一种防龋抗菌的噻唑类化合物及其制备方法

摘要

本发明提供一种防龋抗菌的噻唑类化合物及其制备方法，该咪唑类化合物具有式(I)所示结构：该化合物分子量小、结构相对简单，抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够显著抑制变链菌生物膜的形成，降低变链菌成熟生物膜的生长活力，并且抑制变链菌的产酸，有望开发成为有效防治龋病的药物。

权利要求

1.式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

2.一种制备式(I)化合物的方法，所述方法包括：(1)2-氨基-5-硝基噻唑与3-(Boc-氨基)苯甲酸为起始反应物制备(3-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯，记为中间体1；(2)中间体1经脱Boc反应后得到3-氨基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺盐酸盐，记为中间体2；(3)中间体2与对氯苯磺酰氯反应生成式(I)化合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应需在溶剂、缩合剂和活化剂的存在下进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，2-氨基-5-硝基噻唑、3-(Boc-氨基)苯甲酸、缩合剂、活化剂的摩尔比为1：1.2-1.7：1.5-2：1.5-3.0。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，2-氨基-5-硝基噻唑、3-(Boc-氨基)苯甲酸、缩合剂、活化剂的摩尔比为1：1.2：2：2。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应温度为0-60℃。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应温度为30℃。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自无水N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种或多种。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂的用量为10～15mL每毫摩尔的2-氨基-5-硝基噻唑。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缩合剂选自DCC、DIC、EDCI、HATU、HBTU、HCTU、TBTU、TSTU、TNTU、PyBOP中的一种或多种。

11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化剂选自DMAP、HOBt、4-PPY、HOAT、HOSu、NHPI、NHNI、PFPOH中的一种或多种。

12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述脱Boc反应在酸性溶液中于室温下进行，所述酸性溶液选自HCl/乙酸乙酯溶液、HCl/甲醇溶液、三氟乙酸中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液用量为15-20mL每毫摩尔的中间体1。

14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)在缚酸剂的存在下进行，所述缚酸剂为无机碱。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种。

16.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，中间体2溶解于溶剂中参与反应，所述溶剂为溶剂/水体系，该体系选自二氧六环/水溶液、四氢呋喃/水溶液、丙酮/水溶液中的一种或多种。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述溶剂/水体系中，溶剂与水的体积比为1：1-3。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述溶剂/水体系的用量为8-12mL每毫摩尔的中间体2。

19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，中间体2、缚酸剂与对氯苯磺酰氯的摩尔比为1：2-4：1-1.2。

20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，中间体2、缚酸剂与对氯苯磺酰氯的摩尔比为1：3：1.2。

21.组合物，其包含权利要求1所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述组合物可以包含药学上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。

23.药物制剂、化妆品或清洁用品，其包含权利要求1所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上或化妆品上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。

24.根据权利要求23所述的药物制剂、化妆品或清洁用品，其特征在于，所述药物制剂为固体制剂、外用制剂、喷剂或液体制剂。

25.根据权利要求23所述的药物制剂、化妆品或清洁用品，其特征在于，所述化妆品或清洁用品为牙膏、漱口水或消毒液。

26.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备用于抑制和/或杀伤口腔细菌的浮游细胞的药物、化妆品或清洁用品中的应用，式(I)化合物结构式为：

27.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备用于抑制变链菌引起的生物膜形成的药物、化妆品或清洁用品中的应用或制备用于清除变链菌引起的生物膜的药物、化妆品或清洁用品中的应用，式(I)化合物结构式为：

28.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备口腔变链菌生物膜抑制剂或制备抵抗龋病药物制剂中的应用，式(I)化合物结构式为：

说明书

一种防龋抗菌的噻唑类化合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种防龋抗菌的噻唑类化合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 龋病是口腔常见的发生在牙体硬组织的慢性感染性疾病，通过一系列细菌生物被膜聚集，代谢产酸，牙体组织局部脱矿等过程，最终发生牙体组织的缺损。变形链球菌(简称变链菌)是现今公认的主要致龋菌，它在物理吸附的基础上，通过表面毒力因子(如产酸耐酸、体外黏附、合成细胞外多糖)对牙齿表面产生粘附作用，最终不断聚集形成致龋生物被膜。由于生物被膜组织内部为细菌生长提供了一个相对稳定的生存内环境，抗菌药物只有穿透过生物被膜，才能对生长于其中的致龋菌产生作用。如果仅有抗菌作用而对生物被膜不产生抑制作用，则很难维持长效和有效的抗菌作用，也因此非常容易产生细菌耐药。鉴于此，对生物被膜的抑制作用研究一直是抗感染类疾病的研究热点，而对变异链球菌致龋生物被膜的作用研究，在龋病预防中具有特别重要的意义和研究价值。

[0003] 牙菌斑就是一种典型的生物被膜状态，从浮游的生长状态到生物被膜结构的形成，细菌经历了初期粘附、生物被膜粘附期、生长期、成熟期和播散期等几个阶段。在生物被膜形成过程中，生长于其中的细菌生物学特性改变，毒力大大增加，对外界环境和宿主免疫防御也具有更强的抵抗力，能达到浮游细菌的10-1000倍，也更加容易对抗菌药物产生耐药。

[0004] 基于这些事实，寻找能够抑制口腔致病菌、抑制与致龋性相关的特定毒力因子的新型化合物将在龋病预防中有重要意义。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足与需求，本发明的目的在于提供一种可以用于防治龋病的新型噻唑类化合物及其制备方法和应用。

[0006] 具体地，本发明是通过如下技术方案实现的：

[0007] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种式(I)所示化合物：

[0008]

[0009] 式(I)化合物的化学分子式为C16H11ClN4O5S2，中文名称为3-((4-氯苯基)磺酰氨基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺,英文名称为3-((4-chlorophenyl)sulfonamido)-N-(5-nitrothiazol-2-yl)benzamide，分子量为438.86。式(I)化合物溶于二甲基亚砜，难溶于水。

[0010] 本发明包括式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或前药。本发明还包括式(I)所示化合物的溶剂合物。此外，本发明还包括式(I)化合物的各种晶型。

[0011] 本发明提供了式(I)化合物的药学上可接受的盐。本发明所述的“药学上可接受的盐”的例子包括无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和抗坏血酸盐；无机碱盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐、镁盐和铝盐；以及有机碱盐，例如精氨酸盐、苄星盐、胆碱盐、二乙胺盐、二醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐和氨基丁三醇盐。

[0012] 本发明所述的“式(I)的化合物的前药”是指在体内的生理条件下，可以与酶、胃酸等反应，从而转化成式(I)的化合物；例如，通过酶的氧化、还原、水解等，转化成式(I)的化合物；以及通过使用胃酸的水解，转化成式(I)的化合物等。

[0013] 式(I)的化合物可以以互变异构体的形式存在。因此，本发明还包括式(I)的化合物的互变异构体。

[0014] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备式(I)化合物的方法，所述方法包括：(1)2-氨基-5-硝基噻唑与3-(Boc-氨基)苯甲酸为起始反应物制备(3-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(中间体1)；(2)中间体1经脱Boc反应后得到3-氨基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺盐酸盐(中间体2)；(3)中间体2与对氯苯磺酰氯反应生成式(I)化合物。

[0015] 所述方法涉及以下反应路线：

[0016]

[0017] 优选地，步骤(1)的反应需在溶剂、缩合剂和活性剂的存在下进行。

[0018] 优选地，步骤(1)中，2-氨基-5-硝基噻唑、3-(Boc-氨基)苯甲酸、缩合剂、活化剂的摩尔比为1：1.2-1.7：1.5-2：1.5-3.0，优选1：1.2：2：2。

[0019] 优选地，步骤(1)的反应温度为0-60℃，优选30℃。

[0020] 优选地，所述溶剂选自无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种或多种；优选无水二氯甲烷和DMF。

[0021] 优选地，所述溶剂的用量为10～15mL每毫摩尔的2-氨基-5-硝基噻唑。

[0022] 优选地，所述缩合剂选自二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐(HCTU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐(TBTU)、O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐(TSTU)、O-(N-endo-5-降莰烯-2,3-二碳二酰亚胺)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐(TNTU)、苯并三氮唑-1-基氧-三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐(PyBOP)中的一种或多种；优选为EDCI和/或HATU。

[0023] 优选地，所述活化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、4-吡咯烷基吡啶(4-PPY)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHPI)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHNI)、五氟苯酚(PFPOH)中的一种或多种；优选为DMAP。

[0024] 优选地，步骤(2)所述脱Boc反应在酸性溶液中于室温下进行，所述酸性溶液选自HCl/乙酸乙酯溶液、HCl/甲醇溶液、三氟乙酸中的一种或多种；优选为HCl/乙酸乙酯溶液。

[0025] 优选地，所述酸性溶液用量为15-20mL每毫摩尔的中间体1。

[0026] 优选地，步骤(3)在缚酸剂的存在下进行，所述缚酸剂为无机碱。

[0027] 优选地，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种，优选为碳酸钾。

[0028] 优选地，步骤(3)中，中间体2溶解于溶剂中参与反应，所述溶剂为溶剂/水体系，该体系选自二氧六环/水溶液、四氢呋喃/水溶液、丙酮/水溶液中的一种或多种；优选为二氧六环/水溶液。

[0029] 优选地，所述溶剂/水体系中，溶剂与水的体积比为1：1-3。

[0030] 优选地，所述溶剂/水体系的用量为8-12mL每毫摩尔的中间体2。

[0031] 优选地，步骤(3)中，中间体2、缚酸剂与对氯苯磺酰氯的摩尔比为1：2-4：1-1.2，优选1：3：1.2。

[0032] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物，其包含式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐。所述包含可以理解为式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐作为组合物中的成分起辅助作用或者作为主要活性成分起主要作用。

[0033] 优选地，所述组合物可以包含药学上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。

[0034] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂、化妆品或清洁用品，其包含式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐和一种或多种药学上或化妆品上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。

[0035] 优选地，所述药物制剂为固体制剂、外用制剂、喷剂或液体制剂。

[0036] 优选地，所述化妆品或清洁用品为牙膏、漱口水或消毒液。

[0037] 本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。

[0038] 本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是1wt％-98wt％，通常大约占到80wt％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。

[0039] 口服片剂和胶囊可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，阿拉伯胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。

[0040] 口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，阿拉伯树胶；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。

[0041] 此外，固体制剂也可以制成如牙膏、固体漱口水、口香糖、含片、口腔贴片等；外用喷剂或液体制剂也可以制成如漱口水、洗剂等。

[0042] 在本发明的第五方面，本发明还提供了式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备用于抑制和/或杀伤口腔细菌浮游细胞的药物、化妆品或清洁用品中的应用，或用于制备抑制和/或杀伤口腔致龋细菌的药物、食品、化妆品或清洁用品中的应用。

[0043] 本发明的化合物对口腔细菌具有广谱的抑菌和杀菌活性。尤其是对粘性放线菌、变链菌和血链球菌的最小抑菌浓度低至0.25～2μg/mL，最小杀菌浓度低至0.5～4μg/mL。优选地，所述口腔细菌选自粘性放线菌、变链菌和血链球菌。

[0044] 在本发明的第六方面，本发明还提供了式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备用于抑制变链菌引起的生物膜形成的药物、化妆品或清洁用品中的应用或制备用于清除变链菌引起的生物膜的药物、化妆品或清洁用品中的应用。

[0045] 本发明化合物的MBIC值在2μg/mL，其对变链菌生物被膜的抑制率为100％。其MBEC50值在16μg/mL，其对已形成的变链菌生物被膜减少至少50％，有效降低变链菌成熟生物被膜的生长活力。

[0046] 在本发明的第七方面，本发明还提供了式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备口腔变链菌生物膜抑制剂中的应用。

[0047] 以及，在本发明的第八方面，本发明提供了上述化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐或以其为活性成分的药物组合物在制备抵抗龋病药物制剂中的应用。

[0048] 本发明测定了式(I)化合物对口腔致龋菌的抑制效果。测试时用DMSO将式(I)化合物溶解，配成终浓度为1024mg/mL的母液贮存。

[0049] 测试结果显示，本发明的对口腔细菌具有广谱的抑菌和杀菌活性。尤其是对粘性放线菌、变链菌和血链球菌的最小抑菌浓度低至0.25～2μg/mL，最小杀菌浓度低至0.5～4μg/mL。本发明化合物的MBIC值在2μg/mL，其对变链菌生物被膜的抑制率为100％。本发明化合物的MBEC50值在16μg/mL，其对已形成的变链菌生物被膜减少至少50％，有效降低变链菌成熟生物被膜的生长活力。本发明的化合物在MIC(2μg/mL)和1/2MIC(1μg/mL)下对变链菌的产酸有显著的抑制作用。此外，该化合物对口腔正常细菌无影响，能选择性作用与生物被膜中的致龋菌。

[0050] 本发明具有以下有益效果：

[0051] 本发明的化合物分子量小、结构相对简单，抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够显著抑制变链菌生物膜的形成，降低变链菌成熟生物膜的生长活力，并且抑制变链菌的产酸，有望开发成为防治龋病的药物。

附图说明

[0052] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0053] 图1示出了本发明化合物对变链菌产酸能力的影响。

具体实施方式

[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0055] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0056] 实施例1式(I)化合物的制备

[0057] 合成路线为：

[0058]

[0059] 合成路线中所用的试剂和反应条件：(a)EDCI，DMAP，无水N,N-二甲基甲酰胺，室温；(b)HCl/乙酸乙酯饱和溶液，室温，15min；(c)碳酸钾，二氧六环/水(V:V＝1:1)，室温，30min。

[0060] 具体制备过程包括如下步骤：

[0061] (1)(3-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(中间体1)的制备[0062] 将2-氨基-5-硝基噻唑(1mmol)和3-(Boc-氨基)苯甲酸(1.2mmol)溶解于12mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，再分别加入EDCI(2mmol)和DMAP(2mmol)，在常温下反应12h，向反应液中加30mL的乙酸乙酯稀释，用1mol/L的HCl水溶液洗2次(2×30mL)，饱和碳酸氢钠溶液洗2次(1×30mL)，再用饱和食盐水洗1次(1×30mL)，将有机相用无水硫酸镁干燥，减压过滤，然后用旋转蒸发仪蒸发浓缩得到黄色固体0.94g，产率94％。

[0063] (2)3-氨基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺盐酸盐(中间体2)的制备

[0064] 将乙酰氯慢慢滴入无水乙醇中(V:V＝4:5)，生成的HCl通入乙酸乙酯中制成HCl/乙酸乙酯饱和溶液，再将上一步中间体1溶于其中，在常温下搅拌15分钟，用TLC检测反应完全，蒸干溶剂，得黄色固体，粗产品产率100％，未经处理直接进行下一步。

[0065] (3)3-((4-氯苯基)磺酰氨基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(式(I)化合物)的制备

[0066] 在室温条件下，将中间体2(1mmol)和碳酸钾(3mmol)溶解于8mL二氧六环水溶液中，再加入对氯苯磺酰氯(1.2mmol)，搅拌30min，用TLC监测反应至原料反应完全。蒸出二氧六环，向反应液中加25mL的蒸馏水，水相用乙酸乙酯萃取3次(3×25mL)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗1次(1×25mL)，无水硫酸镁干燥，减压过滤，然后经真空蒸发浓缩得粗品。粗品经硅胶色谱柱(200～300目)纯化分离，二氯甲烷：甲醇＝240：1作为洗脱剂，得到黄色固体目标产物，产率45％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ13.65(s,1H),10.74(s,1H),8.73(s,
1H),7.87(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(m,3H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.47(t,J＝7.9Hz,1H),-
7.39(d,J＝8.1,2.1Hz,1H)ppm；ESI-MS:438.0[M-H] .

[0067] 实施例2.式(I)化合物的抗菌活性实验

[0068] 1、变链菌UA159菌株(S.mutans UA159)和式(I)化合物的准备

[0069] 本发明所使用的变链菌UA159菌株为模式菌株，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的参考基因组编号为NC_004350。本发明所使用的变链菌UA246菌株为分离自患有龋齿病人的口腔当中的临床菌株。其最适的培养基优选脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2)，在37℃，厌氧培养的最适宜条件下静置培养。

[0070] (1)培养变链菌的培养基为脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(品牌OXOID，货号CM1135)，培养基主要成分为Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2。如需配置成固体，需要添加琼脂粉15g/L。115℃灭菌30min，冷却后待用。

[0071] (2)培养变链菌生物被膜的培养基为脑心浸液-蔗糖培养基，即在脑心浸液培养基中添加终浓度为1％的蔗糖。蔗糖需事先配成20％贮存液并用0.22μm的无菌滤器过滤除菌。

[0072] (3)用无菌接种环将变链菌模式菌株UA159在含有脑心浸液琼脂固体培养基的平板上进行划线，倒置于37℃的厌氧培养箱中培养直至出现明显的单菌落。

[0073] (4)用无菌的接种铲刮取变链菌UA159，分别转接到装有脑心浸液液体培养基的试管中，在37℃的厌氧培养箱中静置，培养至液体浑浊。

[0074] (5)用紫外可见分光光度计检测变链菌在600nm下的吸光度值(OD600nm)。

[0075] (6)用分析天平精确称量式(I)化合物，加入DMSO将其溶解，然后用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌，配成终浓度为1024mg/L的贮存液，存放于-20℃待用。

[0076] 2、实验方法

[0077] (1)将培养制对数期的变链菌UA159(OD600nm＝0.8～1.0)用脑心浸液培养基稀释至终浓度为5×105CFU/mL待用。

[0078] (2)采用微量肉汤稀释法检测式(I)化合物对变链菌UA159的最小抑菌浓度。即将倍比稀释后不同浓度的式(I)化合物溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔为加药液的实验组，第12孔为不加药作为生长对照组，每个孔中变链菌菌液终浓度为5×105CFU/mL，此时，第1孔至第12孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0mg/L。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度定位最小抑菌浓度(MIC)。

[0079] (3)将小孔内的菌液均匀涂布到脑心浸液琼脂固体培养基上后，在37℃厌氧培养箱中倒置培养24小时，以没有细菌生产的最低浓度定位最小杀菌浓度(MBC)，以上实验有效重复3次，实验结果如表1所示。

[0080] 按照上述方法对S.sanguis ATCC 49295(血链球菌)、A.viscosus ATCC 27044(粘性放线菌)、S.sobrinus ATCC 33478(远源链球菌)、S.salivarius ATCC 7073(唾液链球菌)和S.mitis ATCC 6249(缓症链球菌)几种菌种在相同条件下进行了测试，实验结果列于表1中。

[0081] 表1.式(I)化合物对变链菌UA159浮游细胞的活性检测(单位μg/mL)

[0082]

[0083] MIC：最小抑菌浓度；MBC：最小杀菌浓度。

[0084] 从表1可以看出，式(I)化合物对口腔致龋菌具有很好的抑菌活性和杀伤活性，与阳性对照药洗必泰的抗菌活性相当。

[0085] 实施例3.式(I)化合物对口腔正常菌的作用实验

[0086] 实验步骤同实施例2，测试了化合物对正常口腔细菌L.delbrueckiiCICC 6032、V.denticariosi KQ-ETV-9、V.rogosae WZH3n的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果如表2所示。

[0087] 表2.式(I)化合物对正常口腔细菌的抗菌、杀菌活性结果(单位μg/mL)

[0088]

[0089] 从表2可以看出，式(I)化合物对口腔正常细菌没有影响，比阳性对照药洗必泰的影响还要小。

[0090] 实施例4.式(I)化合物对变链菌生物被膜形成的抑制实验

[0091] (1)按照实施例2中描述的方法准备变链菌菌液和式(I)化合物，用脑心浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变链菌稀释至终浓度为1×107CFU/mL待用。

[0092] (2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液100μL，并以加入式(I)化合物的孔作为实验组，以不加式(I)化合物的孔作为对照组。放于37℃厌氧培养箱中静置培养24h。

[0093] (3)将每个孔中的浮游细胞移走，并用大量的水冲洗未吸附的细胞。

[0094] (4)向每个孔中加入0.1％的结晶紫溶液200μL，在室温的条件下静置5min进行染色，然后移除结晶紫溶液，并用大量水冲洗掉除去未吸附的结晶紫。

[0095] (5)向每个孔中加入33％的乙酸溶液200uL溶解吸附的结晶紫，然后使用酶标仪检测590nm下的吸光度值，以上实验有效重复3次。计算生物被膜的抑制率，计算公式为抑制率＝(1-实验组/生长对照组)×100％。

[0096] 结果显示式(I)化合物的MBIC值为2μg/mL，对变链菌生物被膜的抑制率为100％。

[0097] 实施例5.式(I)化合物对清除变链菌成熟生物被膜作用实验

[0098] (1)按照实施例2中描述的方法准备变链菌菌液和式(I)化合物，用脑心浸液-蔗糖7
培养基将处于对数期的变链菌稀释至终浓度为1×10CFU/mL待用。

[0099] (2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液100μL，37℃厌氧培养24h使变链菌形成生物被膜。

[0100] (3)形成生物被膜后，弃上清，加入150～200μL的0.85％的NaCl后放置2～3min，弃废液，重复3次。

[0101] (4)弃废液后，第二孔到最后一孔依次加入100uL的新鲜BHI培养基，第一孔加入相应浓度的式(I)化合物200μL(256μg/mL)，第一孔混匀后，从第一孔取100μL加入第二孔，依次加入到倒数第二孔，最后一孔不加，37℃厌氧培养箱培养24h。

[0102] (5)重复操作步骤(3)。

[0103] (6)每孔加入90μL的新鲜BHI培养基，每孔加入10μL MTT(浓度5mg/mL)，用锡箔纸包好，37℃避光孵育2～4h。

[0104] (7)弃上清，用0.85％NaCl洗涤3次后，加入200μL DMSO，在37℃培养箱孵育10～15min，取50μL加入到150μL DMSO中，用酶标仪测定其在490nm处的吸光值，以上实验有效重复3次。

[0105] 结果显示式(I)化合物的MBEC50值为16μg/mL，其对已形成的变链菌生物被膜减少至少50％，显著降低变链菌成熟生物被膜的生长活力。

[0106] 实施例6.式(I)化合物对变链菌产酸能力的抑制实验

[0107] (1)按照实施例2中描述的方法准备变链菌菌液和式(I)化合物，用脑心浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变链菌稀释至终浓度为5×105CFU/mL待用。

[0108] (2)根据式(I)化合物对变链菌的MIC测定结果，加入MIC值以下的2个浓度(1和1/2MIC)，对照组为不含式(I)化合物的培养基，每组一式3份。

[0109] (3)放于37℃厌氧培养箱中静置培养0，6，12，24h，吸取上清液，采用精密pH计监测下降，结果取平均值，实验结果如图1所示。

[0110] 从图1可以看出，与不加式(I)化合物的对照相比，式(I)化合物在MIC(2μg/mL)和1/2MIC(1μg/mL)下对变链菌的产酸有显著的抑制作用。