一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法

摘要

本发明属于有机合成领域，具体涉及一种N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，所述方法包括如下步骤：以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。本发明提供了一种N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，用于叶酸的质量控制之中，有利于进一步研究N‑对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的产生机理及控制方法。

权利要求

1.一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，包括

以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。

2.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，基于物质的量比例计算，所述叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：有机碱：缩合剂：缩合活化剂：催化剂＝1：1.5-2：1.5-2：2-4：2-4：0.05-0.1。

3.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自DMF、DMSO、甲醇、乙二醇中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为DMF。

5.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，上述有机碱选自三乙胺、N-甲基吗啡啉、N,N-二异丙基乙胺、吡啶中的一种。

6.根据权利要求5所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述有机碱为三乙胺。

7.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，缩合剂选自EDCI、DCC、DIC、CDI、HATU、HBTU、HCTU、TBTU中的一种，缩合活化剂和催化剂各选自HOBT、HOAT、DMAP、4-PPY、NHNI中的一种，。

8.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，使用EDCI为缩合剂、HOBT为缩合活化剂、DMAP为催化剂。

9.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述反应在水浴中进行，水浴温度为25-60℃，反应时间为12-48小时。

10.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述反应进一步包括，使用HPLC跟踪反应，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45-

60℃，浓缩得到固体，冷却后加入纯化水100-500mL，室温搅拌打浆4-12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品。

11.根据权利要求1所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述制备色谱为半制备色谱，色谱柱为C1810μm 100a；半制备检测器波长为280nm，流速为

20ml/min，半制备进样量每次10ml。

12.根据权利要求11所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯水溶解，另加900ml无水甲醇。

13.根据权利要求12所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述制备色谱分离得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的具体方法为：所述N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，流出液减压浓缩后用纯水稀释1-

5倍，再进行半制备色谱分离，用质量分数5-20％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。

14.根据权利要求13所述的一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，其特征在于，所述稀释倍数为2倍，甲醇的质量分数为10％。

说明书

一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于有机合成领域，具体涉及一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法。

背景技术

[0002] 叶酸(folic acid)，维生素B9，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。

[0003] 叶酸成品在进入欧盟市场的时候，应符合欧洲药典EP的质量要求，即叶酸成品中杂质叶酸的含量≤0.5％。EP9.5中对杂质H提出了要求，杂质H即为N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸，化学名为(2S)-2-[4-[(4S)-4-[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)-甲基]氨基]苯甲酰氨基]-4-羧基丁酰胺基]苯甲酰氨基]戊二酸。

[0004] 在叶酸质量研究中，需要得到纯度大于95％的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸对照品，用于叶酸成品中杂质H定性及定量研究。EP9.5于2018年刚颁布，杂质H的制备方法尚未见报道，而此杂质H的标准品也难以购买或者价格昂贵，开发N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的合成制备方法意义深远。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，用于叶酸的质量控制之中。

[0006] 本发明以叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，经缩合剂催化，发生酰胺化反应，得到杂质H，并显著提高H粗品的含量，再经制备色谱法分离，得到纯度98％以上的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。

[0007] 本发明的研究有利于进一步研究N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的产生机理及控制方法，能有效提高叶酸质量控制水平。

[0008] 本发明的具体方案是：

[0009] 一种N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的制备方法，包括

[0010]

[0011] 以叶酸和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料，在有机溶剂中，加入有机碱，在缩合剂、缩合活化剂和催化剂的作用下，经缩合反应生成N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，再经制备色谱分离，得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。

[0012] 基于物质的量比例计算，上述叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：有机碱：缩合剂：缩合活化剂：催化剂＝1：1.5-2：1.5-2：2-4：2-4：0.05-0.1。

[0013] 上述有机溶剂为极性大的有机溶剂，选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙二醇中的一种或多种，优选为DMF。

[0014] 上述有机碱选自三乙胺(TEA)、N-甲基吗啡啉(NMM)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶中的一种，优选为三乙胺。

[0015] 上述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种，缩合活化剂和催化剂各选自1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、4-吡咯烷基吡啶(4-PPY)、2-羟基-3a,4,4,7a-四氢-1H-4,7-甲基异吲哚-1,3(2H)-二酮(NHNI)中的一种，缩合活化剂和催化剂可以选择同一种物质。优选地，使用EDCI为缩合剂、HOBT为缩合活化剂、DMAP为催化剂。

[0016] 上述反应在水浴中进行，水浴温度为25-60℃，反应时间为12-48小时。

[0017] 上述反应进一步包括，使用HPLC跟踪反应，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45-60℃，浓缩得到固体，冷却后加入纯化水100-500mL，室温搅拌打浆4-12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品。

[0018] 上述制备色谱为半制备色谱，色谱柱为C1810μm 100a；半制备检测器波长为280nm，流速为20ml/min，半制备进样量每次10ml。

[0019] 上述半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000ml纯水溶解，另加900ml无水甲醇。

[0020] 上述制备色谱分离得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的具体方法为：所述N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，流出液减压浓缩后用纯水稀释1-5倍，再进行半制备色谱分离，用质量分数5-20％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸。

[0021] 上述稀释倍数优选为2倍，甲醇的质量分数优选为10-20％，再优选为10％。

[0022] 上述浓缩为真空浓缩，浓缩温度45℃、真空度≤-0.09MPa，时间12小时。

[0023] 上述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥温度≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12-36小时，优选为24h。

[0024] 经检测，所述叶酸杂质H，按照欧洲药典叶酸液相分析方法，叶酸保留时间约8.5min，H保留时间约为叶酸的2.5倍，与药典中杂质H的相对保留时间(2.25)基本保持一致。

[0025] 本发明还涉及上述方法制备得到的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸在叶酸质量控制中的应用。

[0026] 与现有技术相比，本发明采用全新的角度，即从制备高纯度N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的角度去研究其合成机理及控制方法，所制备得到的N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸具有高达98％的纯度，适用于对N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的性质和合成机理进行深入的研究过程，为有效提高叶酸质量控制水平奠定了基础。

[0027] 另一方面，本发明在制备N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的过程中，对合成步骤与提纯步骤进行了系统优化，两者有机结合，并通过制备过程参数以及提纯过程操作参数的密切配合，实现了产物高纯化。本发明获得了一整套体系的适用于制备高纯N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸的方法，有重要的现实意义。

附图说明

[0028] 图1为叶酸粗品的HPLC图。

[0029] 图2为实施例1中合成的杂质H粗品的HPLC具体数据图。

[0030] 图3为实施例1中杂质H粗品经制备纯化后的的HPLC具体数据图。

[0031] 图4为实施例1中纯化后的杂质H高分辨质谱图。

[0032] 图5为实施例1中纯化后的杂质H的1H NMR图谱。

[0033] 图6为实施例1中纯化后的杂质H的13C NMR图谱。

[0034] 图7为实施例1中纯化后的杂质H的DEPT135图谱。

具体实施方式

[0035] 下面通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

[0036] 本发明实施例中所用的各种原料和试剂如无特别说明均为市售购买。

[0037] 本发明实施例中，采用北京创新通恒的LC300高效液相色谱仪进行制备，柱子型号C1810μm 100a；半制备检测器波长至280nm，流速至20mL/min；半制备进样量每次10mL。

[0038] 半制备流动相配制方法为：三水合磷酸氢二钾55g，磷酸氢二钾75g，用8000mL纯水溶解，另加900mL无水甲醇。

[0039] 依据EP9.5叶酸检测方法及条件对制备得到的H进行HPLC检测，得到其纯度。HPLC型号为岛津LC-20AT，柱子型号LiChrospher 100RP-8endcapped(5μm)250-4。

[0040] 高分辨质谱仪器型号为AB Sciex Triple TOF 5600+三重四级杆飞行时间质谱仪。测试条件为ESI源，Negative模式。

[0041] 采用Bruker Avance 400型核磁共振波谱仪完成所有的NMR测试，质子共振频率为400.13MHz.实验所用溶剂均为DMSO-d6，TMS为内标物，实验温度均为25℃。

[0042] 实施例1

[0043] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0044] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：1.5：1.5：2：2：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度14.0％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。

[0045] (2)叶酸杂质H的提纯

[0046] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0047] 得到的叶酸杂质H的纯度为98.5％。

[0048] 如图1所示，叶酸粗品种，叶酸的保留时间为9.456min，其含量为98.2％；杂质H的保留时间为23.552min，含量为0.08％；H的相对叶酸的保留实际为2.49，与EP杂质H相对保留时间2.5保持一致。

[0049] 图2、图3分别为合成的杂质H粗品、纯化后H的HPLC图谱。杂质H粗品中，H含量14.0％，经制备纯化后，杂质H含量达到98.5％。

[0050] 如图2所示，叶酸的保留时间为8.990min，其含量为41.5％；杂质H的保留时间为21.79min，含量为14.0％；H的相对叶酸的保留实际为2.42，与EP杂质H相对保留时间2.5基本一致。

[0051] 如图3所示，叶酸的保留时间为8.548min，与EP药典中叶酸保留时间约8.5min基本一致，其含量为0.11％；杂质H的保留时间为19.95min，含量为98.5％；H的相对叶酸的保留实际为2.25，与EP杂质H相对保留时间2.5基本一致。

[0052] 经高分辨质谱检测(图4)，样品H的HRESI-MS负离子质谱图中，在m/z 688.2115处具有较强的离子峰，为样品的[M-H]-，该离子的准确分子式为C31H30N9O10，说明样品的准确分子式为C31H31N9O10，与H的分子式一致。

[0053] 其1H NMR、13C NMR、DEPT135分别见附图5、6、7，数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.68(s,1H),10.37(s,1H),8.64(s,1H),8.50(d,J＝7.6Hz,1H),8.23(d,J＝7.5Hz,1H),
7.84(d,J＝8.4Hz,2H),7.71(s,2H),7.69(s,2H),7.10(s,1H),6.99(s,1H),6.65(d,J＝
8.4Hz,2H),4.54-4.48(m,2H),4.40-4.35(m,2H),2.43-2.27(m,4H),2.11-1.90(m,4H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.93,173.85,173.45,171.29,166.53,166.02,160.94,156.34,
153.98,150.87,148.57,148.50,141.78,129.15,128.38,128.27,127.95,121.17,118.44,
111.19,53.95,51.92,45.91,30.65,30.44,26.78,25.94；DEPT13513C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ148.33,128.90,128.02,118.17,110.93,53.70,51.68,45.65,30.41,30.19,26.53,
25.69.

[0054] 实施例2

[0055] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0056] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：1.5：2：3：3：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间36h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆
4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度10.64％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。

[0057] (2)叶酸杂质H的提纯

[0058] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0059] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.3％。

[0060] 实施例3

[0061] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0062] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mLDMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。

[0063] (2)叶酸杂质H的提纯

[0064] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0065] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.9％。

[0066] 实施例4

[0067] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0068] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，EDCI，HOBT，催化剂DMAP溶于500mL DMF中，加入TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：EDCI：HOBT：DMAP＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间48h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度60℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆8小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.95％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。

[0069] (2)叶酸杂质H的提纯

[0070] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0071] 得到的叶酸杂质H的纯度为96.6％。

[0072] 实施例5

[0073] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0074] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，DCC，HOAT，催化剂4-PPY溶于500mL DMSO中，加入DIPEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：DIPEA：DCC：HOAT：4-PPY＝1：1.5：1.5：2：2：0.05。控制水浴反应温度25℃，反应搅拌时间12h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水400mL，室温搅拌打浆4小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度12.5％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间36小时。

[0075] (2)叶酸杂质H的提纯

[0076] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0077] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.1％。

[0078] 实施例6

[0079] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0080] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，CDI，NHNI，催化剂4-PPY溶于500mL甲醇中，加入碱NMM，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：CDI：NHNI：4-PPY＝1：2：2：4：4：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间18h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水300mL，室温搅拌打浆8小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.6％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0081] (2)叶酸杂质H的提纯

[0082] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0083] 得到的叶酸杂质H的纯度为96.9％。

[0084] 实施例7

[0085] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0086] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HATU，4-PPY，催化剂HOBT溶于500mL乙二醇中，加入碱吡啶，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：CDI：NHNI：4-PPY＝1：1.5：2：3：3：0.05。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间18h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度45℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度12.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0087] (2)叶酸杂质H的提纯

[0088] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0089] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.0％。

[0090] 实施例8

[0091] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0092] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，DIC，DMAP，催化剂NHNI溶于500mL混合溶剂(DMF:DMSO＝1:1)中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：
DIC：DMAP：NHNI＝1：1.5：2：2：2：0.1。控制水浴反应温度50℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水
500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.7％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0093] (2)叶酸杂质H的提纯

[0094] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0095] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.6％。

[0096] 实施例9

[0097] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0098] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱DIPEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：DIC：DMAP：NHNI＝1：1.5：2：3：3：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆10小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.4％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0099] (2)叶酸杂质H的提纯

[0100] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0101] 得到的叶酸杂质H的纯度为96.8％。

[0102] 实施例10

[0103] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0104] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，HCTU，4-PPY，催化剂NHNI溶于500mL混合溶剂(甲醇：乙二醇＝4:1)中，加入碱NMM，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：NMM：HCTU：4-PPY：NHNI＝1：1.5：2：2：2：0.05。控制水浴反应温度30℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度55℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.5％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0105] (2)叶酸杂质H的提纯

[0106] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0107] 得到的叶酸杂质H的纯度为98.2％。

[0108] 实施例11

[0109] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0110] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，TBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：TBTU：DMAP：4-PPY＝1：1.5：2：3：3：0.1。控制水浴反应温度35℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.8％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0111] (2)叶酸杂质H的提纯

[0112] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0113] 得到的叶酸杂质H的纯度为98.0％。

[0114] 实施例12

[0115] (1)叶酸杂质H粗品的合成

[0116] 将叶酸，对氨基苯甲酰谷氨酸，TBTU，DMAP，催化剂4-PPY溶于500mL DMF中，加入碱TEA，其中，基于物质的量比例计算，叶酸：对氨基苯甲酰谷氨酸：TEA：TBTU：DMAP：4-PPY＝1：1.5：2：2：2：0.05。控制水浴反应温度60℃，反应搅拌时间24h。HPLC跟踪，反应完后，减压浓缩料液，控制旋蒸水浴温度50℃，浓缩得到的固体冷却后，加入纯化水500mL，室温搅拌打浆
12小时，过滤，滤饼用纯水洗涤(每次100mL洗涤3次)，干燥即得N-对氨基苯甲酰谷氨酰叶酸粗品，纯度13.3％。所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间24小时。

[0117] (2)叶酸杂质H的提纯

[0118] 叶酸杂质H粗品用氨水溶解，过滤，滤液进半制备色谱分离，每次10ml，收集流出液，合并后减压浓缩，浓缩液用纯水稀释2倍后，再进行半制备色谱，用质量分数10％甲醇洗出，收集流出液，浓缩、干燥得到叶酸杂质H。所述浓缩为真空浓缩，浓缩温度为45℃、真空度≤-0.09MPa，所述冷冻干燥温度为≤-30℃、真空度≤-10Pa、时间12小时。

[0119] 得到的叶酸杂质H的纯度为97.2％。

[0120] 需要说明的是，尽管通过参照本发明的实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。