一种检测卡那霉素的电化学生物传感器及其应用

摘要

本发明涉及一种基于核酸适配体检测卡那霉素的生物传感器，属于电化学生物传感器技术领域。利用具有识别切割功能的Nt.BbvCI内切酶，实现了primer的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；利用了核酸外切酶III的特异性的识别和水解作用实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度。本发明的电化学生物传感器可以高特异性检测；该传感器的反应条件温和，反应速度快；作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求，适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。

权利要求

1.一种检测卡那霉素的电化学生物传感器，其特征在于，包括：适配体Aptamer、引物Primer、发卡引物HAP1、发卡引物HAP2、发卡引物HAP3、血红素、PBS缓冲液、过氧化氢H2O2、Nt.BbvCI内切酶、外切酶III、修饰捕获探针CP的金电极；

所述的PBS缓冲液含有K+；

适配体Aptamer的序列如SEQ No.1所示；

引物Primer的序列如SEQ No.2所示；

发卡引物HAP1的序列如SEQ No.3所示；

发卡引物HAP2的序列如SEQ No.4所示；

发卡引物HAP3的序列如SEQ No.5所示；

捕获探针CP的序列如SEQ No.6；

捕获探针CP序列的5’端修饰-SH；

所述的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将适配体Aptamer与引物Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe；

（2）将探针Probe、发卡引物HAP1、发卡引物HAP2、发卡引物HAP3、Nt.BbvCI内切酶、外切酶III、10×Nt.BbvCI内切酶和外切酶III缓冲液、卡那霉素溶液混合后恒温孵育；

（3）将步骤（2）中的混合溶液滴加到修饰捕获探针CP的金电极上，然后恒温孵育；

（4）将血红素溶液滴加到步骤（3）所得的金电极中，然后恒温孵育；

（5）用PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中处理后的电极；

（6）向PBS缓冲液中加入H2O2，混合均匀，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电信号变化；

（7）根据卡那霉素标准溶液的电信号作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测液电信号计算待测液中卡那霉素的浓度。

2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述的修饰捕获探针CP的金电极，采用以下方法制备获得：a）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用超纯水反复冲洗；

b）将捕获探针CP溶液滴在上述处理后的金电极表面，保温孵育。

3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述发卡引物HAP1浓度为1-

20 μM；所述发卡引物HAP2浓度为1-20 μM；所述发卡引物HAP3浓度为1-20 μM；所述捕获探针CP的浓度为1-20 μM。

4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述适配体Aptamer的终浓度为1µM；所述引物Primer的终浓度为1µM；所述血红素的终浓度为10µM；所述H2O2的终浓度为10μM；所述Nt.BbvCI内切酶和外切酶III的浓度为500U/mL。

5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤（1）具体工艺为：将14 μL 灭菌水，2 μL 5×PBS，2 μL 10 μM 适配体Aptamer链和2 μL 10 μM 引物Primer链混匀，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用。

6.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤（2）中恒温孵育温度为

37℃。

7.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤（6）中测量电信号变化的参数为：电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 V/s。

8.权利要求1所述的电化学生物传感器用于在食品安全分析和环境监测方面来检测卡那霉素。

说明书

一种检测卡那霉素的电化学生物传感器及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于核酸适配体检测卡那霉素的生物传感器，具体涉及一种基于目标诱导的核酸适配体构象变化及Nt.BbvCI内切酶和核酸外切酶III辅助循环放大检测卡那霉素的电化学生物传感器，属于电化学生物传感器技术领域。

背景技术

[0002] 抗生素具有杀死和摧毁微生物细胞结构的功能，在世界范围内被广泛的应用于各种抗菌药物的制备，但与此同时，抗生素的滥用导致的残留问题已经成为世界范围内急需解决的难题。抗生素的过量使用，可以刺激感染引起的细菌变得耐药性。

[0003] 卡那霉素（Kanamycin）是一种蛋白生物合成抑制剂，是一种抗生素，口服用于治疗敏感菌所致的肠道感染及用作肠道手术前准备，并有减少肠道细菌产生氨的作用，对肝硬化消化道出血病人的肝昏迷有一定防止作用。肌注用于敏感菌所致的系统感染，如肺炎、败血症、尿路感染等。

[0004] 目前报道的检测卡那霉素的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光等方法。这些方法有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，建立一个操作简便、灵敏的高特异性的方法，在食品安全分析和环境监测方面来检测卡那霉素及其残留是至关重要的。

发明内容

[0005] 为了解决以上现有技术中检测卡那霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种操作简便、特异性和灵敏度高、成本低的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化以及Nt.BbvCI内切酶和外切酶III辅助循环放大检测卡那霉素的电化学生物传感器。本发明另一目的在于提供一种上述电化学生物传感器的制备方法和在检测卡那霉素中的应用。

[0006] 一种检测卡那霉素的电化学生物传感器，包括：适配体Aptamer、引物Primer、发卡引物HAP1、发卡引物HAP2、发卡引物HAP3、血红素、PBS缓冲液、过氧化氢H2O2、Nt.BbvCI内切酶、外切酶III、修饰捕获探针CP的金电极；

[0007] 所述的PBS缓冲液含有K+；

[0008] 所述Aptamer的序列如SEQ No.1所示；

[0009] Primer的序列如SEQ No.2所示；

[0010] HAP1的序列如SEQ No.3所示；

[0011] HAP2的序列如SEQ No.4所示；

[0012] HAP3的序列如SEQ No.5所示；

[0013] CP的序列如SEQ No.6所示；

[0014] 所述的捕获探针CP序列的5’端修饰-SH。

[0015] 所述的修饰捕获探针CP的金电极，采用以下方法制备获得：

[0016] a）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用超纯水反复冲洗；

[0017] b）将CP溶液滴在上述处理后的金电极表面，保温孵育。

[0018] 所述HAP1浓度为1-20 μM；所述HAP2浓度为1-20 μM；所述HAP3浓度为1-20 μM；所述CP的浓度为1-20 μM。

[0019] 所述Aptamer优选的终浓度为1µM；所述Primer优选的终浓度为1µM；所述血红素优选的终浓度为10µM；所述H2O2优选的终浓度为10μM；所述Nt.BbvCI内切酶和外切酶III优选的浓度为500U/mL。

[0020] 一种上述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0021] （1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe；

[0022] （2）将探针Probe、HAP1、HAP2、HAP3、Nt.BbvCI内切酶、外切酶III、10×Nt.BbvCI内切酶和外切酶III缓冲液、卡那霉素溶液混合后恒温孵育；

[0023] （3）将步骤（2）中的混合溶液滴加到修饰捕获探针CP的金电极上，然后恒温孵育；

[0024] （4）将血红素溶液滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后恒温孵育；

[0025] （5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极；

[0026] （6）向PBS缓冲液中加入H2O2，混合均匀，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电信号变化；

[0027] （7）根据卡那霉素标准溶液的电信号作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测液电信号计算待测液中卡那霉素的浓度。

[0028] 所述步骤（1）具体工艺为：将14 μL 灭菌水，2 μL 5×PBS，2 μL 10 μM Aptamer链和2 μL 10 μM Primer链混匀，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，储存于-20 ℃下备用。

[0029] 所述步骤（2）中恒温孵育温度为37℃。

[0030] 所述步骤（6）中测量电信号变化的参数为：电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。

[0031] 上述电化学生物传感器用于在食品安全分析和环境监测方面来检测卡那霉素。

[0032] 上述电化学生物传感器的工作原理如下：

[0033] Aptamer：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGAC-3’

[0034] Primer：5-GGCTTAGCTGAGGACCCCCAAAAA-3

[0035] HAP1: 5-ATCACAACGGTCCTCAGCTAGTGATAAA-3

[0036] HAP2：5- ACTAACCTCGTAGGGCGGGATGGGTACGAGGTTAGTCCGTTGTGAT-3

[0037] HAP3: 5-GGGTAGGATCGAACAATCCTACCCATCACTAGCTGA -3

[0038] 捕获探针（CP）：5-TGTTCGATCCTAAAATACGAGGTTAGTAAA-SH-3

[0039] Aptamer能够与Primer通过部分碱基配对结合成拱形探针（Probe）。如图所示，当目标物卡那霉素存在时，卡那霉素与适配体结合从而将引物（Primer）释放下来。随后引物打开发夹1（HAP1），在Nt.BbvCI内切酶的作用下，将HAP1切断并释放下引物2（P2）和引物3（P3），实现了Primer的循环从而可以继续打开剩余的HAP1。释放下来的P2和P3可以各自通过碱基互补配对与发夹2（HAP2）和发夹3（HAP3）结合。核酸外切酶III能够催化单个核苷酸从3’平末端逐步地水解。在核酸外切酶III的作用下，可以将HAP2和HAP3自3’端水解至与P2、P3杂交的末端，使得经消化后的发夹3’端为平末端，此时核酸外切酶III可以继续作用于发夹的杂交部分，产生trigger1和trigger2并释放下P2和P3，使得P2和P3可以循环作用于HAP2和HAP3，产生大量的trigger1和trigger2。另外在金电极上修饰一段可以捕获trigger1和trigger2的捕获探针，trigger1的3’末端和trigger2的5’末端分别是含有9个和3个鸟嘌呤的序列，在K+和血红素存在的条件下，可以形成G-四联体/血红素复合物，具有辣根过氧化物酶的作用，从而催化H2O2分解产生电化学信号。在一定范围内，通过测量电化学信号来间接定量检测卡那霉素。

[0040] 本发明具有以下优点：

[0041] 1、灵敏度高

[0042] 本发明的电化学生物传感器利用了适配体与卡那霉素的特异性识别，实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；利用具有识别切割功能的Nt.BbvCI内切酶，实现了primer的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；利用了核酸外切酶III的特异性的识别和水解作用实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度。

[0043] 2、反应条件温和、速度快

[0044] 该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。

[0045] 3、探针制备方法简单，适合产业化

[0046] 本申请的制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

[0047] 图1为本电化学生物传感器的工作原理示意图；

[0048] 图2为修饰不同浓度CP的金电极测定的电信号曲线图；

[0049] 图3为不同浓度HAP1测定的电信号曲线图；

[0050] 图4为不同浓度HAP2测定的电信号曲线图

[0051] 图5为系列卡那霉素标准溶液的电信号图；

[0052] 图6为测定卡那霉素的标准曲线。

具体实施方式

[0053] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

[0054] 实施例中，两种酶的缓冲液为CutSmart，50 mM KAc, 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 100 μg/ml BSA（pH 7.9 @ 25℃）。

[0055] PBS缓冲液含Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM)，NaCl (140 mM)，KCl (1 mM)，MgCl2 (1 mM)，CaCl2 (1 mM)，pH值为7.4。

[0056] 实施例1 修饰CP的金电极的制备。

[0057] a）金电极抛光处理：将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，超纯水反复冲洗5次；

[0058] b）将10 μL CP溶液（终浓度为1 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）滴在上述处理后的金电极表面，37 ℃恒温孵育2h，得修饰CP的金电极S1-S6。

[0059] 实施例2 不同CP浓度对检测卡那霉素的影响。

[0060] （1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe（10 μM）；

[0061] （2）将探针Probe、10 μM HAP1、10 μM HAP2、10 μM HAP3、1U/μL Nt.BbvCI内切酶和1U/μL外切酶III，10×cutsmart缓冲液、5nM卡那霉素标准溶液混合后恒温孵育；

[0062] （3）将步骤（2）中的混合溶液滴加到修饰不同浓度CP的金电极S1-S6上，然后37 ℃恒温孵育2h；

[0063] （4）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 ℃恒温孵育1h；

[0064] （5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；

[0065] （6）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。

[0066] 以CP浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度CP的金电极测定的电信号曲线图，如图2所示。由图2可知，检测到的电流信号随着CP的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。

[0067] 实施例3 不同HAP1浓度对检测卡那霉素的影响。

[0068] （1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe（10 μM）；

[0069] （2）将步骤（1）中的探针、HAP1（终浓度为1 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）、10 μM HAP2、10 μM HAP3、1U/μL Nt.BbvCI内切酶和1U/μL外切酶III，10×cutsmart缓冲液、5nM卡那霉素标准溶液混合后在37℃恒温孵育；

[0070] （3）将步骤（2）中的混合溶液滴加到修饰CP的金电极S4上，然后37 ℃恒温孵育2h；

[0071] （4）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的电极上，然后37 ℃恒温孵育1h；

[0072] （5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；

[0073] （6）在含H2O（2 10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。

[0074] 以HAP1浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作均相中含有不同浓度HAP1测定的电信号曲线图，如图3所示。由图3可知，检测到的电流信号随着HAP1的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。

[0075] 实施例4 不同HAP2浓度对检测卡那霉素的影响。

[0076] （1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（10 μM）；

[0077] （2）将步骤（1）中的探针、10 μM HAP1、HAP2（终浓度为1 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）、10 μM HAP3、1U/μL Nt.BbvCI内切酶和1U/μL外切酶III，10×cutsmart缓冲液、5nM卡那霉素标准溶液混合后在37℃恒温孵育；

[0078] （3）将步骤（2）中的混合溶液滴加到修饰CP的金电极S4上，然后37 ℃恒温孵育2h；

[0079] （4）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的电极上，然后37 ℃恒温孵育1h；

[0080] （5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；

[0081] （6）在含H2O（2 10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。

[0082] 以HAP2浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作均相中含有不同浓度HAP2测定的电信号曲线图，如图3所示。由图3可知，检测到的电流信号随着HAP2的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。

[0083] 实施例5 对卡那霉素的检测

[0084] （1）将Aptamer（10 μM）与Primer（10 μM）在PBS缓冲液中杂交成Probe（10 μM）；

[0085] （2）将步骤（1）中的探针、HAP1（10 μM）、HAP2（10 μM）、HAP3（10 μM）、1U/μL Nt.BbvCI内切酶和1U/μL外切酶III，10×cutsmart缓冲液、卡那霉素溶液（终浓度为1、5、10、100、500、1000、5000、10000 pM）或待测液混合后37 ℃恒温孵育2h；

[0086] （3）将步骤（2）中的混合溶液与λ-核酸外切酶一同滴加到修饰HAP2的金电极S4上，然后37 ℃恒温孵育2h；

[0087] （4）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后37 ℃恒温孵育1h；

[0088] （5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；

[0089] （6）在含H2O（2 10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s；

[0090] （7）根据卡那霉素标准溶液的电信号作标准曲线，如图5所示，计算回归方程为I (10-6A) = 0.38524 + 0.43326 lg(C/pM)，相关系数为0.99402；当电信号I (10-6A) =1时，根据回归方程计算待测液中卡那霉素的浓度为26pM。

[0091] 同时，我们在1 pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于1 pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为0.87 pM。