一种含羧基香豆素衍生物及其合成方法和应用转让专利
申请号 : CN201811324486.9
文献号 : CN109516969B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 阴彩霞 , 解茜茜 , 霍方俊
申请人 : 山西大学
摘要 :
本发明公开了一种含羧基香豆素衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为(Z)‑2‑氰基‑3‑(4‑((E)‑3‑(7‑(4‑(乙氧羰基)哌嗪‑1‑基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑3‑基)‑3‑氧代丙‑1‑烯‑1‑基)苯基)丙烯酸，英文名称为(Z)‑2‑cyano‑3‑(4‑((E)‑3‑(7‑(4‑(ethoxycarbonyl)piperazin‑1‑yl)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑3‑yl)‑3‑oxoprop‑1‑en‑1‑yl)phenyl)acrylic acid，命名为XI‑2。本发明提供了一种衍生物XI‑2对半胱氨酸特异性检测的方法，在PBS‑DMSO(4:1,v/v，pH 7.4)的溶液中，通过荧光分光光度计定量检测半胱氨酸的含量。该检测过程可循环、简便、灵敏、快速，检测结果准确。本发明还提供了衍生物XI‑2在制备细胞半胱氨酸检测试剂中的应用，即XI‑2在NEM调控作用下高效渗透细胞膜实现检测细胞质中的半胱氨酸。
权利要求 :
1.一种含羧基香豆素衍生物XI‑2，其特征在于，结构式为：。
2.如权利要求1所述的一种含羧基香豆素衍生物XI‑2的合成方法，其特征在于，步骤如下：
1）将氯甲酸乙酯和碳酸氢钠溶解在四氢呋喃中，缓慢滴加到含间羟基苯基哌嗪的四氢呋喃和去离子水的混合溶液中，室温过夜搅拌；萃取，干燥，减压蒸馏得到白色针状晶体化合物A：4‑（3‑羟基苯基）哌嗪‑1‑甲酸乙酯；其中氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌嗪的摩尔比1.4‑1.7:1.1‑1.4:1；
2）在冰水浴条件下，将过量的三氯氧磷缓慢滴加到N,N‑二甲基甲酰胺中，搅拌，将0℃溶解在N,N‑二甲基甲酰胺中的化合物A加入到上述溶液中，搅拌；将体系倒入冰水中，调pH至析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4‑（4‑甲酰基‑3‑羟基苯基）哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
3）按摩尔比1:1.5‑2.0将步骤2）所得化合物B和乙酰乙酸乙酯加入乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却至室温，析出黄色针状固体，抽滤得化合物C：4‑（3‑乙酰基‑
2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基）哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
4）按摩尔比1:1.5‑2.0将步骤3）所得化合物C和对苯二甲醛溶解在乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却，析出黄色固体，抽滤得黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物D：（E）‑4‑（3‑（3‑（4‑甲酰基苯基）丙烯酰基）‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基）哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
5）按摩尔比1:2.5‑3.5将步骤4）所得化合物D和2‑氰基乙酸溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标化合物XI‑2。
3.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI‑2的合成方法，其特征在于，所述步骤1）中四氢呋喃和去离子水体积比为1:1；所述的氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌嗪的摩尔比为1.5:1.25:1。
4.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI‑2的合成方法，其特征在于，所述步骤4）中C和对苯二甲醛的摩尔比为1：1.5，柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为
15:1
5.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI‑2的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中化合物D和2‑氰基乙酸的摩尔比优选为1：3，柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。
6.一种特异性检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：（1）、配制pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配制20 mM的半胱氨酸水溶液，配置2 mM的如权利要求1所述的XI‑2的DMSO溶液；
（2）、取2 mL体积比为4:1的 pH 7.4的PBS和DMSO的混合溶液到一个荧光比色皿中，10 µL XI‑2的DMSO溶液加入到上述体系中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入, 500 nm处的荧光强度的逐渐增强；
（3）、在6个比色皿中，各加入2 mL体积比为4:1的 pH 7.4的PBS和DMSO的混合溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、2、4、6、8、10 µL，5 min后在荧光光谱仪上测定500 nm处荧光强度为50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱胺酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F =12.92 c + 44.92667，‑6
c的单位为10 mol/L；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
7.如权利要求1所述的含羧基香豆素衍生物XI‑2在制备体外循环检测半胱氨酸试剂中的应用。
8.如权利要求1所述的含羧基香豆素衍生物XI‑2在制备细胞半胱氨酸检测试剂中的应用。
说明书 :
一种含羧基香豆素衍生物及其合成方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及香豆素衍生物，具体属于一种含羧基香豆素衍生物及其合成方法和N‑乙基马来酰亚胺(NEM)调控作用下高效渗透细胞膜、区分检测细胞膜上和细胞质中半胱氨
酸的应用。
酸的应用。
背景技术
[0002] 半胱氨酸体内平衡的改变与多种疾病和细胞功能有关，因此，半胱氨酸动态实时活细胞胞内成像和定量分析对于理解病理、生理过程非常重要。因此，半胱氨酸探针是否具
有高效渗透性是至关重要的。
有高效渗透性是至关重要的。
[0003] 研究表明，细胞膜由磷脂双分子层和嵌入的蛋白质组成，蛋白质穿过细胞膜并吸附在细胞膜表面。膜蛋白中的整合膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上与脂肪分子
共价结合，插入脂质双层之间，少数蛋白与糖脂共价结合。N‑乙基马来酰亚胺(NEM)作为蛋
白质半胱氨酸残基的共价修饰基因，用于培养细胞后，与膜蛋白巯基进行反应，改变了细胞
膜的原始结构，使细胞膜的通透性提高，探针能够高效检测细胞质中的半胱氨酸。
共价结合，插入脂质双层之间，少数蛋白与糖脂共价结合。N‑乙基马来酰亚胺(NEM)作为蛋
白质半胱氨酸残基的共价修饰基因，用于培养细胞后，与膜蛋白巯基进行反应，改变了细胞
膜的原始结构，使细胞膜的通透性提高，探针能够高效检测细胞质中的半胱氨酸。
[0004] 然而，目前还没有关于高效检测细胞质中半胱氨酸的特异性荧光探针的报道。这仍然是一个挑战。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种含羧基香豆素衍生物及其制备方法，所述的含羧基香豆素衍生物选择性好，灵敏度高，可实现定量循环检测半胱氨酸以及在NEM调控下高效检测细
胞质中半胱氨酸。
胞质中半胱氨酸。
[0006] 本发明提供的一种含羧基香豆素衍生物，中文名称为(Z)‑2‑氰基‑3‑(4‑((E)‑3‑(7‑(4‑(乙氧羰基)哌嗪‑1‑基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑3‑基)‑3‑氧代丙‑1‑烯‑1‑基)苯基)丙烯
酸，英文名称是：
酸，英文名称是：
[0007] (Z)‑2‑cyano‑3‑(4‑((E)‑3‑(7‑(4‑(ethoxycarbonyl)piperazin‑1‑yl)‑2‑oxo‑2H‑chromen‑3‑yl)‑3‑oxo prop‑1‑en‑1‑yl)phenyl)acrylic acid，命名为XI‑2。结构式
为：
为：
[0008]
[0009] 本发明提供的一种含羧基香豆素衍生物XI‑2的合成方法，包括如下步骤：
[0010] 1)将氯甲酸乙酯和碳酸氢钠溶解在四氢呋喃中，缓慢滴加到含间羟基苯基哌嗪的四氢呋喃和去离子水的混合溶液中，室温过夜搅拌；萃取，干燥，减压蒸馏得到白色针状晶
体化合物A：4‑(3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；其中氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌
嗪的摩尔比1.4‑1.7:1.1‑1.4:1；
体化合物A：4‑(3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；其中氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌
嗪的摩尔比1.4‑1.7:1.1‑1.4:1；
[0011] 2)在冰水浴条件下，将过量的三氯氧磷缓慢滴加到N,N‑二甲基甲酰胺中，搅拌，将0℃溶解在N,N‑二甲基甲酰胺中的化合物A加入到上述溶液中，搅拌；将体系倒入冰水中，调
pH至析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4‑(4‑甲酰基‑3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
pH至析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4‑(4‑甲酰基‑3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
[0012] 3)按摩尔比1:1.5‑2.0将步骤2)所得化合物B和乙酰乙酸乙酯加入乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却至室温，析出黄色针状固体，抽滤得化合物C：4‑(3‑乙酰
基‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
基‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯；
[0013] 4)按摩尔比1:1.5‑2.0将步骤3)所得化合物C和对苯二甲醛溶解在乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却，析出黄色固体，抽滤得黄色粉末状固体，经柱色谱分离
得化合物D：(E)‑4‑(3‑(3‑(4‑甲酰基苯基)丙烯酰基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸
乙酯；
得化合物D：(E)‑4‑(3‑(3‑(4‑甲酰基苯基)丙烯酰基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸
乙酯；
[0014] 5)按摩尔比1:2.5‑3.5将步骤4)所得化合物D和2‑氰基乙酸溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标化
合物XI‑2。
合物XI‑2。
[0015] 所述步骤1)中四氢呋喃和去离子水体积比优选为1:1；所述的氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌嗪的摩尔比优选为1.5:1.25:1。
[0016] 所述步骤4)中化合物C和对苯二甲醛的摩尔比优选为1：1.5，所述的柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比优选为15:1。
[0017] 所述步骤5)中化合物D和2‑氰基乙酸的摩尔比优选为1：3，所述的柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的体积比优选为10:1。
[0018] 在本发明中，通过半胱氨酸和化合物亲核取代反应前后荧光变化，实现半胱氨酸的特异性检测；通过N‑乙基马来酰亚胺(NEM)调节来实现细胞质半胱氨酸的高效检测。
[0019] 一种检测半胱氨酸的方法，步骤为：
[0020] (1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制20mM的半胱氨酸水溶液，配置2mM的XI‑2的DMSO溶液；
[0021] (2)、取2mL的PBS/DMSO(v/v,4:1,pH 7.4)溶液、10μL XI‑2的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入,500nm处的荧光强度
的逐渐增强；
的逐渐增强；
[0022] (3)、在6个比色皿中，各加入2mL的PBS/DMSO(v/v,4:1,pH 7.4)溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、2、4、6、8、10μL，5min后在荧光光谱仪上测定500nm处荧光强度为
50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱胺酸盐浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标
绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝12.92c+44.92667，c的单位为
‑6
10 mol/L；
50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱胺酸盐浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标
绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝12.92c+44.92667，c的单位为
‑6
10 mol/L；
[0023] (4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
[0024] 含羧基香豆素衍生物XI‑2体外循环检测半胱氨酸：
[0025] 配制0.2M的半胱氨酸溶液，配制0.2M的N‑乙基马来酰亚胺溶液；取2mL的PBS/DMSO(v/v,4:1,pH 7.4)溶液、10μL XI‑2的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，加入10μL半胱氨酸
溶液前后，在荧光光谱上测定500nm处的荧光强度分别为37.77、2669，随后加入10μL N‑乙
基马来酰亚胺溶液，500nm处荧光强度为333.5。随后的2次循环荧光强度分别为2824、350、
2720、212.9。
溶液前后，在荧光光谱上测定500nm处的荧光强度分别为37.77、2669，随后加入10μL N‑乙
基马来酰亚胺溶液，500nm处荧光强度为333.5。随后的2次循环荧光强度分别为2824、350、
2720、212.9。
[0026] 本发明含羧基香豆素衍生物XI‑2也可对水环境以及细胞质中的半胱氨酸进行特异性检测；所述的检测包含荧光检测和细胞成像检测。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
[0028] 1、本发明含羧基香豆素衍生物的合成简单，成本低廉，操作方便；
[0029] 2、本发明检测方法能实现半胱氨酸的特异性检测，且显示了高的灵敏性和极好的选择性；
[0030] 3、本发明检测方法能实现半胱氨酸的体外循环检测，其在半胱氨酸病理学检测研究中心有巨大潜力；
[0031] 4、本发明检测方法首次实现NEM调控下高效检测细胞质中半胱氨酸，其在半胱氨酸病理和生理学研究中具有广阔的应用前景；
[0032] 5、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪和激光共聚焦显微镜即可实现。
附图说明
[0033] 图1实施例1制备的XI‑2的核磁氢谱图。
[0034] 图2实施例1制备的XI‑2的核磁碳谱图。
[0035] 图3实施例1制备的XI‑2的质谱图。
[0036] 图4 XI‑2与半胱氨酸作用的荧光发射图。
[0037] 图5 XI‑2与半胱氨酸及NEM作用随时间荧光发射图。
[0038] 图6 XI‑2与半胱氨酸作用和NEM循环荧光图。
[0039] 图7 XI‑2与各种分析物的荧光柱状图。
[0040] 图8 XI‑2测定半胱氨酸的工作曲线。
[0041] 图9 XI‑2测定样品的荧光发射图。
[0042] 图10 XI‑2对细胞半胱氨酸进行特异性成像图。
[0043] 图11对图10中绿色通道中成像细胞荧光强度分析图。
[0044] 图12对图10中细胞膜上半胱氨酸成像荧光强度分部分析图。
[0045] 图13 XI‑2对小鼠成像图。
具体实施方式
[0046] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0047] 实施例1
[0048] XI‑2的制备和表征
[0049] 1)将氯甲酸乙酯(0.488g，4.50mmol)和碳酸氢钠(0.315g，3.75mmol)溶解在10mL四氢呋喃中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到含间羟基苯基哌嗪(0.535g，3.00mmol)的体积比
为1:1的四氢呋喃和去离子水的溶液(40mL)圆底烧瓶中，室温过夜搅拌；反应完成后，二氯
甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到白色针状晶体A：4‑(3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙
酯。
为1:1的四氢呋喃和去离子水的溶液(40mL)圆底烧瓶中，室温过夜搅拌；反应完成后，二氯
甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到白色针状晶体A：4‑(3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙
酯。
[0050] 2)在冰水浴的条件下，将三氯氧磷(5mL)缓慢滴加到10mL N,N‑二甲基甲酰胺中，搅拌30min后，将0℃的溶解在10mL N,N‑二甲基甲酰胺中的A(0.500g，2.00mmol)缓慢加入
到上述溶液中，混合完全后搅拌2h；将体系导入100mL的冰水中，用饱和碳酸氢钠溶液调pH
至8，析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4‑(4‑甲酰基‑3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
到上述溶液中，混合完全后搅拌2h；将体系导入100mL的冰水中，用饱和碳酸氢钠溶液调pH
至8，析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4‑(4‑甲酰基‑3‑羟基苯基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
[0051] 3)将步骤2)所得B(0.557g，2.00mmol)和乙酰乙酸乙酯(400μL，3.00mmol)加入20mL乙醇中，加入100μL哌啶做催化剂，78℃回流6h至反应完全；冷却至室温，析出黄色针状
固体，抽滤，得化合物C：4‑(3‑乙酰基‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
固体，抽滤，得化合物C：4‑(3‑乙酰基‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
[0052] 4)将步骤3)所得C(0.690g，2.00mmol)和对苯二甲醛(0.400g，3.00mmol)溶解在20mL乙醇中，加入100μL哌啶做催化剂，90℃回流72h至反应完全；冷却，析出黄色固体，抽
滤，得黄色粉末状固体，经硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯，15/1，V/V，洗脱)纯化得化合物
D：(E)‑4‑(3‑(3‑(4‑甲酰基苯基)丙烯酰基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
滤，得黄色粉末状固体，经硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯，15/1，V/V，洗脱)纯化得化合物
D：(E)‑4‑(3‑(3‑(4‑甲酰基苯基)丙烯酰基)‑2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基)哌嗪‑1‑甲酸乙酯。
[0053] 5)将步骤4)所得D(0.230g，0.500mmol)和2‑氰基乙酸(0.065g，1.50mmol)溶于20mL乙醇中，加入100μL哌啶做催化剂，78℃回流4h至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗
产品，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇，10/1，V/V，洗脱)纯化，纯化得红色粉末固体XI‑2。
产品，经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇，10/1，V/V，洗脱)纯化，纯化得红色粉末固体XI‑2。
[0054] 1H NMR(600MHz,DMSO)δ(ppm):8.65(s,1H),7.97(t,J＝12.5Hz,4H),7.85(d,J＝8.2Hz,2H),7.76(d,J＝9.0Hz,1H),7.71(d,J＝15.7Hz,1H),7.05(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),
13
6.90(s,1H),4.08(q,J＝7.1Hz,2H),3.58‑3.50(m,8H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H).(图1). C
NMR(151MHz,DMSO‑d6)δ(ppm):186.3,160.0,158.2,155.3,155.1,148.8,141.4,132.5,
+
130.5,129.3,126.8,117.9,112.1,109.7,98.9,61.4,46.5,15.0.(图2).HR‑MS[probe+H] :m/
z Calcd 528.5405,Found 528.17674.(图3).
13
6.90(s,1H),4.08(q,J＝7.1Hz,2H),3.58‑3.50(m,8H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H).(图1). C
NMR(151MHz,DMSO‑d6)δ(ppm):186.3,160.0,158.2,155.3,155.1,148.8,141.4,132.5,
+
130.5,129.3,126.8,117.9,112.1,109.7,98.9,61.4,46.5,15.0.(图2).HR‑MS[probe+H] :m/
z Calcd 528.5405,Found 528.17674.(图3).
[0055] 实施例2
[0056] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM XI‑2的DMSO溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；取2mL的PBS‑DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,v/v)溶液、10μL XI‑2的DMSO溶液加
到荧光比色皿中，逐渐加入半胱氨酸溶液的体积为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45μL，同时
在荧光光谱仪上测定500nm处荧光强度为50.23、898.8、1590、1917、2360、2567、2754、2952、
2962、3081，荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
到荧光比色皿中，逐渐加入半胱氨酸溶液的体积为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45μL，同时
在荧光光谱仪上测定500nm处荧光强度为50.23、898.8、1590、1917、2360、2567、2754、2952、
2962、3081，荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
[0057] 实施例3
[0058] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM XI‑2的DMSO溶液，配制0.2M的半胱氨酸水溶液，配制0.2M的N‑乙基马来酰亚胺(NEM)溶液；把10μL XI‑2的DMSO溶液加入
到2mL PBS‑DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,v/v)的荧光比色皿中，取10μL半胱氨酸溶液，加入上
述缓冲溶液当中，待体系荧光强度不再发生变化时，取0.5μL NEM溶液，加入上述溶液当中，
待体系荧光强度不再发生变化时，继续加入2μL NEM溶液，待体系荧光强度不再发生变化
时，重复加入2μL NEM溶液4次至体系荧光强度不在发生变化；再次加入10μL半胱氨酸溶液
使得体系的荧光再次升高。荧光发射图见图5。另取一个荧光比色皿，把10μL XI‑2的DMSO溶
液加入到2mL PBS‑DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,v/v)的荧光比色皿中，取10μL半胱氨酸溶液，
加入上述缓冲溶液当中，待体系荧光强度不再发生变化时，取10μL N‑乙基马来酰亚胺
(NEM)溶液加到此比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着N‑乙基马来酰亚胺的加入，
500nm处荧光强度降低，体系荧光逐渐恢复到探针本身的荧光强度。荧光发射图见图6。
到2mL PBS‑DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,v/v)的荧光比色皿中，取10μL半胱氨酸溶液，加入上
述缓冲溶液当中，待体系荧光强度不再发生变化时，取0.5μL NEM溶液，加入上述溶液当中，
待体系荧光强度不再发生变化时，继续加入2μL NEM溶液，待体系荧光强度不再发生变化
时，重复加入2μL NEM溶液4次至体系荧光强度不在发生变化；再次加入10μL半胱氨酸溶液
使得体系的荧光再次升高。荧光发射图见图5。另取一个荧光比色皿，把10μL XI‑2的DMSO溶
液加入到2mL PBS‑DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,v/v)的荧光比色皿中，取10μL半胱氨酸溶液，
加入上述缓冲溶液当中，待体系荧光强度不再发生变化时，取10μL N‑乙基马来酰亚胺
(NEM)溶液加到此比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着N‑乙基马来酰亚胺的加入，
500nm处荧光强度降低，体系荧光逐渐恢复到探针本身的荧光强度。荧光发射图见图6。
[0059] 实施例4
[0060] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM XI‑2的DMSO溶液，配制0.2M的半胱氨酸水溶液，分别配制0.2M Ala,Asn,Asp,Arg,Gln,Glu,Gly,Ile,Leu,Met,Pro,Ser,
+ + 2+ 2+ 2+ 2+ ‑ 2‑ ‑ ‑ ‑ ‑
Thr,Trp,Tyr,Val,GSH,Hcy,K ，Na ，Mg ，Mn ,Ca ，Cu ，Cl ，SO4 ，NO3 ，Br ，OH ，CNS ，
2‑ 2‑ 2‑ 2‑
CO3 ，S2O3 ，SO3 ，S 的水溶液；在35个荧光比色皿中，各加入2mL的PBS‑DMSO(4:1，pH 7.4)
溶液和10μL XI‑2的DMSO溶液，以及50μL各种分析物：Ala,Asn,Asp,Arg,Gln,Glu,Gly,Ile,
+ + 2+ 2+ 2+ 2+ ‑ 2‑ ‑
Leu,Met,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val,GSH,Hcy,K ，Na ，Mg ，Mn ,Ca ，Cu ，Cl ，SO4 ，NO3 ，
‑ ‑ ‑ 2‑ 2‑ 2‑ 2‑
Br，OH ，CNS ，CO3 ，S2O3 ，SO3 ，S ，及5μL的Cys,在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析
物对应的500nm处荧光强度柱状图(见图7)。半胱氨酸使得检测体系在500nm处荧光强度明
显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
+ + 2+ 2+ 2+ 2+ ‑ 2‑ ‑ ‑ ‑ ‑
Thr,Trp,Tyr,Val,GSH,Hcy,K ，Na ，Mg ，Mn ,Ca ，Cu ，Cl ，SO4 ，NO3 ，Br ，OH ，CNS ，
2‑ 2‑ 2‑ 2‑
CO3 ，S2O3 ，SO3 ，S 的水溶液；在35个荧光比色皿中，各加入2mL的PBS‑DMSO(4:1，pH 7.4)
溶液和10μL XI‑2的DMSO溶液，以及50μL各种分析物：Ala,Asn,Asp,Arg,Gln,Glu,Gly,Ile,
+ + 2+ 2+ 2+ 2+ ‑ 2‑ ‑
Leu,Met,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val,GSH,Hcy,K ，Na ，Mg ，Mn ,Ca ，Cu ，Cl ，SO4 ，NO3 ，
‑ ‑ ‑ 2‑ 2‑ 2‑ 2‑
Br，OH ，CNS ，CO3 ，S2O3 ，SO3 ，S ，及5μL的Cys,在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析
物对应的500nm处荧光强度柱状图(见图7)。半胱氨酸使得检测体系在500nm处荧光强度明
显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
[0061] 实施例5
[0062] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM XI‑2的溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；在6个比色皿中，各加入2mL的PBS/DMSO(v/v,4:1,pH 7.0)溶液、10μL
XI‑2的DMSO溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、1、2.5、3.3、5、6、7.5、9、10μL，5min后
在荧光光谱仪上测定500nm处荧光强度为50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱氨
酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图8，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归
‑6
方程为：F＝12.92c+44.92667，c的单位为10 mol/L；
XI‑2的DMSO溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、1、2.5、3.3、5、6、7.5、9、10μL，5min后
在荧光光谱仪上测定500nm处荧光强度为50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱氨
酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图8，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归
‑6
方程为：F＝12.92c+44.92667，c的单位为10 mol/L；
[0063] 实施例6
[0064] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用DMSO配制2mM XI‑2的溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；把10μL XI‑2的DMSO溶液加入到2mL PBS–DMSO(10mM,pH＝7.4,4:1,
v/v)的荧光比色皿中，取半胱氨酸的溶液6.5μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧
光光谱仪上测定500nm荧光强度为898.8，通过实施例5的线性回归方程，求得c＝66.09×
‑6
10 mol/L。偏差为1.6％。见图9。
v/v)的荧光比色皿中，取半胱氨酸的溶液6.5μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧
光光谱仪上测定500nm荧光强度为898.8，通过实施例5的线性回归方程，求得c＝66.09×
‑6
10 mol/L。偏差为1.6％。见图9。
[0065] 实施例7
[0066] 配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制2mM XI‑2的DMSO溶液，用PBS缓冲溶液分别配制20mM半胱氨酸溶液、15μM的同型半胱氨酸、1mM的谷胱甘肽，用PBS缓冲溶液配
制1mM NEM(N‑乙基马来酰亚胺，硫醇清除剂)溶液；把10μL XI‑2的DMSO溶液加入到1990μL
的PBS中；将探针溶液加入HepG‑2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG‑2细胞在37℃
下，孵育30min，体系在荧光成像仪下显示细胞膜上有绿色荧光产生，即XI‑2上的羧基与膜
蛋白的氨基形成肽链，停滞在细胞膜，与细胞膜上的半胱氨酸响应，产生绿色荧光，如图10
(A)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗
一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧
光分布细胞质中，即NEM作用后，胞膜的通透性提高，XI‑2能够高效检测细胞质中的半胱氨
酸，如图10(B)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，
用PBS冲洗一次，把20μL 20mM半胱氨酸溶液加入到1980μL的PBS中；将半胱氨酸溶液加入
HepG‑2细胞培养液中，使得其浓度为200μM，与HepG‑2细胞在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗
一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧
光分布在细胞质中，即NEM作用后，XI‑2进入细胞，不仅与细胞质中的半胱氨酸响应，还能与
外源性半胱氨酸进行反应，如图10(C)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃
下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗一次，将2mL的15μM的同型半胱氨酸溶液孵育HepG‑2细
胞，在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育
30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧光分布在细胞质中，对比图10(B)和图10(C)发现
NEM作用后，XI‑2进入细胞，仅与细胞质中的半胱氨酸响应，如图10(D)；把2mL的NEM溶液加
入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗一次，将2mL的1mM的谷
胱甘肽溶液孵育HepG‑2细胞，在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗一次，再加入2mL 10μM的探
针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧光分布在细胞质中，对比图
10(B)和图10(C)发现NEM作用后，XI‑2进入细胞，仅与细胞质中的半胱氨酸响应，如图10
(E)。
制1mM NEM(N‑乙基马来酰亚胺，硫醇清除剂)溶液；把10μL XI‑2的DMSO溶液加入到1990μL
的PBS中；将探针溶液加入HepG‑2细胞培养液中，使得其浓度为10μM，与HepG‑2细胞在37℃
下，孵育30min，体系在荧光成像仪下显示细胞膜上有绿色荧光产生，即XI‑2上的羧基与膜
蛋白的氨基形成肽链，停滞在细胞膜，与细胞膜上的半胱氨酸响应，产生绿色荧光，如图10
(A)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗
一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧
光分布细胞质中，即NEM作用后，胞膜的通透性提高，XI‑2能够高效检测细胞质中的半胱氨
酸，如图10(B)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，
用PBS冲洗一次，把20μL 20mM半胱氨酸溶液加入到1980μL的PBS中；将半胱氨酸溶液加入
HepG‑2细胞培养液中，使得其浓度为200μM，与HepG‑2细胞在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗
一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧
光分布在细胞质中，即NEM作用后，XI‑2进入细胞，不仅与细胞质中的半胱氨酸响应，还能与
外源性半胱氨酸进行反应，如图10(C)；把2mL的NEM溶液加入HepG‑2细胞培养液中，在37℃
下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗一次，将2mL的15μM的同型半胱氨酸溶液孵育HepG‑2细
胞，在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗一次，再加入2mL 10μM的探针溶液，在37℃下孵育
30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧光分布在细胞质中，对比图10(B)和图10(C)发现
NEM作用后，XI‑2进入细胞，仅与细胞质中的半胱氨酸响应，如图10(D)；把2mL的NEM溶液加
入HepG‑2细胞培养液中，在37℃下孵育30min，吸走溶液，用PBS冲洗一次，将2mL的1mM的谷
胱甘肽溶液孵育HepG‑2细胞，在37℃下，孵育30min，用PBS冲洗一次，再加入2mL 10μM的探
针溶液，在37℃下孵育30min，体系在荧光成像仪下显示绿色荧光分布在细胞质中，对比图
10(B)和图10(C)发现NEM作用后，XI‑2进入细胞，仅与细胞质中的半胱氨酸响应，如图10
(E)。
[0067] 图10为共聚焦荧光成像仪下探针对细胞膜上半胱氨酸的检测(绿色荧光主要分布在细胞膜上)以及NEM作用后，探针对细胞质中半胱氨酸高效荧光响应(绿色荧光主要分布
在细胞质中)和经NEM作用后再与细胞质中及外源的半胱氨酸的响应(显示绿色荧光)成像
图。因此，从以上结果，提出在NEM调控作用下，XI‑2能够高效、连续监测细胞质中的半胱氨
酸。
在细胞质中)和经NEM作用后再与细胞质中及外源的半胱氨酸的响应(显示绿色荧光)成像
图。因此，从以上结果，提出在NEM调控作用下，XI‑2能够高效、连续监测细胞质中的半胱氨
酸。
[0068] 图11为图10中绿色通道中成像细胞荧光强度分析图。将图10中绿色通道每个成像结果进行了分析，具体操作如下：将每张绿色荧光成像图中的细胞单独计算平均荧光强度
(只圈细胞部分)，即先将每个细胞的荧光强度计算出来，然后加和再计算平均值。经过对比
5个平均值发现，细胞质中的半胱氨酸要多于细胞膜上半胱氨酸的含量；而且不论是同型半
胱氨酸还是谷胱甘肽处理的细胞平均荧光强度的结果都与只用NEM和XI‑2处理的结果一
样，因此还可以得出这样一个结论：NEM在整个过程中只参与了与膜蛋白的巯基进行反应进
而改变细胞膜的通透性，而没有清除细胞质中的硫醇。
(只圈细胞部分)，即先将每个细胞的荧光强度计算出来，然后加和再计算平均值。经过对比
5个平均值发现，细胞质中的半胱氨酸要多于细胞膜上半胱氨酸的含量；而且不论是同型半
胱氨酸还是谷胱甘肽处理的细胞平均荧光强度的结果都与只用NEM和XI‑2处理的结果一
样，因此还可以得出这样一个结论：NEM在整个过程中只参与了与膜蛋白的巯基进行反应进
而改变细胞膜的通透性，而没有清除细胞质中的硫醇。
[0069] 图12为图10中探针孵育细胞结果的单个细胞荧光分布分析图。探针直接孵育细胞，绿色荧光主要分布在细胞膜上。可能是由于探针上的羧基与膜蛋白的氨基形成肽链，导
致探针停滞在细胞膜表面。
致探针停滞在细胞膜表面。
[0070] 实施例8
[0071] 小鼠用戊巴比妥钠(100μL 0.5mL/0.03％)皮下注射麻醉。将XI‑2溶液(20μL，0.1mM)，注射在小鼠皮下。小鼠在荧光成像仪下只加XI‑2拍一组照片，再在同样的部位注射
半胱氨酸(20μL,0.2mM)做时间序列。按时间序列0.5、5、10、20、25、30min分别记录荧光图
像。实验结果表明当加入半胱氨酸时，在20分钟的时间范围内观察到荧光强度增强，随后由
机体维持，说明XI‑2可成功用于小鼠体内半胱氨酸成像。图13中的(a)未经任何处理的裸
鼠，(b)仅皮下注射XI‑2，(c‑h)分别为皮下注射半胱氨酸0.5、5、10、20、25、30min。
半胱氨酸(20μL,0.2mM)做时间序列。按时间序列0.5、5、10、20、25、30min分别记录荧光图
像。实验结果表明当加入半胱氨酸时，在20分钟的时间范围内观察到荧光强度增强，随后由
机体维持，说明XI‑2可成功用于小鼠体内半胱氨酸成像。图13中的(a)未经任何处理的裸
鼠，(b)仅皮下注射XI‑2，(c‑h)分别为皮下注射半胱氨酸0.5、5、10、20、25、30min。