一种治疗AGS的药物作用靶点

摘要

本发明公开了以组蛋白去乙酰化酶作为药物作用靶点的药物在制备治疗AGS药物中的应用。以组蛋白去乙酰化酶作为药物作用靶点的药物是组蛋白去乙酰化酶表达与功能的抑制剂。组蛋白去乙酰化酶表达与功能的抑制剂包括RGFP966和RGFP109。通过抑制cGAS表达和STING‑TBK1‑IRF3通路活性，从而达到治疗Aicardi‑Goutières综合征的目的。

权利要求

1.组蛋白去乙酰化酶表达与功能的抑制剂RGFP966和RGFP109在制备治疗Aicardi-Goutieres综合征的药物中的应用，其中RGFP966的结构式为:

RGFP109的结构式为

说明书

一种治疗AGS的药物作用靶点

技术领域

[0001] 本发明涉及一种治疗AGS的药物作用靶点，属于生物医药领域。

背景技术

[0002] Aicardi-Goutières综合征(AGS)是一组罕见的以神经系统及皮肤受累为主的遗传性疾病，主要临床特征包括颅内多发钙化灶、脑白质病变、脑脊液(CSF)慢性淋巴细胞增多症和冻疮样皮损。至今已发现7个AGS致病基因，包括TREX1、RNASEH2B、RNASEH2C、RNASEH2A、SAMHD1、ADAR1和IFIH1基因。这些基因缺陷，导致核酸酶活性降低或丧失，胞浆内核酸堆积，被STING、RIG1、MDA5或DAI识别感应，促使STING-TBK1-IRFs、IPS1-TRAF3-TBK1-IRFs/NF-кB或TRIF-TRAF3-IRFs等信号通路过度活化，最终导致Ⅰ型IFN水平显著增加。IFIH1基因获得性功能突变，导致MDA5对RNA的识别及感应能力增强，亦可导致Ⅰ型IFN产生增多。Ⅰ型IFN通过作用于IFN异二聚体受体(IFNAR1和IFNAR2)，促使酪氨酸激酶家族成员TYK2和JAK1磷酸化，活化信号转导及转录激活因子STATs，最终导致IFN刺激相关基因转录增加。Ⅰ型IFN可通过作用于外周血树突状细胞(pDCs)激活TLR途径，导致产生Ⅰ型IFN，发挥自我强化作用；Ⅰ型IFN还可促进自身反应性CD4+T细胞和CD8+T细胞活化、自身反应性B细胞分化为浆细胞并产生自身抗体，进而导致系统性自身免疫损害。AGS动物模型研究显示，pDCs和小胶质细胞是病理性Ⅰ型IFN分泌的主要来源

[0003] STING-TBK1-IRFs信号通路在Aicardi-Goutières综合征中的重要作用提示其可作为潜在的治疗靶点。敲除胞内DNA识别受体cGAS可有效抑制由TREX1缺失导致的自身免疫炎症，显著改善Aicardi-Goutières综合征模型小鼠的疾病症状并延长其寿命。

[0004] 目前，主要有以下治疗方式：

[0005] 1)静脉注射丙种球蛋白(IVIG)和(或)糖皮质激素：IVIG和糖皮质激素为经验性治疗常用药物，单用或联合使用可不同程度改善神经系统症状、减轻自身炎症或自身免疫表现，但其确切疗效尚不清楚。

[0006] 2)抗白细胞介素(IL)-6受体(托珠单抗)SAMHD1纯合突变还可导致颅内大动脉多灶性狭窄-动脉瘤-脑基底异常血管网-慢性缺血和早发性中风综合征。托珠单抗可有效缓解脑血管病变，改善实验室异常指标，减少激素剂量。但目前仅限于SAMS临床病例报道。

[0007] 3)抗IFN-α抗体AGS由于基因缺陷导致Ⅰ型IFN信号途径过度活化，体外试验显示抗IFN-α抗体可阻止Ⅰ型IFN相关基因过度表达，目前抗IFN-α单克隆抗体用于治疗系统性红斑狼疮正处于Ⅱ期临床试验阶段。

发明内容

[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种治疗AGS的药物作用靶点。

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

[0010] 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类通过去除组蛋白及其它蛋白的乙酰化修饰位点上的乙酰基团的酶，在表观遗传调控中发挥重要作用。RGFP966(式1)和RGFP109(式2)分别是HDAC3和HDAC1/3的特异性抑制剂，分别高度选择性抑制HDAC3，HDAC1和HDAC3的去乙酰化酶活性。

[0011]

[0012] 以组蛋白去乙酰化酶作为药物作用靶点的药物可以用于制备治疗AGS药物中，通过组蛋白去乙酰化酶表达与功能的抑制剂，如RGFP966和RGFP109来抑制cGAS表达和STING-TBK1-IRF3通路活性，从而达到治疗Aicardi-Goutières综合征的目的。

附图说明

[0013] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

[0014] 图1是RGFP966对cGAS表达和cGAS-STING-TBK1-IRF3通路活性的调控效果的检测结果；

[0015] 图2是RGFP109对cGAS表达和cGAS-STING-TBK1-IRF3通路活性的调控效果的检测结果；

[0016] 图3是RGFP966和RGFP109在Aicardi-Goutières综合征模型小鼠中的治疗效果检测结果。

具体实施方式

[0017] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0018] 实施例1 RGFP966对cGAS表达和cGAS-STING-TBK1-IRF3通路活性的调控效果的检测。

[0019] 细胞刺激步骤：

[0020] ①种细胞：BV2小胶质细胞种至12孔细胞培养板6个孔，密度为3×105个/孔；

[0021] ②预处理：种细胞12h后，加入RGFP966至终浓度为0、10和20μM，各两孔，预处理6h；

[0022] ③poly(dA:dT)刺激：用lipofection2000将poly(dA:dT)转染至细胞。转染流程为：取1.5μg poly(dA:dT)与3μL lipofection2000分别与75μL Opti-MEM室温孵育5min；然后将二者合到一起，吹打混匀，再室温孵育20min，在此期间将细胞更换新鲜培养基；最后将孵育好的转染复合物逐滴分散滴加到细胞培养基中，每孔50μL，每个RGFP966浓度只加一个孔，另一个为对照，轻轻摇晃2～3下后，放回温箱培养；加入poly(dA:dT)6h时裂解细胞，蛋白质免疫印迹检测p-IRF3和cGAS的表达量。

[0023] 蛋白质免疫印迹步骤：

[0024] ①组织/细胞蛋白提取

[0025] 首先配制细胞裂解液，细胞裂解液配方为：50mM HEPES(pH 7.4)，1％NP-40，0.05％SDS，150mM NaCl，100mM NaF，1mM EGTA，4℃保存。使用前再加入蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂phosSTOP。细胞收集后先用预冷PBS洗一遍除去血清和培养基成分(组织则在取材时需用生理盐水灌流)，然后加入适当体积细胞裂解液，4℃旋转孵育
20min(组织需要用组织匀浆器先匀浆后再孵育，5000rpm，15s)。最后4℃，12000×g离心
15min，取上清，进行蛋白浓度测定。根据蛋白浓度测定结果，取相同量总蛋白，加入细胞裂解液调平，并加入适当体积6×上样缓冲液，95℃加热10min。

[0026] ②蛋白浓度测定

[0027] 本研究蛋白浓度测定均采用BCA法，主要步骤如下：1.按照50倍体积试剂A与1倍体积试剂B混合，加入到96孔板中，每一孔100μL；2.根据设定好的标准曲线值加入相应体积预先稀释好的BSA标准品，做浓度梯度-吸光度曲线；3.同时各孔相应加入1μL细胞(组织)裂解液离心上清(或者将上清用去离子水先进行适当稀释)；4.37℃孵育30min，再用多功能酶标仪读取462nm波长处吸光值；5.根据标准品的吸光值计算标准曲线；6.根据标准曲线计算细胞(组织)裂解液离心上清总蛋白浓度；7.将所有细胞/组织裂解液稀释到同样浓度，并尽量控制总蛋白浓度在2～10μg/μL之间。

[0028] ③蛋白质免疫印迹(western blot)

[0029] 主要步骤如下：①配制分离胶浓度为15％的聚丙烯酰氨凝胶进行SDS-PAGE电泳；②湿转法转膜，250mA恒流转膜90min；③5％脱脂乳/TBST室温封闭1h；④按照1:1000将p-IRF3、cGAS和GAPDH抗体分别用含0.1％叠氮钠的2％BSA/TBS稀释，之后与膜4℃孵育过夜；
⑤TBST洗膜3次，每次5min；⑥将膜与对应种属的适当HRP标记二抗孵育(p-IRF3和cGAS抗体种属为兔，GAPDH抗体种属为小鼠)；⑦化学发光法结合X光片显影技术成像；⑧扫描仪扫描显影结果。

[0030] 结果如图1所示，RGFP966显著抑制了cGAS的表达和poly(dA:dT)激活p-IRF3的表达水平，并且呈显著的剂量效应。

[0031] 实施例2：RGFP109对cGAS表达和cGAS-STING-TBK1-IRF3通路活性调控效果的检测[0032] 细胞刺激步骤：

[0033] ①种细胞：BV2小胶质细胞种至12孔细胞培养板6个孔，密度为3×105个/孔；

[0034] ②预处理：种细胞12h后，加入RGFP109至终浓度为0、6和12μM，各两孔，预处理6h；

[0035] ③poly(dA:dT)刺激：用lipofection2000将poly(dA:dT)转染至细胞。转染流程为：取1.5μg poly(dA:dT)与3μL lipofection2000分别与75μL Opti-MEM室温孵育5min；然后将二者合到一起，吹打混匀，再室温孵育20min，在此期间将细胞更换新鲜培养基；最后将孵育好的转染复合物逐滴分散滴加到细胞培养基中，每孔50μL，每个RGFP109浓度只加一个孔，另一个为对照，轻轻摇晃2～3下后，放回温箱培养；加入poly(dA:dT)6h时裂解细胞，蛋白质免疫印迹检测p-IRF3和cGAS的表达量。

[0036] 蛋白质免疫印迹步骤：

[0037] ①组织/细胞蛋白提取

[0038] 首先配制细胞裂解液，细胞裂解液配方为：50mM HEPES(pH 7.4)，1％NP-40，0.05％SDS，150mM NaCl，100mM NaF，1mM EGTA，4℃保存。使用前再加入蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂phosSTOP。细胞收集后先用预冷PBS洗一遍除去血清和培养基成分(组织则在取材时需用生理盐水灌流)，然后加入适当体积细胞裂解液，4℃旋转孵育
20min(组织需要用组织匀浆器先匀浆后再孵育，5000rpm，15s)。最后4℃，12000×g离心
15min，取上清，进行蛋白浓度测定。根据蛋白浓度测定结果，取相同量总蛋白，加入细胞裂解液调平，并加入适当体积6×上样缓冲液，95℃加热10min。

[0039] ②蛋白浓度测定

[0040] 本研究蛋白浓度测定均采用BCA法，主要步骤如下：1.按照50倍体积试剂A与1倍体积试剂B混合，加入到96孔板中，每一孔100μL；2根据设定好的标准曲线值加入相应体积预先稀释好的BSA标准品，做浓度梯度-吸光度曲线；3.同时各孔相应加入1μL细胞(组织)裂解液离心上清(或者将上清用去离子水先进行适当稀释)；4.37℃孵育30min，再用多功能酶标仪读取462nm波长处吸光值；5.根据标准品的吸光值计算标准曲线；6.根据标准曲线计算细胞(组织)裂解液离心上清总蛋白浓度；7.将所有细胞/组织裂解液稀释到同样浓度，并尽量控制总蛋白浓度在2～10μg/μL之间。

[0041] ③蛋白质免疫印迹(western blot)

[0042] 主要步骤如下：①配制分离胶浓度为15％的聚丙烯酰氨凝胶进行SDS-PAGE电泳；②湿转法转膜，250mA恒流转膜90min；③5％脱脂乳/TBST室温封闭1h；④按照1:1000将p-IRF3、cGAS和GAPDH抗体分别用含0.1％叠氮钠的2％BSA/TBS稀释，之后与膜4℃孵育过夜；
⑤TBST洗膜3次，每次5min；⑥将膜与对应种属的适当HRP标记二抗孵育(p-IRF3和cGAS抗体种属为兔，GAPDH抗体种属为小鼠)；⑦化学发光法结合X光片显影技术成像；⑧扫描仪扫描显影结果。

[0043] 结果如图2所示，RGFP109显著抑制了cGAS的表达和poly(dA:dT)激活p-IRF3的表达水平，并且随浓度增加，抑制效果更加显著。

[0044] 实施例3：RGFP966和RGFP109在Aicardi-Goutières综合征模型小鼠中的治疗效果检测。

[0045] 实验动物：3周龄trex1敲除小鼠60只，随机分为3组，每组20只，其中一组为溶剂对照组，一组为RGFP966给药组，一组为RGFP109给药组。

[0046] 药物配制及给药方式：RGFP966和RGFP109分别先用DMSO溶解至浓度为30mg/ml的储液；然后将3g助溶剂羟丙基-β-环糊精用5ml浓度为100mM的醋酸钠(pH＝5.4)溶解，再加入灭菌水定容至10ml，从而配制为浓度为30％的羟丙基-β-环糊精；将上述药物储液和30％的羟丙基-β-环糊精按照1:9的比例混匀，然后腹腔注射，剂量为30mg/kg体重，每天注射一次。以对照组生存率低于50％时为实验终点。

[0047] 结果如图3所示，对照组在18周龄时，生存率降至50％以下，而RGFP966和RGFP109给药组，则均在90％左右，表明RGFP966和RGFP109均可显著延长Aicardi-Goutières综合征模型小鼠寿命。

[0048] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。