一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌PYQ4及其多糖制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌PYQ4及其多糖制备方法和应用。该菌株分类命名为罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)PYQ4，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16674。本发明包括菌株的分离培养及16S rDNA鉴定；菌株发酵产物胞外多糖的获得以及该菌株所产胞外多糖在晒后损伤修复上的应用。本发明公开的罗氏假单胞菌PYQ4所产多糖能显著提高晒后损伤细胞的增值活性，具有明显的晒后损伤修复作用，其作为微生物发酵的天然产物具有成本低廉、简单易获得等特点，可应用于相关晒后修复剂的制备，且具有良好的市场应用前景。

权利要求

1. 一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌菌株，其特征在于：其保藏名称为罗氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）PYQ4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.16674，保藏日期为2018年11月1日。

2.一种基于权利要求1所述罗氏假单胞菌的胞外多糖的制备方法，其特征在于：

1）罗氏假单胞菌PYQ4在产糖固体培养基上生长，挑取上述菌株接种到产糖发酵培养液中，在30℃-37℃，转速为150rpm的摇床中振荡培养24-48h；

2）将上述发酵液4000g离心10min以除去菌体得到上清液，上清液脱蛋白4-6次后，加入

3倍体积无水乙醇使多糖析出；析出的多糖复溶后透析除去小分子物质，之后冷冻干燥，即可得到多糖；所述透析步骤采用3500D透析袋，先流水透析24h，再用蒸馏水透析48h，并每隔

8h换一次蒸馏水。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述脱蛋白步骤采用Sevage法，具体为：配制正丁醇:三氯甲烷体积比为1:4的Sevage液，向所述上清液中加入其1/4体积的Sevage液，振摇15min使蛋白充分变性，4000g离心10min以除去分界面上变性的蛋白质。

4.权利要求2所述方法制备得到的多糖用于制备防晒类护肤品的应用。

5.权利要求4所述应用，其特征在于：所述护肤品中的多糖的添加量为100µg/mL-1000µg/mL。

说明书

一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌PYQ4及其多糖制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种高产胞外多糖的罗氏假单胞菌属菌株PYQ4，以及所产生的胞外多糖在晒后修复方面的用途。

背景技术

[0002] 随着大气污染逐年加重，臭氧层遭到严重破坏，辐射到地球表面紫外线显著增加，影响人们的生活质量。目前，UV对生物体的损伤作用及其防护已成为全球普遍关注的热点问题。

[0003] 皮肤是人体抵御外界各种理化刺激的第一道防线及生物屏障，其中UV是皮肤接触的重要有害因素之一。研究表明，过度暴露于紫外线辐射，是造成皮肤光损伤的主要原因，可引起红斑、炎症、色素沉积等。UV辐照会诱导细胞产生过量的活性氧(ROS)，破坏自身抗氧化防御系统，引起脂质过氧化反应，影响相关信号传导通路，损伤细胞结构或功能，从而诱发免疫抑制、恶性肿瘤等疾病。UV辐照还可能对细胞的DNA造成直接损伤，形成环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)和6-4嘧啶酮(6-4PPs)。

[0004] 值得注意的是，近年来，皮肤护理产品用于保养健康皮肤的主要作用正在增加。然而，目前晒后修复市场上的护肤品功效成分大多是化学品或植物来源的天然提取物。而微生物来源的天然提取物正成为这个领域的新起之秀。与前者相比，消费者更青睐天然提取物，与后者相比微生物来源的天然提取物比植物来源的成本更低廉，且简单易获取，因此具有良好的市场前景。

[0005] 近年来，关于微生物胞外多糖的在改善皮肤性状上的应用研究日益增加，例如利用以乳酸乳球菌等产生的磷酸化多糖作为保湿剂和美白剂利用的方法(日本特开平9-249524号公报、日本特开平10-251140号公报)、以乳杆菌属菌株产生的多糖成分作为消炎剂利用的方法(日本特开平7-70209号公报)，乳酸菌发酵乳中分离的胞外多糖预防无毛小鼠紫外线诱发的皮肤损伤(International Journal of Molecular Sciences,2017)等，但尚未有将假单胞菌胞外多糖作为晒后修复成分使用的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种能高产胞外多糖的罗氏假单胞菌及其所产胞外多糖在晒后损伤修复领域的应用方法，为晒后修复领域提供成本低廉、简单易获取的，不同于化学品以及植物提取物的微生物发酵来源材料，具有广阔的应用前景。

[0007] 本发明公开了一株能产多糖，且所产多糖具有促进晒后损伤细胞增殖，起到晒后损伤修复效用的微生物菌株。该菌株通过革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌，同时通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。将该菌种的所测得到的序列在NCBI数据库中进行BLAST对比分析，发现与罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)的16S rDNA序列具有高度同源性。可确定该菌种为罗氏假单胞菌，命名为Pseudomonas rhodesiae PYQ4。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，菌种保藏号CGMCC No.16674，保藏日期为2018年11月1日。

[0008] 本发明所述菌株在产糖固体培养基上的单菌落呈圆形、黄绿色且粘稠。且该菌株会产生黄绿色色素扩散至整个平板。

[0009] 作为优选，所述产糖固体培养基组分为：蔗糖10-20g/L、胰蛋白胨5-10g/L、酵母粉5g/L、Na2HPO4·12H2O 3g/L、琼脂15-20g/L，余量为蒸馏水。

[0010] 本发明提供了上述菌株发酵所产胞外多糖的获得方法。挑取适量的上述菌株接种到产糖发酵培养基中。在30℃-37℃，转速为150rpm的摇床中振荡培养24-48h。将上述发酵液4000g离心10min以除去菌体得到上清液。上清液用Sevage法脱蛋白4-6次后，加入3倍体积无水乙醇使多糖析出。析出的多糖复溶后透析除去小分子物质，之后冷冻干燥，即可得到上述菌株发酵所产生的胞外多糖。

[0011] 作为优选，所述产糖发酵培养液的组分为：蔗糖50g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母粉1g/L、Na2HPO4·12H2O 3g/L，余量为蒸馏水。

[0012] 本发明还提供了上述多糖作为晒后损伤修复剂的应用方法。将过膜除菌的多糖溶液添加到护肤品中。在人体皮肤受到UV损伤之后，将含有多糖的护肤品涂膜在皮肤表面以起到晒后修复效果。所述护肤品中多糖的浓度为100μg/mL-1000μg/mL。

[0013] 多糖溶液的晒后修复功效可通过人永生化表皮角质细胞(HaCaT细胞)的MTT实验进行测试。

[0014] 本发明提供的菌株能在产糖培养基上发酵产生大量多糖，且所产多糖能有效修复晒后损伤。此外，作为微生物发酵产物，与晒后修复领域内常见的化学品类和植物提取物类物质相比，其具有活性成分简单易得、价格低廉等优势。

附图说明

[0015] 图1本发明菌株PYQ4的平板培养性状；

[0016] 图2本发明菌株PYQ4的16S rDNA序列Neighbor-Joining系统发育树；

[0017] 图3本发明菌株PYQ4发酵所产多糖对HaCaT的保护效果。

具体实施方式

[0018] 下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。

[0019] 实例1：罗氏假单胞菌PYQ4所产胞外多糖的提取及含量测定

[0020] 从产糖固体培养基上挑取适量的上述菌株接种到产糖发酵培养基中。在30℃，转速为150rpm的摇床中振荡培养48h得到发酵液。图1为本发明菌株PYQ4的平板培养性状。

[0021] 其中，所使用产糖固体培养基组分为：蔗糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、Na2HPO4·12H2O 3g/L、琼脂20g/L，余量为蒸馏水。所使用产糖发酵培养液的组分为：蔗糖50g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母粉1g/L、Na2HPO4·12H2O 3g/L，余量为蒸馏水。

[0022] 将上述发酵液4000g离心10min以除去菌体得到上清液。在上清液中加入1/4体积的Sevage液(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)，振摇15min后4000g离心10min以除去分界面上变性的蛋白质。重复5次后，取上层液体，加入3倍体积无水乙醇使多糖析出。析出的多糖复溶后采用3500D透析袋透析，以除去小分子物质。透析完成之后的多糖溶液减压浓缩之后进行冷冻干燥，即可得到上述菌株发酵所产胞外多糖。

[0023] 采用苯酚-硫酸法可测得上述菌株发酵所产胞外多糖的产量为2.5g/L。

[0024] 实例2：本发明所述微生物菌株的鉴定

[0025] 该菌株通过革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌。根据宝日医生物细菌基因组DNA提取试剂盒(TakaraBacteria Genomic DNA Extraction Kit)步骤提取本发明所述菌株的总DNA，以通用引物27F和1492R扩增该菌的16S rDNA基因，回收扩增产物后进行测序，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。获得的序列结果在NCBI进行Blast比对，从GenBank的数据库中获得与该菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA软件计算序列相似性并采用领位相连算法(Neighbor-Joining)作系统发育分析。

[0026] 构建完成的该菌株的系统发育树如图2所示，与罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)同源性最高，可确定本发明所述菌株为罗氏假单胞菌，并命名为Pseudomonas rhodesiae PYQ4。

[0027] 实例3：上述多糖作为晒后损伤修复剂的应用

[0028] 收集对数期的HaCaT细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞分为对照组、UV模型组、多糖组(1mg/mL)、甲氧基肉桂酸乙基己酯(MCX)组(8％)以及抗坏血酸(Vc)组(1mg/mL)，其中后两组为阳性对照，每组重复3孔。细胞培养24h后，将培养基换成磷酸盐缓冲液(PBS)后用UV进行辐照，其中对照组用锡箔纸包裹避光。吸出PBS，加上培养基，其中多糖组的培养基内含1mg/mL的上述菌株多产胞外多糖，MCX组培养基内含8％的甲氧基肉桂酸乙基己酯，Vc组培养基内含1mg/mL的抗坏血酸。在培养箱中继续培养24h后，用MTT法检测UV辐照后细胞活率，评价上述物质作用后细胞增殖活性是否提高。

[0029] MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

[0030] 细胞存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值*100％

[0031] 根据图3所示，UV处理下HaCaT细胞存活率大大降低，只有对照组的47.60％，但多糖处理组能够显著提高UV辐照后细胞的存活率至65.03％。说明上述菌株所产胞外多糖有显著的晒后损伤修复效果。