一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法

摘要

本发明提供一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：在番木瓜杂交群体中筛选获得性别决定分子标记Sex79，根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物；采用该引物进行PCR扩增，检测，结果判定。本发明提供单一DNA分子标记Sex79，针对Sex79设计一对引物，直接利用该引物对即可进行番木瓜性别鉴定，并且可以在不提取DNA的情况下直接进行PCR然后电泳检测，还可以通过试纸条直接检测，操作简单，节省成本，快速高效。本发明还根据性别决定分子标记Sex79设计了LAMP检测引物，结合LAMP技术实现田间批量快速检测。

权利要求

1.一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、获得DNA分子标记：在番木瓜杂交群体中筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2、根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物用于LAMP检测，引物序列如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：9所示；或根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物用于PCR扩增，检测，引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

S3、结果判定；

进行LAMP检测时，结果判定方法为：扩增曲线为S型曲线时，判定为雄性或两性，未得到S型曲线时判定为雌性；

若进行PCR扩增后的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测时，结果判定方法为：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性；若进行PCR扩增后的检测方法为试纸检测时，结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。

2.根据权利要求1所述的快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，步骤S2中，以番木瓜DNA为模板进行PCR扩增。

3.根据权利要求1所述的快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，步骤S2中，不进行番木瓜DNA提取，直接将番木瓜叶片加入到PCR反应体系进行反应。

说明书

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物性别鉴定技术领域，特别涉及一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法。

背景技术

[0002] 番木瓜是雌花雄花两性花异株的(trioecious)植物。通常番木瓜有三种性别的树：雌树(Female)、雄树(Male)和两性树(Hermaphrodite)。只有雌树和两性树才能结果，在传统耕作中，需要通过播种、开花后才能判定番木瓜性别，此过程耗费3-6个月的时间，限制了番木瓜的生产。

[0003] 目前判断番木瓜性别的主要技术有：

[0004] (1)外部形态：番木瓜在苗期鉴定性别对其育种及栽培均有一定意义，但在幼苗形态上各种类型的株型几乎没有区别，难以实现苗期快速鉴定；

[0005] (2)生理生化差异：Jaiswal研究了番木瓜无性组织和生殖组织的酸性和碱性磷酸酶活力，发现雄株生殖组织的酸性和碱性磷酸酶活力高于雌株。此方法受到不同栽培条件、取样部位以及取样时间的影响，存在很高的假阳性率，且成本高，操作复杂；

[0006] (3)同工酶图谱：陈中海采用同工本酶技术研究番木瓜性别发现雌株、雄株和两性株过氧化物酶(PODD)、酯酶(ESTD)和多酚氧化酶(PPOD)同工酶谱上存在差异。此技术操作复杂，成本高，同时只能适用于成熟植株，不能对苗期进行性别鉴定；

[0007] (4)分子标记技术：番木瓜性别的分子水平研究一直是研究热点和难点。

[0008] (a)夏威夷大学的Deputy等获得了与番木瓜性别紧密连锁的3个RAPD标记，经测序合成引物转换为SCAR标记，并认为SCAR T12和SCARW11在两性株和雄株与间能够产生特异的PCR产物，而在雌株中却极少出现；SCAR T1在所有的株性间均有该PCR产物产生，因此利用T1、T12和W11这3对引物可以在苗期进行早期性别鉴定。但是，三个引物组合的鉴别过程繁多、复杂、价格高，不能直接应用商业生产。

[0009] (b)Eliana等利用RAPD技术发现引物BC210产生的标记BC210438可以检测供试材料的两性株类型。此技术存在假阳性，也不能直接用于农业生产。

[0010] (c)Parasnis用微卫星和微小卫星来作为番木瓜性别特异标记的研究，发现用GATAD 4探针鉴定了1个5Kb的特异带仅出现在雄株中,从染色体水平上提示了性别差异的遗传物质基础，但是操作成本非常昂贵，不适合农业生产。

[0011] (d)周应国用混合分离群体分析法寻找到了番木瓜两性基因M2的RAPD标记OPG071800和OPE061050，发现与M2基因紧密连锁，并且位于M2基因的两侧，其遗传距离分别为4.5cm和1.9cm，但是操作成本非常昂贵，不适合农业生产。

[0012] 综上，本领域关于番木瓜性别早期鉴别技术已经开展了很多研究，基本上可以归位两类，一类是基于表型和生理生化特征因子，如外部形态、生理生化差异、同工酶图谱等。这一类技术基本能够对番木瓜性别进行鉴别，但是受到植物生长状态、不同管理措施、种植条件、采样部位、处理时间、重复性低等因素的制约，无法推广应用。第二类是基于DNA分子标记的鉴别方法，这一类方法克服了第一类技术的很多缺陷，能够从DNA水平上实现番木瓜性别的早期鉴定。这类方法通常利用RAPD、SSR、AFLP、微卫星等技术在大量的群体中筛选紧密连锁的分子标记。这类方法往往受限于群体的大小、群体的代表型以及技术本身的非特异性扩增导致的假阳性。现在在学术研究上最为常用的就是夏威夷学者发现的T1、T12和W11三个组合引物，但是三个引物组合的鉴别过程繁多、复杂、价格高、不能直接应用商业生产。

发明内容

[0013] 鉴以此，本发明的主要目的是寻找单一DNA分子标记，并结合其他DNA检测方法，快速高通量的实现番木瓜早期(苗期)性别鉴定。

[0014] 本发明的技术方案是：

[0015] 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

[0016] S1、获得DNA分子标记：在番木瓜杂交群体中筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

[0017] S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物；

[0018] S3、采用步骤S2所述的引物进行PCR扩增，检测，结果判定。

[0019] 优选的，性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区。

[0020] 优选的，步骤S2中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

[0021] 优选的，步骤S3中，以番木瓜DNA为模板进行PCR扩增。

[0022] 优选的，检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测，结果判定方法为：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性。

[0023] 优选的，检测方法为试纸检测，结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。

[0024] 优选的，步骤S3中，不进行番木瓜DNA提取，直接将番木瓜叶片加入到PCR反应体系进行反应。

[0025] 优选的，步骤S2中，所述引物用于LAMP检测，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：13所示。

[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0027] 本发明提供单一DNA分子标记Sex79，针对Sex79设计一对引物，直接利用该引物对即可进行番木瓜性别鉴定，并且可以在不提取DNA的情况下直接进行PCR然后电泳检测，还可以通过试纸条直接检测，操作简单，节省成本，快速高效。

[0028] 本发明还根据性别决定分子标记Sex79设计LAMP检测引物，结合LAMP(环介导等温扩增反应)技术实现田间批量检测。

附图说明

[0029] 图1：本发明实施例1的测试结果图，图中，M为DNA分子标记，圆环“◎”为两性番木瓜参考DNA；“♂”代表雄性番木瓜参考DNA，“♀”代表雌性番木瓜参考DNA；“F2”代表测试样品。

[0030] 图2：本发明实施例2的测试结果图。

[0031] 图3：本发明实施例3所得扩增曲线图。

[0032] 图4：本发明实施例4的试纸检测结果图。

具体实施方式

[0033] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

[0034] 实施例1

[0035] 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

[0036] S1、获得DNA分子标记：通过AFLP方法在300多个番木瓜杂交群体中通过筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

[0037] S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物，上游引物Sex79F:GAACAGACTAGCCAAGCA(SEQ ID NO:2)，下游引物Sex79R:AGAACCACTGACTCCACC(SEQ ID NO:2)；

[0038] S3、以番木瓜DNA为模板，采用步骤S2所述的引物进行PCR扩增，退火温度58℃，扩增时间30秒，35个循环，PCR结束后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；

[0039] S4：结果判定：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性。

[0040] 本实施例中采用多个样品进行检测，验证引物的可靠性以及在Sex79的性别决定能力，结果见图1。结果显示，PCR扩增结果特异性好，雄性和两性株可以扩增出特异性条带，雌性株未扩增出特异性条带，本方法能够明显区别测试样品中的雌性和雄性、两性株。

[0041] 实施例2

[0042] 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

[0043] S1、获得DNA分子标记：通过AFLP方法在300多个番木瓜杂交群体中通过筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

[0044] S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物，上游引物Sex79F:GAACAGACTAGCCAAGCA(SEQ ID NO:2)，下游引物Sex79R:AGAACCACTGACTCCACC(SEQ ID NO:2)；

[0045] S3、利用番木瓜叶片，不进行DNA提取，直接加入PCR反应体系进行PCR扩增，PCR结束后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；

[0046] S4：结果判定：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性。

[0047] 本实施例通过对5000多份测试样品进行验证，测试效果的准确率为98％。部分样品的电泳结果见图2。

[0048] 实施例3

[0049] 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

[0050] S1、获得DNA分子标记：通过AFLP方法在300多个番木瓜杂交群体中通过筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

[0051] S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计LAMP检测引物，引物序列如下：

[0052]

[0053]

[0054] 采用标准LAMP反应程序获得扩增曲线，结果见图3。结果显示，雄性和两性株菌可以得到S型曲线，雌性株未得到S型曲线。

[0055] 实施例4

[0056] 实施例4与实施例2的区别在于，通过FAM标记引物，Sex79FFam:FAM-GAACAGACTAGCCAAGCA；Sex79R:AGAACCACTGACTCCACCPCR。扩增后直接使用试纸条检测。结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。结果见图4。结果表明，通过试纸条检测，可以明显区分出雌性株和雄性株和两性株。

[0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。