)，枯草杆菌KSM-FFB425株中为0～4％(w/v)，枯草杆菌KSM-FFB540株中为0～5％(w/v)，枯草杆菌KSM-FFB553株中为0～5％(w/v)。

[0191] 实施例2基于菌学和16S rRNA基因的碱基序列分析的菌种鉴定

[0192] 对上述枯草杆菌株(枯草杆菌KSM-FFA610株、枯草杆菌KSM-FFA631株、枯草杆菌KSM-FFB406株、枯草杆菌KSM-FFB425株、枯草杆菌KSM-FFB540株、枯草杆菌KSM-FFB553株)的菌学性质进行了研究。将其结果示于表14。

[0193] 进而，对上述枯草杆菌株，根据下述测定例4，基于16S rRNA基因的碱基序列分析进行了菌种鉴定。将其结果示于表15。

[0194] 表14

[0195]

[0196] 如表14所示，确认上述枯草杆菌株全部具有枯草杆菌的菌学性质。

[0197] 表15

[0198]菌株 解码序列长度(bp) 同源性(％) 鉴定结果
KSM-FFA610 1,475 100 枯草杆菌
KSM-FFA631 1,475 99.93 枯草杆菌
KSM-FFB406 1,475 100 枯草杆菌
KSM-FFB425 1,475 99.93 枯草杆菌
KSM-FFB540 1,475 99.93 枯草杆菌
KSM-FFB553 1,475 99.93 枯草杆菌

[0199] 如表15所示，基于16S rRNA基因的碱基序列的同源性分析的结果可知，上述菌株全部具有与枯草杆菌DSM 10株99.9％以上的高同源性的16S rRNA基因的碱基序列。

[0200] 因此，关于上述枯草杆菌株，根据菌学性质和16S rRNA基因的碱基序列的分析结果，判断为枯草杆菌。

[0201] 另外，枯草杆菌KSM-FFA610株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02276保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0202] 另外，枯草杆菌KSM-FFA631株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02277保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0203] 另外，枯草杆菌KSM-FFB406株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02278保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0204] 另外，枯草杆菌KSM-FFB425株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02279保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0205] 另外，枯草杆菌KSM-FFB540株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02280保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0206] 进而，枯草杆菌KSM-FFB553株在2016年6月2日以保藏编号NITE BP-02281保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄托中心(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8)。

[0207] 实施例3在高浓度盐添加条件下的PGA生产性评价(1)

[0208] 以公知的纳豆菌标准株(NBRC 3336株和NBRC 16449株)作为对照，使用本发明的枯草杆菌株(KSM-FFA610株、KSM-FFA631株、KSM-FFB406株、KSM-FFB425株、KSM-FFB540株和KSM-FFB553株)，对高盐浓度条件下的PGA生产性进行评价。

[0209] 使用试验例1所示的上述菌株的冷冻保存试样和利用相同的步骤制备的纳豆菌标准株的冷冻保存试样，以与试验例4相同的培养条件，使用LB液体培养基，在30℃下供于24小时的振荡培养。将其作为种菌培养液，在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、1.25％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、以及7.3％氯化钠(相当于1.25M)或10.2％氯化钠(相当于1.75M)]上接种1％(v/v)。将该培养基在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0210] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液的上清液中所含的PGA进行定量。将其结果示于表16。

[0211] 表16

[0212]

[0213] 如表16所示，本发明的枯草杆菌株与纳豆菌标准株相比，即使在高盐浓度的条件下也表现出优异的PGA生产性。另外，即使在如纳豆菌标准株无法生长而无法生产PGA那样的含有高浓度的氯化钠的条件下，本发明的枯草杆菌株也能够生产PGA。

[0214] 根据以上结果，判断本发明的枯草杆菌为具有高盐浓度耐性的枯草杆菌。

[0215] 实施例4在高浓度盐添加条件下的PGA生产性评价(2)

[0216] 使用本发明的枯草杆菌株KSM-FFB553株，在1价的金属盐为高浓度的条件下对PGA生产性进行评价。

[0217] 通过与试验例4相同的方法制备种菌培养液，将其在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、1.25％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、以及氯化钠10.2％(相当于1.75M)或氯化钾11.2％(相当于1.5M)]上接种1％(v/v)。将这些在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0218] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液上清液中所含的PGA进行定量。将其结果示于表17。

[0219] 表17

[0220]

[0221] 如表17所示，确认本发明的枯草杆菌株即使在1价的金属盐为高浓度的条件下也表现出优异的PGA生产性。

[0222] 实施例5在高浓度盐添加条件下的PGA生产性评价(3)

[0223] 使用本发明的枯草杆菌株KSM-FFB553株，在2价的金属盐为高浓度的条件下对PGA生产性进行评价。

[0224] 通过与试验例4相同的方法制备种菌培养液，将其在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、1.25％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、以及10.2％氯化镁六水合物(相当于0.5M)或7.4％氯化钙二水合物(相当于0.5M)]上接种1％(v/v)。将这些在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0225] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液上清液中所含的PGA进行定量。将其结果示于表18。

[0226] 表18

[0227]

[0228] 如表18所示，确认本发明的枯草杆菌株即使在2价的金属盐为高浓度的条件下也表现出优异的PGA生产性。

[0229] 实施例6PGA的分子量的测定(1)

[0230] 对本发明的枯草杆菌株(KSM-FFA610株、KSM-FFA631株、KSM-FFB406株、KSM-FFB425株、KSM-FFB540株和KSM-FFB553株)生产的PGA的分子量进行测定。

[0231] 通过与试验例5相同的方法制备种菌培养液，将其在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、1.25％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、10.2％氯化钠(相当于1.75M)]上接种1％(v/v)。将该培养基在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0232] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液上清液中所含的PGA的分子量进行测定。将其结果示于表19。

[0233] 表19

[0234] 菌株 培养基组成(氯化钠浓度) PGA分子量KSM-FFA610 1.75M 33,200,000
KSM-FFA631 1.75M 17,100,000
KSM-FFB406 1.75M 35,700,000
KSM-FFB425 1.75M 6,300,000
KSM-FFB540 1.75M 5,300,000
KSM-FFB553 1.75M 4,400,000

[0235] 如表19所示，确认本发明的枯草杆菌株即使在添加有如纳豆菌标准株无法生长那样的高浓度的盐的条件下，也能够生产高分子量的PGA。另外，进而确认通过使用本发明的高盐浓度耐性株，能够生产高分子量的PGA。

[0236] 实施例7PGA的分子量的测定(2)

[0237] 使用实施例1所示的本发明的枯草杆菌株KSM-FFB553株，对在1价或2价的金属盐为高浓度的条件下生产的PGA的分子量进行评价。

[0238] 通过与试验例4相同的方法制备种菌培养液，将其在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、1.25％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、以及11.2％氯化钾(相当于1.5M)、10.2％氯化镁六水合物(相当于0.5M)或7.4％氯化钙二水合物(相当于0.5M)]上接种1％(v/v)。将其在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0239] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液上清液中所含的PGA的分子量进行测定。将其结果示于表20。

[0240] 表20

[0241]

[0242] 如表20所示，确认本发明的枯草杆菌株在1价或2价的金属盐为高浓度的条件下能够生产高分子量的PGA。

[0243] 实施例8在谷氨酸未添加条件下的PGA生产性评价

[0244] 使用本发明的枯草杆菌株(KSM-FFA610株、KSM-FFA631株、KSM-FFB406株、KSM-FFB425株、KSM-FFB540株和KSM-FFB553株)，在高盐浓度、且未添加谷氨酸的条件下对PGA生产性进行评价。

[0245] 通过与试验例5相同的方法制备种菌培养液，将其在30mL的PGA生产性评价培养基[培养基组成：8.0％甘油、0.5％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾、7.3％氯化钠(相当于1.25M)]上接种1％(v/v)。将该培养基在37℃下供于72小时的振荡培养。

[0246] 培养结束后，利用下述测定例1记载的方法对培养液上清液中所含的PGA进行定量，测定分子量。将其结果示于表21。

[0247] 表21

[0248]菌株 PGA生产量(g/L) PGA分子量
KSM-FFA610 1.02 4,600,000
KSM-FFA631 0.55 5,200,000
KSM-FFB406 0.37 1,200,000
KSM-FFB425 0.90 4,500,000
KSM-FFB540 0.78 4,600,000
KSM-FFB553 0.65 3,200,000

[0249] 如表21所示，确认本发明的枯草杆菌株即使在未添加谷氨酸的条件下也能够生产高分子量的PGA。

[0250] [测定例1]PGA的定量法和分子量测定法

[0251] 在PGA的定量和分子量的测定时，使用高效液相层析装置。

[0252] [HPLC装置构成]

[0253] 送液泵：L-6200型，日立制作所制造

[0254] 自动取样器：AS-4000型，日立制作所制造

[0255] 管柱烘箱：L-5020型，日立制作所制造

[0256] UV检测计：L-4250型，日立制作所制造

[0257] 层析数据分析装置：D-2500型，日立制作所

[0258] 分析柱使用排斥极限不同的亲水性聚合物用凝胶过滤柱TSKgel G6000PWXL(7.8mm I.D.×30cm，Tosoh制造)和TSKgel G4000PWXL(7.8mm I.D.×30cm，Tosoh制造)。将它们串联连接，并在分析柱的正前面连接保护柱TSK guardcolumn PWXL(6.0mm I.D.×4.0cm，Tosoh)来使用。

[0259] 关于分析，将洗脱液设为0.1M硫酸钠、流速1.0mL/min、管柱温度50℃，洗脱峰在检测波长210nm下进行测定。另外，在样品的预处理中，将经0.1M硫酸钠适当稀释的培养液上清液试样利用0.45μm Durapore膜(型号MULTI SCREEN MNHV45，MILLIPORE制造)进行过滤器过滤。

[0260] 在浓度判定中，使用分子量880,000的PGA(Meiji Food Materia)制作校正曲线。另外，在分子量判定中，使用利用普鲁兰Shodex STANDARD P-82(昭和电工)预先求出重均分子量的各种分子量不同的聚谷氨酸(和光纯药工业162-21411和162-21401；SIGMA-ALDRICH P-4886和P-4761；Meiji Food Materia(分子量880,000))。

[0261] [测定例2]培养液上清液试样中的高分子物质的鉴定方法

[0262] 将在实施例4中所获得的培养结束后的培养液试样以14,800rpm供于30分钟的离心分离(himac CR21GIII型，日立工机制造)，将去除了菌体的上清液试样回收。接着，将这些上清液试样1～10mL移入聚丙烯制的容积50mL离心管(型号227 261，greiner bio-one制造)，对该上清液试样量加入2倍容积的乙醇进行倒置混合后，在-30℃下恒温放置一晩。其后，以3,000rpm供于30分钟的离心分离(himac CF7D2型，日立工机制造)，回收沉淀组分。将所获得的沉淀组分再次溶解于2mL的蒸馏水中，再次通过上述添加乙醇制备沉淀组分，将其回收。接着，将所回收的试样溶解于2mL的蒸馏水中，将其0.5mL移入至带有螺旋盖的试验管(型号ST-13M，日本电子理化硝子制造)后，加入0.5mL的浓盐酸进行搅拌后，封入氮气，在105～110℃下进行16小时加热处理。加热处理后，在氮气气流下蒸馏去除盐酸和水分(约6小时)，将所获得的干燥物作为水解试样。

[0263] 另外，作为PGA样品，使用市售PGA(分子量880,000，Meiji Food Materia)，作为水解试样的对照，使用L-谷氨酸(L-Glutamic acid)和D-谷氨酸(D-Glutamic acid)(和光纯药工业公司制造)。

[0264] 接着，将所获得的水解试样适当进行稀释，利用全自动氨基酸分析装置(L-8900型，Hitachi High-Technologies制造)进行试样中的各种氨基酸分析和谷氨酸的定量。另外，使用L-谷氨酸测定试剂盒(YAMASA酱油)，按照试剂盒附带的操作说明中记载的方法，进行L-谷氨酸量的测定。在利用全自动氨基酸分析装置的测定中，获得光学活性异构体(D/L)的总量作为定量结果，将从该结果减去利用L-谷氨酸测定试剂盒所获得的定量结果得到的差量作为D-谷氨酸量。

[0265] 关于测定的结果，从KSM-FFA610株、KSM-FFB425株、KSM-FFB540株、和KSM-FFB553株的培养液试样所回收的高分子物质的谷氨酸的光学异构体比(D/L)分别为68/32、67/33、69/31和67/33。

[0266] 另外，在上述利用全自动氨基酸分析装置的测定中，由于未检测到除谷氨酸以外的氨基酸，因此，培养上清液中的高分子物质判定为PGA。另外，进而判断为上述所选择的本发明的具有高盐浓度耐性的枯草杆菌株生产的PGA的D/L比与公知的纳豆菌标准株生产的PGA的D/L比相等。

[0267] [测定例3]PGA溶液的粘度测定法

[0268] 上述菌株中使用KSM-FFB553株，在PGA制备用培养基[培养基组成：8.0％葡萄糖、8.0％谷氨酸钠一水合物、0.5％酵母提取液、1.0％硫酸铵、0.2％硫酸镁七水合物、0.003％硫酸锰四～五水合物、0.7％磷酸氢二钾、0.35％磷酸二氢钾]中以1％(v/v)制备培养液试样，由该培养液试样通过利用酸沉淀的回收、继而利用乙醇沉淀的精制回收和冷冻干燥来制备PGA干燥粉末。接着，将所获得的PGA试样(Mw5,000k)以成为4％(w/w)、8％(w/w)的方式溶解于蒸馏水和1.25M氯化钠水溶液中。将它们约40mL以不产生气泡的方式分别移入玻璃制螺旋管(型号No.7或No.8，Maruemu制造)、或聚丙烯制的容积50mL离心管(型号227 261，greiner bio-one制造)中，使用B型粘度计(TVB-15型，东机产业制造)，以试样温度20～25℃(室温)、测定时间60秒(自动停止模式)、转子旋转速度60rpm，使用M2转子进行测定。另外，对于上述测定条件下的测定值超过上限的试样，将转数适当变更为30rpm、或将使用转子适当变更为M3、M4进行测定。

[0269] 关于测定的结果，在PGA4％(w/w)的试样中，未添加盐的试样的粘度为380mPa·s，相对于此，添加有盐的试样为60mPa·s。另外，在PGA8％(w/w)试样中，未添加盐的试样的粘度为1,480mPa·s，相对于此，添加有盐的试样为450mPa·s。

[0270] 根据上述测定结果，确认通过添加盐的PGA试样的粘度降低效果。

[0271] [测定例4]基于16S rRNA基因碱基序列的菌种鉴定分析法

[0272] 基于16S rRNA基因的碱基序列的菌种鉴定按照以下实验步骤来进行。

[0273] 以与试验例2相同的方式，从冷冻保存菌体制备PCR用模板试样，使用表2所示的引物27f和引物1525r进行PCR，使16S rRNA基因区域约1.5kb的DNA片段扩增。DNA聚合酶使用TaKaRa LA Taq(TAKARA BIO制造)。使模板DNA在95℃改性5分钟之后，以在95℃1分钟、在55℃30秒钟、在72℃2分钟作为1个循环并进行30个循环，进而在72℃保持恒温2分钟。

[0274] 对所获得的16S rRNA基因区域的DNA片段，分别使用表2所示的引物27f、引物f2L(-)、引物926f、引物rE1L、引物r2L'和引物1525r作为测序用引物，进行DNA碱基序列的分析。另外，在序列分析试样的制备中，使用Big Dye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems制造)，根据附带的操作说明进行试样制备。在分析前的试样精制中，使用Montage SEQ kit(MILLIPORE制造)。

[0275] 关于所制备的测序试样，使用DNA序列分析仪(商品名：ABI  3100Genetic Analyzer，Applied Biosystems制造)进行序列分析，确定碱基序列。

[0276] 接着，对所获得的各碱基序列使用GENETYX ATSQ ver2.01(GENETYX制造)进行单片段化。序列的同源性检索使用位于公开数据库NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)；http://www.ncbi.nlm.gov/)的菜单“Nucleotide”内的“BLAST”中的“Basic BLAST”，从BLAST程序选择“nucleotide blast”。在检索对象的数据库中指定“Reference genomic sequences(refseq_genomics)”，在选择程序中指定“Highly similar sequences(megablast)”，选择同源率最高的标准株。接着，对于所选择的基准株的16S rRNA基因序列和经过上述序列确定的具有高盐浓度耐性的枯草杆菌候补株的16S rRNA基因序列，使用GENETYX Ver.13(GENETYX制造)，利用“Nucleotide vs Nucleotide Homology”菜单实施碱基序列对碱基序列的同源性分析，算出同源性(％)。

[0277] 对本发明及其实施方式一并进行了说明，但只要我们没有特别指定，则在说明的任何细节部分均不对我们的发明进行限定，认为可以在不违反附带的权利要求书所示的发明的精神和范围的情况下宽泛地进行解释。

[0278] 本申请主张基于2016年8月25日在日本提出专利申请的日本特愿2016-165099的优先权，该说明书在此作为参照将其内容作为本说明书的记载的一部分而引入本说明书中。