一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用转让专利
申请号 : CN201811425953.7
文献号 : CN109517777B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 吴凌天 , 徐悦 , 杜悦 , 朱益波 , 丁高杰 , 杨兴旭 , 王成红 , 杨蕾
申请人 : 常熟理工学院
摘要 :
权利要求 :
1.一株产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,其特征在于,该基因工程菌中导入了硫酸软骨素AC裂解酶基因,所述硫酸软骨素AC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示,所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600‑△spoOA或者B.subtilis WB800‑△spoOA。
2.权利要求1所述产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1S)将SEQID NO.1所示的基因序列克隆到表达载体上,得到重组质粒,所述表达载体为pHA03;
(2S)将重组质粒转化枯草芽孢杆菌,既得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
3.权利要求1所述产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌在制备硫酸软骨素AC裂解酶或小分子透明质酸中的应用。
4.一种小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)透明质酸的制备:包括组织提取法和生物合成法;
(1‑1)组织提取法:
(1‑1a)动物组织预处理:将动物组织放入反应釜中,加入蒸馏水,控制温度为70~95℃,加热1~2h,得到软骨处理液;
(1‑1b)酶解:用NaOH调节软骨预处理液的pH为7.0~10.0;向其中加入木瓜蛋白酶和碱
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性蛋白酶,使总酶活与软骨质量的比例为2×10~6×10U:1kg,酶解1~5h;再用12mol/L的盐酸调节pH为6.0~8.0,向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶,使中性蛋白酶和胰蛋白酶的
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总酶活与软骨质量的比例为2×10~6×10U:1kg,继续酶解1~5h;最后灭酶,得到混合液A;
(1‑1c)过滤:过滤步骤(1b)得到的混合液A,收集滤液,得到透明质酸溶液;
(1‑2)微生物发酵法:
(1‑2a)透明质酸的生物合成
将兽疫链球菌接种至发酵培养基中,在发酵罐中培养;
(1‑2b)过滤:向发酵液中加体积分数为1‰~5‰的高岭土或者硅藻土,搅拌0.5~1h后用板框过滤机过滤除菌,得到含有透明质酸的滤液;
(2)吸附:将步骤(1‑1c)或(1‑2b)得到的透明质酸溶液分别泵入透明质酸专用吸附层析柱内,经吸附处理后,得到吸附了透明质酸的层析柱;
(3)除杂:用0.5%~1%的NaCl水溶液以2~6BV/h的流速对步骤(2)得到的吸附了透明质酸的层析柱进行除杂处理;
(4)洗脱:用2%~5%的NaCl水溶液以2~6BV/h的流速对吸附了透明质酸的层析柱进行洗脱处理,得到洗脱液A,洗脱液A中含有透明质酸;
(5)脱盐:将步骤(4)得到的洗脱液A用孔径为100kDa~300kDa的超滤膜的进行脱盐,得到超滤截留液Ⅰ;
(6)透明质酸的连续降解:将步骤(5)得到超滤截留液Ⅰ泵入酶膜反应器的降解反应釜
13中,向其中加入硫酸软骨素AC裂解酶,
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使硫酸软骨素AC裂解酶的总酶活与透明质酸质量的比例为2×10 ~6×10U:1kg,控制转速50~100rpm,温度25~40℃,降解反应进行1h后,开启酶膜反应器的超滤膜组件,小分子透明质酸透过超滤膜进入酶膜反应器的浓缩釜中,得到小分子透明质酸浓缩液;
所述硫酸软骨素AC裂解酶按照如下方法制备得到:将权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌接种于LB液体培养基中,37℃过夜培养;再转接发酵培养基,发酵培养2~4小时至OD660达到0.6时,加入IPTG或乳糖诱导表达16~24h;
(7)除菌:对小分子透明质酸浓缩液进行除菌处理,得到无菌滤液;
(8)浓缩:将步骤(7)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩,得到无菌浓缩液;
(9)干燥:将步骤(8)得到的无菌浓缩液泵入喷雾干燥塔内,进风温度185℃,出风温度
90℃,进行干燥,得到小分子透明质酸成品。
5.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,步骤(6)中,所述的酶膜反应器包括如下部件:
各单元通过管道连接,主体部分包括降解反应釜(10)、超滤膜组件、浓缩釜(13)和纳滤膜组件14;
其中,所述降解反应釜(10)包括:夹套(8‑1)、搅拌桨(9‑1)、电机(2‑1)、温度传感器(1‑
1),所述夹套(8‑1)包覆在降解反应釜(10‑1)的外部,所述搅拌桨(9‑1)与电机(2‑1)连接,所述搅拌桨(9‑1)、温度传感器(1‑1)伸入反应釜(10‑1)的内部,所述降解反应釜(10‑1)的上部设有反应液出口管道,所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接;
所述超滤膜组件包括:第一超滤柱(12‑1)、第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3);所述第一超滤柱(12‑1)、第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3)分别设有第一超滤液进口(12‑1‑1)、第二超滤液进口(12‑1‑2)、第三超滤液进口(12‑1‑3),和第一超滤液出口(12‑2‑
1)、第二超滤液出口(12‑1‑2)、第三超滤液出口(12‑1‑3);所述第一超滤柱(12‑1)、第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3)内均设有超滤膜,所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、
2500Da、3000Da或者5000Da,所述第一超滤液进口(12‑1‑1)、第二超滤液进口(12‑1‑2)、第三超滤液进口(12‑1‑3)与反应液出口管道连接,所述第一超滤液出口(12‑2‑1)、第二超滤液出口(12‑1‑2)、第三超滤液出口(12‑1‑3)通过管道与浓缩釜(13)连接,所述第一超滤柱(12‑1)、第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3)上分别设有第一超滤回流出口(16‑1)、第二超滤回流出口(16‑2)、第三超滤回流出口(16‑3),所述第一超滤回流出口(16‑1)、第二超滤回流出口(16‑2)、第三超滤回流出口(16‑3)通过管道与降解反应釜(10‑1)连接;
所述浓缩釜(13)包括:夹套(8‑2)、搅拌桨(9‑2)、电机(2‑2)、温度传感器(1‑2),所述夹套(8‑2)包覆在浓缩釜(13)的外部,所述搅拌桨(9‑2)与电机(2‑2)连接,所述搅拌桨(9‑2)、温度传感器(1‑2)伸入浓缩釜(13)的内部,所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道(7),所述清水进入管道(7)上设有调节阀(3‑5)和恒流泵(4‑2),所述浓缩釜(13)通过管道与膜过滤组件(14)连接;
所述膜过滤组件(14)包括进口(14‑1)和出口(14‑2),所述膜过滤组件(14)中设有纳滤膜或超滤膜,所述纳滤膜的孔径为360Da~1000Da,所述超滤膜的孔径为10KDa~50kDa;所述膜过滤组件(14)的进口(14‑1)通过管道与浓缩釜(13)连接。
6.根据权利要求4所述小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,步骤(6)中,所述发酵培养基的配方如下:蔗糖8g/L,硫酸软骨素5g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,MgSO4 0.5g/L,K2HPO4·3H2O 3g/L,CaCl2 2g/L,pH 6.5。
7.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,步骤(7)中,所述除菌处理,是利用0.01~0.10μm金属过滤器进行过滤除菌。
8.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,步骤(8)中,所述的三效浓缩器浓缩,其浓缩条件为:一效温度80~90℃,二效温度75~85℃,三效温度60~70℃,真空度为0.02~0.06MPa。
9.根据权利要求4所述的小分子透明质酸的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的透明质酸专用吸附层析柱为BE‑D82型透明质酸专用吸附树脂。
说明书 :
一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的
应用
技术领域
背景技术
葡萄糖胺通过β‑(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖;每个双糖单
位通过件β‑(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来;其双糖单位可达25000个之多,分子
量在20000~50000kDa之间。
的润滑、缓冲势作用及在结缔组织中充当填料的生物学功能之外,它还通过作用于细胞及
细胞间质中的透明质酸受体,调节细胞功能,在组织生成和修复、肿瘤侵袭等过程中发挥重
要作用。
生物利用度较低,严重影响了透明质酸的疗效。因此,制备小分子透明质酸具有重要意义。
法处理过程简单,产品易于回收,但是存在一定的缺陷,例如加热法易使产品变色,超声效
率较低,γ‑射线辐照残留,且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和
氧化降解法,水解法包括酸水解和碱水解,氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。
但是,化学降解法引入了化学试剂,反应条件复杂,易给产品的生物活性带来影响和产品的
纯化带来困难,且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生
物活性保持较好等特点,成为近年来小分子透明质酸的研究热点。
ChSase C。硫酸软骨素裂解酶产生菌如表1所示,其中肝素黄杆菌Flavobacterium
heparinum是ChSase AC的主要来源。
肠杆菌表达的ChSase AC并不适用于小分子量透明质酸的制备。国内对于ChSase AC的发酵
生产主要的问题是:发酵生产ChSase AC酶活偏低,且多为胞内表达,而破碎过程必定会增
加生产成本。因此,构建以分泌型生产ChSase AC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意
义。
发明内容
酶表达量少、酶活低、存在包涵体等问题。
并将昂贵的硫酸软骨素裂解酶循环利用,大大降低了生产成本。
示,所述的枯草芽孢杆菌的出发菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600‑△spoOA或
者B.subtilis WB800‑△spoOA。
和碱性蛋白酶,使总酶活与软骨质量的比例为2×10 ~6×10 U:1kg,酶解1~5h;再用
12mol/L的盐酸调节pH为6.0~8.0,向其中加入中性蛋白酶和胰蛋白酶,使中性蛋白酶和胰
5 5
蛋白酶的总酶活与软骨质量的比例为2×10~6×10 U:1kg,继续酶解1~5h;最后灭酶,得
到混合液A;
发酵罐(BioFlo 115,New Brunswick Scientific,USA)中,装液量为4.5L,搅拌转速400r/
min,通气量1.0vvm,温度37℃,发酵18~20h,发酵罐中透明质酸发酵培养基配方为:酵母粉
10g/L,磷酸氢二钾5g/L,硫酸钠2g/L,蔗糖60g/L,硫酸镁1.0g/L,氯化钙0.002g/L,氯化锌5
‑5 ‑5
×10 g/L,硫酸铜2×10 g/L,pH 7.0;
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质量的比例为2×10~6×10U:1kg,控制转速50~100rpm,温度25~40℃,降解反应进行1h
后,开启酶膜反应器的超滤膜系统,小分子透明质酸透过超滤膜进入酶膜反应器的浓缩釜
中,得到小分子透明质酸浓缩液;
连接,所述搅拌桨(9‑1)、温度传感器(1‑1)伸入反应釜(10‑1)的内部,所述降解反应釜(10‑
1)的上部设有反应液出口管道,所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接;
液进口(12‑1‑1)、第二超滤液进口(12‑1‑2)、第三超滤液进口(12‑1‑3),和第一超滤液出口
(12‑2‑1)、第二超滤液出口(12‑1‑2)、第三超滤液出口(12‑1‑3);所述第一超滤柱(12‑1)、
第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3)内均设有超滤膜,所述超滤膜的孔径为1000Da、
2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da,所述第一超滤液进口(12‑1‑1)、第二超滤液进口(12‑
1‑2)、第三超滤液进口(12‑1‑3)与反应液出口管道连接,所述第一超滤液出口(12‑2‑1)、第
二超滤液出口(12‑1‑2)、第三超滤液出口(12‑1‑3)通过管道与浓缩釜(13)连接,所述第一
超滤柱(12‑1)、第二超滤柱(12‑2)、第三超滤柱(12‑3)上分别设有第一超滤回流出口(16‑
1)、第二超滤回流出口(16‑2)、第三超滤回流出口(16‑3),所述第一超滤回流出口(16‑1)、
第二超滤回流出口(16‑2)、第三超滤回流出口(16‑3)通过管道与降解反应釜(10‑1)连接;
(9‑2)、温度传感器(1‑2)伸入浓缩釜(13)的内部,所述浓缩釜(13)上设有清水进入管道
(7),所述清水进入管道(7)上设有调节阀(3‑5)和恒流泵(4‑2),所述浓缩釜(13)通过管道
与膜过滤组件(14)连接;
50kDa;所述膜过滤组件(14)的进口(14‑1)通过管道与浓缩釜(13)连接。
~24h。
优选添加量为5×10U:1kg;酶膜反应器中超滤膜组件的优选操作压力为0.15~0.25MPa;
酶膜反应器中钠滤膜组件的优选操作压力为0.10~0.15MPa;酶膜反应器中超滤膜组件12
和超滤膜组件14的优选循环流速为5~8L/min。
化生产小分子透明质酸提供了借鉴。
合节约资源,环境友好的生产理念。
过程中易燃易爆(乙醇和丙酮)的使用,不仅解决生产中的安全问题,而且节能减排,经济效
益显著。
酸软骨素A、B、C分子量的可控连续生产。
附图说明
具体实施方式
发明。
拌器,10为降解反应釜,11‑1、11‑2为压力表,12‑1~12‑3为超滤膜组件,12‑1‑2、12‑2‑1、
12‑3‑2超滤出口,13浓缩釜,14超滤膜组件,14‑1超滤进口,14‑2超滤出口,15‑1、15‑2物料
出口,16‑1、16‑2、16‑3超滤回流出口,17超滤回流出口。
温度传感器1‑1伸入反应釜10‑1的内部,所述降解反应釜10‑1的上部设有反应液出口管道,
所述反应液出口管道与超滤膜组件的一端连接;
第二超滤液进口12‑1‑2、第三超滤液进口12‑1‑3,和第一超滤液出口12‑2‑1、第二超滤液出
口12‑1‑2、第三超滤液出口12‑1‑3;所述第一超滤柱12‑1、第二超滤柱12‑2、第三超滤柱12‑
3内均设有超滤膜,所述超滤膜的孔径为1000Da、2000Da、2500Da、3000Da或者5000Da,所述
第一超滤液进口12‑1‑1、第二超滤液进口12‑1‑2、第三超滤液进口12‑1‑3与反应液出口管
道连接,所述第一超滤液出口12‑2‑1、第二超滤液出口12‑1‑2、第三超滤液出口12‑1‑3通过
管道与浓缩釜13连接,所述第一超滤柱12‑1、第二超滤柱12‑2、第三超滤柱12‑3上分别设有
第一超滤回流出口16‑1、第二超滤回流出口16‑2、第三超滤回流出口16‑3,所述第一超滤回
流出口16‑1、第二超滤回流出口16‑2、第三超滤回流出口16‑3通过管道与降解反应釜10‑1
连接;
入浓缩釜13的内部,所述浓缩釜13上设有清水进入管道7,所述清水进入管道7上设有调节
阀3‑5和恒流泵4‑2,所述浓缩釜13通过管道与膜过滤组件14连接;
过滤组件14的进口14‑1通过管道与浓缩釜13连接。
粒基因序列设计引物(P7,P8)合成片段F4;根据P.heparinus ATCC13125基因组中硫酸软骨
素AC裂解酶的基因(csl AC)设计引物(P9,P10)合成片段F5。
3min;共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Axygen胶
回收试剂盒进行纯化。
62℃30s;72℃2.3min;共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1%琼脂糖凝胶电泳
后,采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
30s,61℃30s;72℃1.6min;共循环35次。由聚合酶链式反应得到的产物经1%琼脂糖凝胶电
泳后,采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
性30s,59℃30s;72℃1min;共35次循环。由聚合酶链式反应得到的产物经1%琼脂糖凝胶电
泳后,采用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
后将其放入预先准备的冰水浴中冷却5min。再按照热休克转化方法将连接产物转入感受态
E.coli DH5α中,37℃过夜培养,挑取克隆子,经液体LB培养12h后,抽提质粒酶切验证并进
行测序。
预变性30s,58℃30s;72℃2min;共35次循环。扩增产物和质粒pHA03经BamH I和Xba I双酶
切后,分别采用胶回收试剂盒纯化。用T4连接酶将线性化载体和目的片段在孵化器中16℃
过夜连接,次日按照热休克转化方法将连接产物转入感受态E.coli DH5α中,37℃培养12h,
挑取克隆子,再经液体LB培养12h后,将阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中
培养并提取质粒,抽提质粒酶切验证并进行测序确认,重组质粒pHA03‑csl AC构建成功。
菌落接种于含有硫酸卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。经酶活测定结果可知,该阳性
克隆菌落含有DNA片段插入质粒,即构建完成含硫酸软骨素AC裂解酶基因的重组枯草芽孢
杆菌。
卡那霉素的发酵培养基中,发酵培养2~4h至OD660达到0.6时,加入8g/L的IPTG或乳糖进行
诱导表达24h,发酵液上清液中硫酸软骨素AC裂解酶酶活可达16U/mL。
水浴中煮沸5min,对照管以相同的条件加入灭活的发酵液上清液,在232nm处测定光吸收
值。酶的活力单位U定义为37℃条件下,每分钟催化形成1μmol不饱和双糖所需的酶量。
去上层油脂,降温至50℃,用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5,加入总酶活力为5×10U的木
8
瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,55℃酶解2h;调整pH至7.5,再加入总酶活力为4×10U的中性蛋白
酶和胰蛋白酶,50℃酶解4h;用盐酸调节pH至6.5,升温至75℃,保持2h灭酶。酶解结束后趁
热利用板框过滤机将酶解液过滤,得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后,打入透明质酸
专用层析柱内,保持温度55℃,5BV/h的流速回流吸附3h;然后用0.7%的NaCl水溶液以4BV/
h的流速对层析柱进行除杂处理;再用3%的NaCl水溶液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱
处理,得到含有透明质酸的洗脱液;将洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐;再将脱盐后的透
6
明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中,并加入9×10 U的硫酸软骨素AC裂解酶,
50rpm,30℃条件下进行反应。降解1h后,开启超滤膜系统12‑1(50kDa超滤膜),实现小分子
透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩
系统,将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行除菌处理,再将其通过
三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥,得到无菌小分子透明质酸成品45.3kg,产
品收率为4.53%,平均分子量为45kDa;
去上层油脂,降温至50℃,用6mol/L的NaOH溶液调整pH至8.5,加入总酶活力为5×10U的木
8
瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,55℃酶解2h;调整pH至7.5,再加入总酶活力为2×10U的中性蛋白
酶和胰蛋白酶,50℃酶解4h;用盐酸调节pH至6.5,升温至75℃,保持2h灭酶。酶解结束后趁
热利用板框过滤机将酶解液过滤,得到滤液。将滤液用盐酸调节pH至5.5后,打入透明质酸
专用层析柱内,保持温度55℃,5BV/h的流速回流吸附3h;然后用0.7%的NaCl水溶液以4BV/
h的流速对层析柱进行除杂处理;再用3%的NaCl水溶液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱
处理,得到含有透明质酸的洗脱液;将洗脱液用300kDa的超滤膜进行脱盐;再将脱盐后的透
5
明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中,并加入6×10 U的硫酸软骨素AC裂解酶,
50rpm,30℃条件下进行反应。降解1h后,开启超滤膜系统12‑2(100kDa超滤膜),实现小分子
透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩
系统,将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质酸溶液浓缩进行除菌处理,再将其通过
三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥,得到无菌小分子透明质酸成品3.16kg,产
品收率为1.58%,平均分子量为90kDa。
量为3500L,搅拌转速150rpm,通气量1.0vvm,温度37℃,发酵18~20h。发酵结束后将3000L
发酵液中加入9kg高岭土,搅拌半小时后,利用板框过滤机将发酵液过滤,得到滤液。将滤液
用盐酸调节pH至5.5后,打入透明质酸专用层析柱内,保持温度55℃,5BV/h的流速回流吸附
3h;然后用0.7%的NaCl水溶液以4BV/h的流速对层析柱进行除杂处理;再用3%的NaCl水溶
液以2BV/h的流速对层析柱进行洗脱处理,得到含有透明质酸的洗脱液;将洗脱液用300kDa
的超滤膜进行脱盐;再将脱盐后的透明质酸溶液泵入酶膜反应器的降解反应釜13中,并加
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入3.6×10 U的硫酸软骨素AC裂解酶,50rpm,30℃条件下进行反应。降解1h后,开启超滤膜
系统12‑3(300kDa超滤膜),实现小分子透明质酸与透明质酸的分离。当浓缩釜13中料液体
积是浓缩釜体积的1/3时开启超滤浓缩系统,将小分子透明质酸溶液浓缩。对小分子透明质
酸溶液浓缩进行除菌处理,再将其通过三效浓缩器继续浓缩后用喷雾干燥塔进行干燥,得
到无菌小分子透明质酸成品18.34kg,产品收率为6.11%,平均分子量为280kDa。